一种lunasin‑多串联多肽的制备方法与流程

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种lunasin-多串联多肽的制备方法。

背景技术：

Lunasin是一种含有43个氨基酸的新型多肽，具有抗癌、抗炎及降低胆固醇等生理功效。Lunasin多肽分子量为5kDa。目前，Lunasin多肽的生产方法主要可以通过化学合成法，也可以通过基因工程法。

然而，利用化学合成方法成本较高，成品价格昂贵，不适合大量生产；基因工程法则周期短、成本低，是多肽合成的主要方法之一。中国专利2016101827612公开了“一种重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及活性鉴定方法”，然而由于Lunasin多肽的分子量小，所以重组工程菌lunasin表达量偏低，且纯化过程lunasin多肽损失较大。

因此，本发明提出一种lunasin-多串联多肽的制备方法，从而解决现有的上述问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种lunasin-多串联多肽的制备方法，其通过基因工程的方法，将四个lunasin基因经密码子优化后定向串联；在C端融合组氨酸标签；将得到的基因构建到酵母菌的表达载体中并转化酵母菌；诱导表达串联多肽。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种lunasin-多串联多肽的制备方法，所述制备方法包括：通过基因工程的方法，将多个lunasin基因经密码子优化后定向串联；在C端融合组氨酸标签；将得到的基因构建到酵母菌的表达载体中并转化酵母菌；诱导表达串联多肽。

优选地，上述技术方案中，所述制备方法包括以下步骤：

1)串联多肽的多核苷酸序列设计

根据lunasin氨基酸序列，采用酵母偏爱密码子人工合成lunasin-多串联多肽基因，同时在5’端及3’端引入EcoRI和NotI酶切位点，PCR扩增；

2)重组工程菌的构建

将步骤1)得到的编码lunasin-多串联多肽的完整基因连接到pPIC 9K质粒中；再通过热激转化到大肠杆菌DH5α中培养扩增，提取得到重组表达质粒；

将重组表达质粒pPIC9K-lunasin经Sac I线性化酶切，将经酶切线性化的重组表达质粒与感受态毕赤酵母GS115细胞按比例混合后，进行电击转化获得转化子，将转化子分别接种于MM培养基和MD培养基；经过PCR鉴定及G418高抗性筛选，阳性克隆为重组工程菌GS115/pPIC9K-lunasin；

3)lunasin-多串联多肽的诱导表达及纯化

将步骤2)筛选得到的稳定高产菌株，使用甲醇诱导表达，收集培养基上清，采用TCA沉淀蛋白，将蛋白重悬后利用SDS-PAGE及Western-blot鉴定；当鉴定结果为阳性后，使用镍琼脂糖亲和层析柱进行纯化，得到高纯度lunasin-多串联多肽。

优选地，上述技术方案中，多个lunasin基因为四个lunasin基因。

优选地，上述技术方案中，步骤1)中lunasin氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，lunasin-多串联多肽序列如SEQ ID No.2所示。

优选地，上述技术方案中，步骤2)具体为：

使用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切，将用相同限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切的质粒pPIC 9K与酶切后的PCR产物用T4DNA连接酶连接，热激转化到大肠杆菌DH5α中培养扩增，提取得到重组表达质粒pPIC9K-lunasin；

将重组表达质粒pPIC9K-lunasin经Sac I线性化酶切后，电击转化入感受态毕赤酵母GS115细胞获得转化子，将转化子分别接种于MM培养基和MD培养基，30℃倒置恒温培养2-3d，在MD培养及生长良好而在MM培养基上不生长的菌落，挑取进行PCR鉴定；

经过PCR鉴定及G418高抗性筛选，阳性克隆为重组工程菌GS115/pPIC9K-lunasin。

优选地，上述技术方案中，PCR鉴定使用的载体通用引物如下：

5’AOX引物序列：GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC

3’AOX引物序列：GGA TGT CAG AAT GCC ATT TGC。

优选地，上述技术方案中，步骤3)lunasin-多串联多肽的诱导表达包括：

挑选7个抗生素筛选后的单克隆，于2.5ml YPD液体培养基，30℃，220r培养12h；

配制PH6.0的BMGY培养基，分别接种200ul菌液，30℃，220r培养到OD600为5.0，离心，换成PH 6.0的BMMY培养基，每12h加入0.5％甲醇进行诱导，诱导温度29℃，220rpm诱导表达72h；

摇瓶发酵结束后取样进行SDS-PAGE及Western-blot鉴定。

优选地，上述技术方案中，步骤3)的镍琼脂糖亲和层析柱纯化包括：

取15mL Ni-NTA，10倍柱床体积的Binding Buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min。将上清与柱料混匀，4℃孵育2h；

样品上柱，流速为2mL/min，收集穿透液；

使用10倍柱床体积的Binding Buffer清洗柱子，流速10mL/min；

使用Wash Buffer洗杂，流速5ml/min，收集洗脱液；

使用Elution Buffer洗脱，流速2ml/min，收集洗脱液；

其中，Binding Buffer为20mMTris，pH＝7.4；Wash Buffer为20mMTris，10mM咪唑，pH＝7.4；Elution Buffer为20mMTris，500mM咪唑，pH＝7.4；

通过SDS-PAGE电泳分析后，将500mM咪唑洗脱组分透析到20mMTris，pH＝7.4的透析buffer中，过滤分装，-80℃保存。

优选地，上述技术方案中，步骤3)所述的高纯度lunasin-多串联多肽的纯度大于95％。

本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

本发明通过基因串联法能够利用目的基因两端的酶切位点或者PCR技术实现多拷贝串联，从而提高小分子蛋白或多肽表达量。另外，在重组蛋白末端融合多个组氨酸成串的肽段(组氨酸标签)，凭借其与二价金属离子的螯合作用，可提高重组蛋白的纯化效率，并可使用针对组氨酸标签的抗体来检测该融合蛋白的表达。

本发明首次采用酵母偏爱密码子，合成lunasin-多串联基因片段，并融合组氨酸标签，将其整合进毕赤酵母表达系统制备lunasin-多串联多肽，提高lunasin产量及纯化效率。纯化的lunasin-多串联多肽经HPLC检测，其纯度为95％以上。

附图说明

图1为本发明的构建重组表达质粒SacI线性化PCR图。

图2A为本发明的宿主菌GS115。

图2B为本发明的宿主菌GS115转化后的单克隆。

图3为本发明的阳性克隆PCR鉴定结果。

图4为本发明的诱导表达蛋白SDS-PAGE图。

图5为本发明的诱导表达产物Western-blot图。

图6为本发明的诱导表达产物纯化后SDS-PAGE图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。若本发明未特别指明，实施例均按照常规实验条件以及常规实验手册规定的配方及方法进行。本发明未特别指明的物质均为来源于普通市面。

实施例1串联多肽的多核苷酸序列设计

根据现已知的lunasin多肽氨基酸序列(如SEQ ID No.1所示：SKWQHQQQDSCRKQLQGVNLTPCEKHIMEKIQGRGDDDDDDDDD)，采用酵母偏爱密码子人工合成lunasin-多串联多肽基因，同时在5’端及3’端引入EcoRI和NotI酶切位点。该基因序列设计如下：

GAA TTC TCC AAA TGG CAG CAT CAG CAG GAC AGT TGC AGA AAG CAG CTG CAA GGT GTT AAT CTT ACA CCT TGC GAA AAG CAC ATC ATG GAA AAG ATA CAA GGC AGA GGC GACGAC GAC GAT GAT GAT GAT GAC GAC TCA AAG TGG CAA CAT CAG CAG GAT TCC TGT AGG AAA CAG TTA CAA GGT GTC AAC CTT ACT CCC TGC GAA AAA CAC ATT ATGGAA AAA ATA CAA GGA AGA GGT GAC GAC GAC GAC GAT GAC GAC GAC GAC AGT AAG TGG CAA CAT CAA CAA GAC TCT TGC AGA AAA CAG CTA CAA GGA GTC AAT TTAACC CCC TGC GAA AAA CAT ATC ATG GAA AAA ATA CAG GGA AGA GGT GAT GAT GAT GAC GAC GAT GAT GAC GAT AGT AAA TGG CAA CAT CAG CAA GAT AGT TGC AGAAAG CAA TTG CAG GGC GTG AAT CTA ACG CCA TGC GAG AAG CAC ATC ATG GAG AAG ATT CAA GGC AGG GGA GAC GAC GAT GAT GAT GAC GAC GAC GAT CAC CAT CAC CAT CAC CAT TAA GCG GCC GC(SEQ ID No.2)。

实施例2重组工程菌的构建

为了获得大量的基因，设计一对PCR扩增获得目的基因片段。

设计特异性扩增引物为(SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)：

上游引物：5’-GGAATT CTC CAA ATG GCA GCAC-3’；

下游引物：5’-TTG GCC GCG TCG TCG TCA TCA TC-3’。

PCR条件为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃60s，35个循环，72℃10min。

使用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切，将用相同限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切的质粒pPIC9K与酶切后的PCR产物用T4DNA连接酶连接。

将得到的编码lunasin-多串联多肽的完整基因连接到pPIC 9K质粒后，再通过热激转化到大肠杆菌DH5α中培养扩增，提取得到重组表达质粒pPIC9K-lunasin。

将重组表达质粒pPIC9K-lunasin经Sac I线性化酶切，将经酶切线性化的重组表达质粒与感受态毕赤酵母GS115细胞按比例混合后，进行电击转化获得转化子，将转化子分别接种于MM培养基和MD培养基；经过PCR鉴定及G418高抗性筛选，阳性克隆为重组工程菌GS115/pPIC9K-lunasin。

上述酶切体系为：10*buffer 2uL,EcoR I 0.5uL,Not I 0.5uL,载体10uL/目的基因6uL，ddH₂O补足20uL,37℃反应2h。

上述连接体系为：2*buffer 5uL，载体1uL，目的基因3.5ul，T4连接酶0.5uL，4℃反应过夜。

上述毕赤酵母GS115感受态细胞的制备和转化的方法具体为：

挑取YPD平板上GS115菌株接种进入50ml YPD培养基，30℃，220rpm培养至OD＝1.3-1.5，然后冰浴30min。4℃，1500rpm，离心5min沉淀细胞，于10ml冰冷的无菌去离子水悬浮。4℃，1500rpm，离心5min沉淀细胞，于5ml冰冷的无菌去离子水悬浮。4℃，1500rpm，离心5min沉淀细胞，于2ml冰冷的无菌1M山梨醇悬浮。4℃，1500rpm，离心5min沉淀细胞，于200ul冰冷的无菌1M山梨醇悬浮。分装80ul/管。取8ul线性化的单拷贝质粒加入200ul GS115感受态细胞并轻轻混匀，转入2mm预冷电转杯，冰上放置5min，放入电转仪，电击，电压：1500V，电击时间4.5ms，电击完成后，立即加入1ml 1M预冷的山梨醇，混匀后转移到1.5ml离心管中，30℃，静止1-2h，每100ul涂含500ug/ml G418的MD平板。培养后，将菌用无菌水吹下，稀释1000倍后，再每100ul分别涂含1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、G418的YPD平板，30℃培养36h观察。

上述阳性重组菌PCR鉴定具体为：

使用载体通用引物(SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)

5’AOX引物序列：GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC

3’AOX引物序列：GGA TGT CAG AAT GCC ATT TGC

阳：以pPIC9k-LUNASIN质粒为模板

pPIC9k-LUNASIN转化子分别记为：GS115/pPIC9k-LUNASIN L-1--L-7(L1-7是随机筛选得到的7个菌株)

采用标准PCR体系扩增，各15ul体系。

PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30S；52℃退火1min45S；72℃延伸50S；循环30次；72℃延伸10min；4℃保存。

实施例3lunasin-多串联多肽的诱导表达

挑选7个抗生素筛选后的单克隆，于2.5ml YPD液体培养基，30℃，220r培养12h。配制BMGY(PH＝6.0)培养基，分别接种200ul菌液(包括GS115/pPIC9k空载)，30℃，220r培养到OD600＝5.0，,离心，换成培养基BMMY(PH＝6.0)，每12h加入0.5％甲醇进行诱导，诱导温度29℃，220rpm诱导表达72h。摇瓶发酵结束后取样进行SDS-PAGE。样品制备如下：取600ul菌悬液离心收获上清，取200ul上清，采用生工TCA沉淀试剂盒沉淀蛋白(BSP012)。最终蛋白重悬液体积为20ul，各上样20ul。

12％SDS-PAGE：准备12％的SDS-PAGE，Tris-Gly电泳缓冲液，上样量20μL，浓缩胶80V 20min，分离胶120V 60min，凝胶电泳结束后进行考马斯亮蓝染色20min，脱色。

实施例4lunasin-多串联多肽的Western-blot鉴定

首先制备聚丙烯酰胺凝胶(浓缩胶5％，分离胶12％)。以20μL上样，调节电泳仪条件：80V，30min；120V,60min。电泳结束后，半干法转膜，转膜条件为：250mA,52min。将脱脂奶粉5％浓度溶解于PBS中，37℃震荡1h。加入His标签一抗，震荡60min。PBS清洗后，加入二抗，震荡60min。最后使用TMB显色。

制胶：制备聚丙烯酰胺凝胶：浓缩胶5％，分离胶12％。

制样：上样量：20μl。

电泳：浓缩胶80V，30min；分离胶120V，60min。

转膜：湿转，250mA 52min。

封闭：5％的脱脂奶粉，37℃缓慢振荡1h。

孵育一抗：一抗为兔抗his标签，抗体公司：Sangon Biotech，编号：D110002，1:500稀释，37℃缓慢振荡60min。

孵育二抗：二抗为羊抗兔，抗体公司：Sangon Biotech，编号：D110058，1:8000稀释，37℃缓慢振荡60min。

显色：TMB显色。

实施例5lunasin-多串联多肽的纯化

根据小试表达结果，培养基BMMY，甲醇诱导浓度0.5％，发酵温度29℃，接种量为1.5％，220rpm诱导表达72h。摇瓶培养1L进行纯化，8000rpm离心30min，收集上清透析到20mMTris，pH＝7.4，准备做镍柱亲和层析。

镍柱亲和层析步骤为：

取15mLNi-NTA，用10倍柱床体积的Binding Buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min。将上清与柱料混匀，4℃孵育2h。

样品上柱，流速为2mL/min，收集穿透液。

使用10倍柱床体积的Binding Buffer清洗柱子，流速10mL/min。

使用Wash Buffer洗杂，流速5ml/min，收集洗脱液。

使用Elution Buffer洗脱，流速2ml/min，收集洗脱液。

其中：Binding Buffer(20mMTris，pH＝7.4)

Wash Buffer(20mMTris，10mM咪唑，pH＝7.4)

Elution Buffer(20mMTris，500mM咪唑，pH＝7.4)

通过SDS-PAGE电泳分析后，将500mM咪唑洗脱组分透析到20mMTris，pH＝7.4的透析buffer中。

过滤分装，-80℃保存。

纯化的lunasin-多串联多肽经HPLC检测，其纯度为95％以上。

HPLC检测条件为：分离柱为C18(4.6mm*250mm，5um)，检测器为UV检测器，检测波长为215nm，流速为1mL/min，A相0.1％三氟乙酸水溶液，B相为0.1％三氟乙酸乙腈，线性梯度：B相15％～35％，20min。

本发明首次采用酵母偏爱密码子，合成lunasin-多串联基因片段，并融合组氨酸标签，将其整合进毕赤酵母表达系统制备lunasin-多串联多肽，提高lunasin产量及纯化效率。纯化的lunasin-多串联多肽经HPLC检测，其纯度为95％以上。

虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。