一种lunasin‑多串联多肽的制备方法与流程

文档序号:12639605阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种lunasin-多串联多肽的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:通过基因工程的方法,将多个lunasin基因经密码子优化后定向串联;在C端融合组氨酸标签;将得到的基因构建到酵母菌的表达载体中并转化酵母菌;诱导表达串联多肽。

2.根据权利要求1所述的lunasin-多串联多肽的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:

1)串联多肽的多核苷酸序列设计

根据lunasin氨基酸序列,采用酵母偏爱密码子人工合成lunasin-多串联多肽基因,同时在5’端及3’端引入EcoRI和NotI酶切位点;

2)重组工程菌的构建

将步骤1)得到的编码lunasin-多串联多肽的完整基因连接到pPIC 9K质粒中;再通过热激转化到大肠杆菌DH5α中培养扩增,提取得到重组表达质粒;

将重组表达质粒pPIC9K-lunasin经Sac I线性化酶切,将经酶切线性化的重组表达质粒与感受态毕赤酵母GS115细胞按比例混合后,进行电击转化获得转化子,将转化子分别接种于MM培养基和MD培养基;经PCR鉴定及G418高抗性筛选,阳性克隆为重组工程菌GS115/pPIC9K-lunasin;

3)lunasin-多串联多肽的诱导表达及纯化

将步骤2)筛选得到的稳定高产菌株,使用甲醇诱导表达,收集培养基上清,采用TCA沉淀蛋白,将蛋白重悬后利用SDS-PAGE及Western-blot鉴定;当鉴定结果为阳性后,使用镍琼脂糖亲和层析柱进行纯化,得到高纯度lunasin-多串联多肽。

3.根据权利要求1所述的lunasin-多串联多肽的制备方法,其特征在于,多个lunasin基因为四个lunasin基因。

4.根据权利要求2所述的lunasin-多串联多肽的制备方法,其特征在于,步骤1)中lunasin多肽氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

5.根据权利要求2所述的lunasin-多串联多肽的制备方法,其特征在于,步骤1)中lunasin-多串联多肽序列如SEQ ID No.2所示。

6.根据权利要求2所述的lunasin-多串联多肽的制备方法,其特征在于,步骤2)具体为:

使用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切,将用相同限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切的质粒pPIC 9K与酶切后的PCR产物用T4DNA连接酶连接,热激转化到大肠杆菌DH5α中培养扩增,提取得到重组表达质粒pPIC9K-lunasin;

将重组表达质粒pPIC9K-lunasin经Sac I线性化酶切后,电击转化入感受态毕赤酵母GS115细胞获得转化子,将转化子分别接种于MM培养基和MD培养基,30℃倒置恒温培养2-3d,在MD培养及生长良好而在MM培养基上不生长的菌落,挑取进行PCR鉴定;

经过PCR鉴定及G418高抗性筛选,阳性克隆为重组工程菌GS115/pPIC9K-lunasin。

7.根据权利要求2或5所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法,其特征在于,PCR鉴定使用的载体通用引物如下:

5’AOX引物序列:GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC;

3’AOX引物序列:GGA TGT CAG AAT GCC ATT TGC。

8.根据权利要求2所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法,其特征在于,步骤3)lunasin-多串联多肽的诱导表达包括:

挑选7个抗生素筛选后的单克隆,于2.5ml YPD液体培养基,30℃,220r培养12h;

配制PH6.0的BMGY培养基,分别接种200ul菌液,30℃,220r培养到OD600为5.0,离心,换成PH 6.0的BMMY培养基,每12h加入0.5%甲醇进行诱导,诱导温度29℃,220rpm诱导表达72h;

摇瓶发酵结束后取样进行SDS-PAGE及Western-blot鉴定。

9.根据权利要求2所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法,其特征在于,步骤3)的镍琼脂糖亲和层析柱纯化包括:

取15mL Ni-NTA,10倍柱床体积的Binding Buffer清洗平衡柱子,流速5mL/min。将上清与柱料混匀,4℃孵育2h;

样品上柱,流速为2mL/min,收集穿透液;

使用10倍柱床体积的Binding Buffer清洗柱子,流速10mL/min;

使用Wash Buffer洗杂,流速5ml/min,收集洗脱液;

使用Elution Buffer洗脱,流速2ml/min,收集洗脱液;

其中,Binding Buffer为20mMTris,pH=7.4;Wash Buffer为20mMTris,10mM咪唑,pH=7.4;Elution Buffer为20mMTris,500mM咪唑,pH=7.4;

通过SDS-PAGE电泳分析后,将500mM咪唑洗脱组分透析到20mMTris,pH=7.4的透析buffer中,过滤分装,-80℃保存。

10.根据权利要求2所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法,其特征在于,步骤3)所述的高纯度lunasin-多串联多肽的纯度大于95%。

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