一种酸敏性多肽及其应用的制作方法

本发明属于药物制剂
技术领域：
，具体涉及一种靶向酸性环境的敏感性多肽及其应用。
背景技术：
：细胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides，CPPs)，也称为蛋白转导域(proteintransductiondomains，PTDs)或膜转运蛋白(membranetransductionpeptides，MTPs)，是一类由不多于30个氨基酸残基组成的小分子多肽，自从1988的HIVTAT发现以来，通过蛋白结构分析衍生，或通过构效关系研究合成不断地发现新的细胞穿膜肽，具有很强的跨膜转运能力，而且能够携带比其分子质量大100倍的外源性大分子(蛋白质或者载体等)进入细胞，是一系列具有高效介导入胞能力的短肽。而将细胞穿膜肽作为配体应用于增强各种载药系统胞内传递的研究也层出不穷。通过在阳离子CPPs上共价结合一段聚阴离子结构(polyanion，PA)，即PA-CPP，能够实现对CPPs正电荷的中和，从而有效抑制CPPs的穿膜活性。为了实现CPPs能够在到达靶组织或病灶部位后被重新激活并发挥作用，研究人员尝试多种途径对PA-CPP进行改造并实现CPPs的靶向性传递，如利用靶部位特异性蛋白酶(MMP等)水解实现PA和CPP的分离，通过光激活，氧化解离，脂键或者酰胺键的水解，或根据靶组织与其它组织在微环境上的差别，这种只有在特定条件下才能发挥穿膜效果的新型CPPs被称为可活化细胞穿膜肽(Activatablecell-penetratingpeptides，ACPPs)。ACPP除了能够对靶细胞发挥靶向穿膜作用之外，相比于CPP由于中和了CPP的正电荷具有使毒性降低的优势。而人体中，由于在生理和病理条件下，均存在酸性微环境，可以作为ACPP的响应条件，主要包括肿瘤、炎症或感染部位、细胞内涵体或溶酶体等。其中，由于肿瘤细胞具有较强的增殖分化能力，肿瘤部位氧供不足，使得肿瘤组织细胞外微环境含有较多乳酸，其细胞外的pH值(6.5～6.8)普遍低于正常组织和血液的pH值(7.2～7.4)。因此，近年来，针对肿瘤微环境的以上特点，利用肿瘤组织这一特殊的微环境构建pH敏感型药物传递系统成为中外学者们的研究热点。技术实现要素：解决的技术问题：本发明的目的是提供一种基于CPPs设计的可逆活化细胞穿膜肽材料并将其与两亲性聚合物偶联制成混合胶束，使得该胶束载体在肿瘤微环境中表现出较高的细胞摄取和膜结合能力。技术方案：一种酸敏性多肽，包括净电荷可逆变化的肽链HX、柔性肽链Y和细胞穿膜肽CPP三部分，其结构为HX-Y-CPP或CPP-Y-HX。进一步地，所述净电荷可逆变化的肽链HX由谷氨酸E或天冬氨酸D的一种或两种与组氨酸H组成。进一步地，所述柔性肽链Y由单一氨基酸或混合氨基酸组成。进一步地，所述细胞穿膜肽CPP为含有正电性氨基酸的肽链。上述酸敏性多肽在纳米靶向递药系统中的应用。一种纳米靶向聚合物胶束递药系统，包括两亲性嵌段共聚物和酸敏性多肽修饰的两亲性嵌段共聚物。进一步地，所述两亲性嵌段共聚物和酸敏性多肽修饰的两亲性嵌段共聚物的摩尔比为99∶1-0.9∶1，优选9∶1。进一步地，所述酸敏性多肽修饰的两亲性嵌段共聚物是将酸敏性多肽与两亲性嵌段共聚物的亲水段进行共价连接。有益效果：增强胶束载体在肿瘤微环境中的细胞摄取和膜结合能力，从而增加胶束载体对肿瘤细胞的细胞毒性，降低对正常组织的毒性。附图说明图1为酸敏感性多肽的作用机制图；图2为实施例1中载紫杉醇的可逆活化细胞穿膜肽修饰的PEG-PLA和聚乙二醇单甲醚-聚乳酸混合胶束(PTX/CPP-HE-PM)的粒径分布图；图3为实施例1中mPEG-PLA胶束(PM)和混合胶束(CPP-HE-PM)在不同pH的缓冲液里的Zeta电位；图4为试验例1中不同浓度的CremophorEL：乙醇＝1∶1(v/v)溶媒、空白mPEG-PLA胶束(PM)和CPP-HE修饰的空白混合胶束(CPP-HE-PM)在不同pH下鼠乳腺癌细胞(4T1)的存活率；图5为试验例1中不同浓度的PTX/PM和PTX/CPP-HE-PM在不同pH下4T1细胞的存活率；图6(a)为试验例1中载香豆素的mPEG-PLA胶束(C6/PM)和CPP-HE修饰的混合胶束(C6/CPP-HE-PM)在不同pH下，摄取时间为2小时，Hela细胞摄取的平均荧光强度。图6(b)为试验例1中载香豆素的mPEG-PLA胶束(C6/PM)和CPP-HE修饰的混合胶束(C6/CPP-HE-PM)在不同pH下，摄取时间为2小时，4T1细胞摄取的平均荧光强度。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。细胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides，CPPs)，也称为蛋白转导域(proteintransductiondomains，PTDs)或膜转运蛋白(membranetransductionpeptides，MTPs)，是一类由不多于30个氨基酸残基组成的小分子多肽，自从1988的HIVTAT发现以来，通过蛋白结构分析衍生，或通过构效关系研究合成不断地发现新的细胞穿膜肽，具有很强的跨膜转运能力，而且能够携带比其分子质量大100倍的外源性大分子(蛋白质或者载体等)进入细胞，是一系列具有高效介导入胞能力的短肽。以其理化性质为基础，细胞穿膜肽可以简单的划分为三类：阳离子细胞穿膜肽、疏水性细胞穿膜肽和两亲性细胞穿膜肽。其中，阳离子细胞穿膜肽中的氨基酸残基主要由精氨酸和赖氨酸组成。两亲性细胞穿膜肽则主要由赖氨酸组成，序列中还分布有亲水或疏水性的其它氨基酸残基，其空间构象为α-螺旋结构。CPP序列中富含精氨酸，有研究表明，胍基是细胞穿膜肽结构中影响CPPs穿膜能力的关键因素。由于寡聚赖氨酸中不含有胍基，因此，含有等电荷的寡聚赖氨酸和寡聚精氨酸相比，寡聚精氨酸具有更强的穿膜能力。然而，细胞穿膜肽的应用受到较大的局限性，一方面，细胞穿膜肽较强的正电性导致其在血液循环中极易与血浆蛋白或调理素结合后被网状内皮系统吞噬；另一方面，细胞穿膜肽作为一种非特异性的“功能分子”，能够非选择性地介导穿透进入所有细胞，这样的特点限制了细胞穿膜肽在全身系统给药中的应用。基于对肽链长度、氨基酸组成及序列、氨基酸侧链pKa、重组多肽等电点、不同pH条件下重组多肽净电荷、多肽序列与其二级结构的相关性等多种因素的考虑，构建了一种酸敏性多肽。包括净电荷可逆变化的肽链HX、柔性肽链Y和细胞穿膜肽CPP三部分，其结构为HX-Y-CPP，其中，1)净电荷可逆变化的肽链HX由组氨酸H与谷氨酸E、天冬氨酸D的一种或其组合组成，优选谷氨酸E；HX序列可以为组氨酸和负电性氨基酸的任意组合和排列，优选组氨酸和负电性氨基酸等比例的重复序列，即(HX)a；HX序列中含有负电性氨基酸的数量应不少于细胞穿膜肽中正电性氨基酸的数量，且不大于细胞穿膜肽中正电性氨基酸的数量的3倍。2)柔性肽链Y由单一氨基酸或混合氨基酸组成；3)细胞穿膜肽CPP为含有正电性氨基酸的多肽链段。如图1所示，HX-Y-CPP中，HX为净电荷可逆变化的肽链，X为带负电的氨基酸，H在正常生理pH条件下不带电，在酸性pH条件下带正电；CPP为含有正电性氨基酸残基的多肽链段；Y为柔性连接将HX与CPP相连，使HX和CPP能够通过静电作用相互吸附。在正常生理pH条件下，即pH＝7.4时，CPP所带正电被HX所带负电荷吸附而呈“发卡结构”，HX-Y-CPP净电荷为零或负，表现为非激活状态；在酸性条件下，即pH≤6.5时，H被质子化干扰HX与CPP静电结合的稳定性，且HX-Y-CPP净电荷变为正或零，导致HX与CPP分离使CPP发挥穿膜作用。而在肿瘤部位被特异性激活而未被肿瘤细胞及时摄取，重新进入血液循环后依然表现为非激活状态，此为可逆活化，有效保证了药物递送系统的特异性和安全性。作为上述的这些细胞穿膜肽CPP，只要能够发挥其介导载体实现高效跨细胞膜转运能力的目的即可，没有特别限定，可以举出：核转录激活子Tat蛋白，Tat-(47-57)(YGRKKRRQRRR)，HIV-1Rev-(34-50)(TRQARRNRRRRWRERQR)，果蝇触角控制基因蛋白，Antp(43-58)(RQIKIYFQNRRMKWKK)，FHV外壳蛋白(35-49)(RRRRNRTRRNRRRVR)，小分子寡聚精氨酸[(R)n]，小分子寡聚赖氨酸[(K)n]，MAP(KLALKLALKALKAALKLA)及其类似物，transportan等。作为上述的柔性肽链Y，只要能够发挥其桥接HX与CPP且不影响HX与CPP相互作用的目的即可，没有特别限定，可以举出：(GGGGS)n，(G)n，KESGSVSSEQLAQFRSLD，EGKSSGSGSESKST，GSAGSAAGSGEF等。本发明的另外一个目的是提供了一种包含酸敏性多肽的纳米靶向递药系统，可以为脂质体、胶束、固体脂质纳米粒、聚合物纳米粒、多肽-药物偶联纳米载体等。VijayA.Sethuraman等制备TAT修饰的PEG-PLA胶束载体，并通过PSD(甲基丙烯酰磺胺二甲氧嘧啶)-b-PEG中的PSD在中性环境下的负电荷与TAT电荷中和，但在酸性环境(6.5-6.0)下不显电性使得TAT发挥穿膜效果。pH敏感性多肽修饰的胶束在pH6.0的细胞摄取量相较pH7.4显著增加，实现主动靶向作用。A.M.Hamilton等将iRGD修饰在纳米粒上，表明修饰了iRGD的包载阿霉素的纳米粒相比水溶性的iRGD能够增加其防止肿瘤转移的效果。S.W.Chung等将阿霉素与四肽DEVD偶联，可减少阿霉素在体内的毒性，并通过筛选不同的敏感性连接键实现肿瘤细胞内部敏感释药发挥作用。上述递药系统可以递送抗癌药物和抗生素等药物，可选自烷化剂、抗生素、植物生物碱、铂类化合物等，具体药物如紫杉醇、多西他赛、去氧鬼臼毒素、阿霉素、吉西他滨、放线菌素D等。具体的，本发明提供了一种两亲性聚合物胶束，包括两亲性嵌段共聚物和酸敏性多肽修饰的两亲性嵌段共聚物。其制备方法是先将两类两亲性嵌段共聚物制成胶束，再采用酸敏性多肽修饰其中一种两亲性嵌段共聚物。在本发明的一个实施例中，是以聚乙二醇单甲醚-聚乳酸共聚物(mPEG-PLA)两亲性载体材料作为主体、加入一定比例的丙烯酸酯-PEG-PLA(acrylate-PEG-PLA)制得胶束，再由巯基与含碳碳双键的丙烯酸酯通过迈克尔加成将acrylate-PEG-PLA与酸敏性多肽(本发明实施例中使用R6G5(HE)10C，以下简称为CPP-HE)共价结合。所得胶束在肿瘤微环境中表现出较高的细胞摄取和膜结合能力，而在肿瘤部位被特异性激活而未被肿瘤细胞及时摄取，重新进入血液循环后依然表现为非激活状态，保证药物递送系统的特异性和安全性。该胶束的制备方法是先以聚乙二醇单甲醚(Methoxypolyethyleneglycol，mPEG)和D，L-丙交酯(D，L-LA)为原料，在无水、无氧、辛酸亚锡催化的条件下反应，通过开环聚合法合成mPEG-PLA；再使用薄膜分散法将mPEG-PLA和acrylate-PEG-PLA制备为混合胶束；然后以可逆活化细胞穿膜肽CPP-HE对PEG-PLA进行修饰，得到包含酸敏性多肽的纳米靶向聚合物胶束递药系统。具体地，采用开环聚合法合成mPEG-PLA：mPEG和D，L-LA的质量比例范围为3∶2-2∶3，优选1∶1；催化剂为辛酸亚锡催化剂加入质量范围为反应物总重的0.8-0.2％，优选0.5％；反应温度范围为140-160℃，优选150℃；氮气保护；反应时间范围为5-10h，优选6h；冷却至室温，产物用相当于反应物重量之和0.1-0.5倍(体积)二氯甲烷溶解，优选0.2倍；用相当于反应物重量之和5-20倍(体积)冰无水乙醚沉淀，优选10倍，减压抽滤，得白色固体。所得产物室温或40℃真空干燥24h，优选室温干燥。采用薄膜分散法制备胶束：溶剂为甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿，优选甲醇；水浴温度范围为35-55℃，优选40℃，旋蒸至溶剂完全除去，加入pH7.5-8.5Hepes缓冲液水化10-30min，优选pH8.0，15min；水化产物用0.22或0.45μm滤膜过滤，优选0.22μm；加入CPP-HE的摩尔量与acrylate-PEG-PLA的比例范围为1.5∶1-1∶1，优选1.2∶1，氮气保护，反应时间12-24h，优选24h。本发明以多种疏水性小分子抗癌药物(如紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素等)为模型，按照上述方法制备载药胶束，载药量为9％至16％。以下实施例所采用的CPP-HE由安徽国肽生物科技有限公司合成；丙烯酸酯-PEG-PLA由上海芃硕生物科技有限公司合成。实施例1mPEG-PLA嵌段共聚物的合成采用开环聚合法合成：取mPEG和DL-LA各5.0g，置于100mL三颈瓶中，缓慢升温至140℃，待物料完全熔融后。加入反应物总重的0.5％辛酸亚锡，磁力搅拌混匀后，真空残留的水分至反应液无气泡产生，升温至150℃，氮气保护下反应6h。冷却至室温后向反应物中加入反应物重量之和0.2倍(体积)二氯甲烷溶解，用相当于反应物重量之和10倍(体积)冰无水乙醚沉淀，减压抽滤，得白色固体。所得产物室温真空干燥24h。载紫杉醇的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸胶束(PTX/PM)，载紫杉醇的可逆活化细胞穿膜肽修饰的PEG-PLA和聚乙二醇单甲醚-聚乳酸混合胶束(PTX/CPP-HE-PM)制备及粒径测定按质量比(1∶9∶1)称取acrylate-PEG-PLA、mPEG-PLA和PTX于茄形瓶中，用适量甲醇溶解，40℃旋蒸至溶剂完全除去，再加入4mLpH8.0Hepes缓冲液水化15min，并用0.22μm滤膜过滤后置于西林瓶中，加入1.2倍acrylate-PEG-PLA摩尔量的CPP-HE，搅拌反应24h得到CPP-HE修饰的紫杉醇聚合物胶束。按质量比(10∶1)称取mPEG-PLA和PTX于茄形瓶中，用适量甲醇溶解，40℃旋蒸至溶剂完全除去，再加入4mLpH8.0Hepes缓冲液水化15min。并用0.22μm滤膜过滤。Malvern激光粒度仪测定PTX/CPP-HE-PM粒径和多分散系数(polydispersityindex，PDI)，结果见图2，CPP-HE修饰的聚合物胶束粒径为25.3±0.4nm，多分散系数为0.10±0.03，粒径分布较好。PM和CPP-HE-PM在不同pH缓冲液里的Zeta电位取PM和CPP-HE-PM溶液适量，以不同pH的缓冲液稀释，采用ZetaPlus电位粒径分析仪测定Zeta电位。结果见图3，普通聚合物胶束PM在不同pH环境中表面都带负电荷，而pH敏感性的CPP-HE-PM在生理条件下，CPP的正电荷被HE的负电荷中和，表现出的电位为负，而在肿瘤的弱酸性微环境下，H被质子化，HE的负电荷减弱，干扰HE与CPP静电结合的稳定性导致HE与CPP分离，使CPP恢复激活状态，在内涵体和溶酶体酸性更强的环境下，质子化作用更强，CPP-HE-PM表面正电荷更强。试验例1胶束体外细胞评价(1)空白胶束毒性评价取对数生长期的4T1细胞以1×105个/孔接种于96孔板中，完全培养液37℃培养24h，移去培养液，每孔加入200μL用不同pH(pH7.4和pH6.5)的不含血清的培养液稀释成不同浓度的CremophorEL：乙醇＝1∶1(v/v)溶媒、空白mPEG-PLA胶束(PM)和CPP-HE修饰的空白混合胶束(CPP-HE-PM)，于37℃孵育48h后，加入20μL的5mg/mL的MTTPBS溶液，37℃孵育4h。弃去上清液，加入150μLDMSO溶解蓝紫色的甲瓒结晶，采用酶标仪于570nm测定吸光度值(OD值)，计算细胞存活率。以不含血清的培养液孵育细胞，相同操作作为对照。结果见图4，紫杉醇的市售制剂为其中主要含有聚氧乙烯蓖麻油和乙醇两种辅料，在250μg/mL以上表现出了一定的细胞毒性，大于1000μg/mL以上，有很强的细胞毒性。而空白PM和空白CPP-HE-PM与的聚氧乙烯蓖麻油和乙醇混合物相比，细胞毒性较小，具有较高的安全性。当胶束浓度在0.5μg/mL～1mg/mL范围内时，空白PM和空白CPP-HE-PM在不同pH下(pH7.4和pH6.5)对4T1细胞生长没有明显毒性，表明，可以排除空白PM和空白CPP-HE-PM在载药细胞毒实验中对4T1细胞毒的干扰。。(2)载药胶束毒性评价取对数生长期的4T1细胞以1×105个/孔接种于96孔板中，完全培养液37℃孵育24h后，移去培养液，每孔加入200μL用不同pH(pH7.4和pH6.5)的不含血清的培养液稀释成不同PTX浓度的PTX/PM和PTX/CPP-HE-PM，于37℃孵育48h后，加入20μL的5mg/mL的MTTPBS溶液。37℃孵育4h后，弃去上清液，加入150μLDMSO溶解蓝紫色的甲瓒结晶，采用酶标仪于570nm测定吸光度，计算细胞存活率。以不含血清的培养液孵育细胞，相同操作作为对照。结果见图5，在0.5μg/mL-30μg/mL的PTX浓度范围内，几乎在所有考察的PTX浓度下，PTX/CPP-HE-PM在pH6.5下对4T1细胞的细胞毒性都显著大于其在pH7.4条件下对4T1细胞的细胞毒性。并且在20μg/mL的PTX浓度以下，PTX/CPP-HE-PM和PTX/PM对4T1细胞的细胞毒性都大于对4T1细胞的细胞毒性，只有在高PTX浓度(20μg/mL和30μg/mL)才能表现出对4T1细胞较强的细胞毒性。而在所用考察的PTX浓度下，PTX/CPP-HE-PM对4T1细胞的细胞毒性都大于PTX/PM对4T1细胞的细胞毒性。与在pH7.4下相比，和PTX/PM在pH6.5下对4T1细胞的细胞毒性都没有提高。表明，pH敏感性的CPP-HE在pH6.5下由于H被质子化干扰HE与CPP静电结合的稳定性导致HE与CPP分离使CPP恢复激活状态，与pH7.4条件下的较强负电荷相比，促进了4T1对PTX/CPP-HE-PM的摄取，增加了PTX/CPP-HE-PM细胞的细胞毒性。并且CPP-HE能够更有效的在细胞内转运PTX，相较于市售制剂和非pH敏感的普通PM，能够在相对低的PTX浓度下，对4T1细胞产生更强的细胞毒性，更有效地杀伤肿瘤细胞。。(3)细胞摄取实验以荧光物质香豆素6(C6)模拟药物，分别制备mPEG-PLA胶束(C6/PM)和CPP-HE修饰的混合胶束(C6/CPP-HE-PM)。取对数生长期的Hela、4T1细胞以5×105个/孔接种于6孔板中，完全培养液37℃培养48h，移去培养基，用PBS(pH7.4)洗3次，每孔加入2mL用不同pH(pH6.0、6.5、7.0和7.5)的不含血清的培养液稀释成一定C6浓度的C6/PM和C6/CPP-HE-PM，于37℃孵育2h后，弃去含制剂的培养液，用4℃PBS洗涤3次，加入500μL胰蛋白酶消化，加入1mL4℃PBS终止消化，轻吹打细胞10次后转移至离心管，再用1mL4℃PBS洗涤6孔板，转移后合并，1000r×5min离心后弃掉上清液，再用1mLPBS洗涤1次，最后加入500uLPBS重悬，用流式细胞仪进行测定分析(Ex＝488nm；Em＝530nm)，计算平均荧光强度，结果见图6(a)、图6(b)，C6/PM在不同pH下两种细胞的摄取量没有显著的差别，而C6/CPP-HE-PM在Hela和4T1两种细胞中的摄取量存在pH依赖性，在pH6.0、6.5、7.0条件下Hela和4T1两种细胞中的摄取量分别是pH7.5的2.65倍、2.15倍、1.47倍和2.92倍、2.38倍1.77倍。表明pH敏感性的CPP-HE-PM在肿瘤弱酸微环境发生电荷翻转，即在正常生理pH条件下，CPP所带正电被HE的负电荷中和，表现为非激活状态，降低聚合物胶束的细胞摄取和膜结合能力；在肿瘤弱酸性微环境中，H被质子化，HE的负电荷减弱，干扰HE与CPP静电结合的稳定性导致HE与CPP分离使CPP恢复激活状态，此时聚合物胶束系统的细胞摄取和膜结合能力均处于较高水平。聚合物胶束表面负电荷变为正电荷，促进了与带负电荷的肿瘤细胞膜表面静电吸附，增加了肿瘤细胞对聚合物胶束的摄取。而非pH敏感的PM表面电荷不随pH的改变而改变，始终为负电荷，在不同pH下，细胞摄取量没有显著的变化。当前第1页1 2 3