一种人IL1RAP特异性CAR及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种嵌合受体，尤其涉及一种人IL1RAP特异性CAR及其应用。

背景技术：

慢性髓系白血病(Chronic Myelogenous Leukemia,CML)是一种发生在多能造血干细胞上的恶性骨髓增生性疾病，约占白血病的20％，以9号和22号染色体易位t(9；22)(q34；q11)形成的费城染色体(Ph)为特征。该易位形成一种新的融合基因BCR-ABL，此基因编码的融合蛋白p210或p190具有激活的酪氨酸激酶活性，导致髓系造血的异常克隆性增殖，是CML发生发展的根本原因，也是治疗CML的重要靶点。以伊马替尼为代表的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)，通过抑制BCR-ABL自身磷酸化和底物磷酸化而抑制细胞增殖和诱导凋亡，现已成为CML患者的一线治疗药物。尽管该药具有良好的疗效，但其对静息状态的白血病干细胞(leukemia stem cell,LSC)无效，使患者易产生耐药性及停药后复发，且存在部分患者原发耐药及可继发骨病等重大缺陷，导致其临床应用效果仍不能令人满意。因此，有效清除LSC可能在根本上改变CML的治疗现况，是当前治疗CML亟待解决的问题。

LSC自从被发现后就成为研究的热点，人们试图寻找到区分LSC和造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)的表面标志。IL-1受体辅助蛋白(IL-1receptor accessory protein,IL1RAP)是Toll-like受体超家族的一名成员，是IL-1RⅠ的共受体。IL1RAP基因位于人3号染色体q28，位于小鼠的16号染色体，编码570个氨基酸。RNA不同的剪切形式可形成膜型IL1RAP和可溶型IL1RAP两种形式，膜型IL1RAP是IL-1受体复合物的重要组成部分。最近研究表明，IL1RAP蛋白在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)病人的LSC表面过表达，且IL1RAP表达水平和AML的临床预后密切相关，沉默IL1RAP可降低AML细胞克隆集落形成，促进细胞凋亡。2010年Jaras等研究发现，IL1RAP在CML病人的LSC上表达显著升高，但在CD34⁺CD38^-的正常HSC上无表达或仅低表达。而在几乎所有正常的造血干细胞和成熟的各个细胞亚群上，IL1RAP的表达均为阴性或弱阳性。此外，研究表明胚胎期过度的IL-1/IL-1R1/IL1RAP信号限制HSC向髓系细胞正常分化，阻断IL1RAP则切断白血病细胞对外源和自分泌IL-1的利用，使白血病细胞增殖率、克隆形成率、克隆刺激活性明显下降。综上可见，在CML中IL1RAP是区分LSC和HSC特异的细胞表面标志，能诱导细胞免疫和体液免疫应答。针对IL1RAP设计药物或者疫苗，可避免正常组织损伤或自身免疫病。

在白血病的治疗上，应用抗体已很普遍。直接作用于CD20单抗的使用，是通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)杀伤白血病B淋巴细胞。最新研究表明，用IL1RAP单克隆抗体可特异性识别IL1RAP⁺的白血病细胞，并能杀伤IL1RAP⁺的白血病细胞系及CML患者体内的LSC。然而，体液中存在的可溶性IL1RAP与IL1RAP抗体结合，导致IL1RAP抗体浓度降低而达不到治疗效果。应用IL1RAP抗体需要不间断注射治疗，病人依从性较差。此外，抗IL1RAP抗体对机体肿瘤细胞无免疫监视功能，不能及时发现、有效杀伤新产生的LSC。鉴于此，寻求一种以IL1RAP为靶点治疗CML的新策略势在必行。

肿瘤的免疫细胞治疗及抗原特异性细胞疫苗的应用，为肿瘤治疗点亮了新的希望。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)的出现，是人类在与肿瘤斗争中具有里程碑意义的事件。CAR是将抗体对肿瘤抗原的高度亲和性与T淋巴细胞的杀伤作用相结合，利用基因工程技术构建的嵌合型人工T细胞受体。CAR-T细胞包含识别肿瘤相关抗原的单链抗体、共刺激分子和T细胞的活化CD3ζ链，可通过非MHC限制性途径直接杀伤肿瘤细胞。目前，针对乳腺癌抗原ERBB2、结直肠癌抗原CEA和卵巢癌抗原FBP的CAR-T细胞疫苗的功能已分别在动物模型中得到证实。人CAR-T细胞疫苗作用的发挥，首次在含有人CD19抗原的Burkitt淋巴瘤模型中得到证实。2011年N Engl J Med杂志报道，采用包含B细胞特异性抗原CD19、共刺激受体CD137和CD3ζ信号区域的CAR，过继输入治疗慢性淋巴细胞白血病患者，已获得持续缓解长达一年以上的良好疗效。

另有研究发现，CAR-T细胞输入到慢性淋巴细胞白血病患者体内，不但可以发挥杀伤白血病细胞的作用，而且可在体内形成长寿的抗原特异性记忆T细胞，从而及时清除新生的白血病细胞。因此，IL1RAP特异性CAR-T细胞疫苗不但能避免IL1RAP抗体的应用缺陷，而且具有形成记忆性细胞的特有优势，在CML的治疗中具有广阔的应用前景。该技术采用CD28分子作为CAR共刺激分子，该方法制得的IL1RAP特异性CAR病毒转染T细胞后T细胞活化率不高，因而降低了其在体内的抗肿瘤能力。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够提高IL1RAP特异性CAR病毒转染T细胞后T细胞活化率，增强其对肿瘤细胞的杀伤能力的受体，本发明提供了一种人IL1RAP特异性CAR及其应用。

技术方案：一种人IL1RAP特异性CAR，所述CAR由IL1RAP特异性单链抗体scFV、共刺激分子和T细胞的活化CD3ζ链组成，其中scFV包含IL1RAP单克隆抗体McAb重链、轻链的可变区基因片段，共刺激分子为CD137。

所述IL1RAP的全称为IL1受体辅助蛋白(IL-1receptor accessory protein,IL1RAP)；CAR的全称为嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)。

优选的，所述scFV的重链、轻链可变区片段的氨基酸序列为SEQ ID NO:1～2，核苷酸序列为SEQ ID NO:3～4。

优选的，所述IL1RAP特异性CAR的核苷酸序列为SEQ ID NO:5。

优选的，所述IL1RAP特异性CAR的载体为LV-Lac。

优选的，所述IL1RAP特异性CAR的宿主菌为分泌鼠抗人IL1RAP McAb的杂交瘤细胞株10D8A7。

优选的，所述IL1RAP特异性CAR的靶细胞为KU812。

上述人IL1RAP特异性CAR在制备IL1RAP特异性CAR-T细胞疫苗中的应用。

有益效果：(1)本发明所述人IL1RAP特异性CAR引入CD137协同共刺激分子，提高了IL1RAP特异性CAR病毒转染T细胞后T细胞活化率，增强其对肿瘤细胞的杀伤能力；(2)本发明所述IL1RAP特异性CAR-T细胞疫苗不仅可以发挥杀伤白血病细胞的作用，而且可在体内形成长寿的抗原特异性记忆T细胞，从而及时清除新生的白血病细胞。

附图说明

图1.杂交瘤细胞总RNA及抗人IL1RAP单抗V_H、V_L片段PCR电泳图

A:DNA marker MarkerⅢ；B:M,DNA marker MarkerⅢ；lane R1,10D8A7细胞的总RNA；C:M,DNA marker MarkerⅢ；lane 1,10D8A7分泌抗体的V_H片段；lane 2,10D8A7分泌抗体的V_L片段。

图2.CAR及表达载体模式图

其中，A:CAR包括抗人IL1RAP单抗的V_H和V_L片段(由(G4S)3linker连接)、ICD(CD8α跨膜段-CD137胞内段-TCRζ链)、hCD8αSignal peptide、Stop codon、BamHI、SalI双酶切位点；B:LV-10D8A7scFv–ICD模式图。

图3.重组质粒BamHI/SalI双酶切电泳图

其中，lane 1-3:LV-10D8A7scFv-ICD重组质粒的BamHI/SalI双酶切产物(6670bp和1347bp)；lane 7:1kb Marker。

图4.三质粒包装系统转染293FT细胞的明场(A)和荧光(B)照片(×100)

图5.慢病毒感染CD3⁺T细胞的明场(A)和荧光(B)照片(×100)

图6.白血病细胞系细胞表面IL1RAP蛋白的表达图

其中，方框中所标数值为IL1RAP⁺细胞的百分比。

图7.CAR-T细胞对KU812细胞凋亡的影响图

包括*P<0.05vs BC组和LV-Gene组。

图8.流式细胞术检测CAR-T细胞对KU812细胞凋亡的影响

其中，A:CAR-T细胞群(R2)和KU812细胞群(R1)的设门示例图；B:BC组；C:LV-Ctrl组；D:LV-Gene组；图中所标数值为KU812晚期凋亡和早期凋亡细胞的百分比。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，如Sambrook等人所著《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中的条件进行操作，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1 V_H和V_L基因的克隆与鉴定

V_H基因是指抗体重链的可变区基因，V_L基因是指抗体轻链的可变区基因，V_H基因与V_L基因通过Linker连接后，形成scFv。V_H和V_L基因编码的抗体V_H和V_L片段是特异性识别抗原并与之结合的关键部位，因此克隆并鉴定特异性识别人IL1RAP蛋白的抗体V_H和V_L基因是首要步骤。

采用Trizol(购自Invitrogen)试剂法提取10D8A7杂交瘤细胞总RNA，对提取的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1中B所示。

用逆转录酶SuperScriptTMⅢ(购自Invitrogen)逆转录合成cDNA第一链，保存于-20℃备用。

以杂交瘤细胞cDNA为模板，按GenScript公司RACE标准操作指南扩增抗体V_H和V_L基因片段。特异性引物(由GenScript公司合成)：P42(10D8A7)重链上游引物SEQ ID NO:6：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'，下游引物SEQ ID NO:75'-CAGGGGCCAGTGGATAGACAGATGG-3'，轻链上游引物SEQ ID NO:85'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'，下游引物SEQ ID NO:95'-GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3'。

反应条件：94℃变性1rnin，58℃退火1rnin，72℃延伸1.5min，共30个循环，最后72℃保温10min。取5μL PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。结果如图1中C所示，

采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Omega公司)纯化回收PCR扩增产物，双酶切后克隆至载体pMD18T上(购自GenScript公司)，命名为pMD18-10D8A7 V_H及pMD18-10D8A7 V_L重组质粒。上述质粒分别转染大肠杆菌DH5α，用蓝白斑筛选阳性克隆并对V_H和V_L片段进行测序鉴定，测序结果与序列完全相符。

实施例2抗人IL1RAP scFv的构建

分别以pMD18-10D8A7V_H和pMD18-10D8A7V_L序列为模板，扩增V_H和V_L基因，通过overlap extension PCR扩增并连接为抗人IL1RAP scFv，命名为10D8A7scFv。引物序列为SEQ ID NO:6～9。

反应条件：94℃变性1rnin，58℃退火1rnin，72℃延伸1.5min，共30个循环，最后72℃保温10min。

分别提取抗人ILlRAP杂交瘤细胞的总RNA，并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。上面2个条带明亮、清晰、条带锐利,且第1个条带(28S)亮度约为第2个条(18S)亮度的2倍，最下面1个条带(5S)最淡，符合总RNA的特征。由杂交瘤细胞系总RNA扩增得到2种抗人ILlRAP抗体的VH和VL基因片段。琼脂糖凝胶电泳结果如图1C，由图1C可见获得的VH和VL基因片段长度均在400bp左右.进一步对目的基因测序结果显示,由10D8A7细胞系获得的VH基因全长423bp，可编码141个氨基酸，VL基因全长381bp，可编码127个氨基酸。电泳结果见图lB，由上至下可见3个条带，分别为28S、18S和5S rRNA由10D8A7细胞系获得的V_H基因全长423bp，可编码141个氨基酸，V_L基因全长381bp，可编码127个氨基酸。将扩增获得的包含识别IL1RAP的V_H和V_L片段的scFv进行基因测序，结果表明IL1RAP scFv测序结果准确，连接并构建抗人IL1RAP scFv成功。

实施例3抗人IL1RAP CAR稳定表达质粒的构建与鉴定

参考Uherek C等人的研究设计CAR的基因序列，合成ICD，包括CD8α跨膜段-CD137胞内段-TCRζ链，如图2中A所示，CAR由抗人IL1RAP抗体scFv、CD8α跨膜段、CD137胞内段及TCRζ链连接而成，在序列的两端分别引入BamHI和SalI限制性酶切位点，在BamHI位点后引入hCD8αSignal peptide，在SalI位点前引入Stop codon。

将CAR连入LV-Lac载体，连接产物模式如图2中B所示。将连接产物转化感受态细胞DH5α，涂布LB同体培养基(含150μg/mL氨苄青霉素)平板于37℃培养16h，挑取单克隆菌落于LB培养基(含150μg/mL氨苄青霉素)，37℃摇床剧烈摇菌培养16-18h，小量提取质粒，命名为LV-10D8A7scFv-ICD，BamHI和SalI双酶切，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳鉴定目的片段是否插入，结果如图3所示。取PCR鉴定正确的质粒送GenScript公司测序。

实施例4重组慢病毒的包装和浓缩

(1)转染前1天，用胰酶消化对数生长期的293FT细胞，调整细胞密度为1.2×10⁶/mL，接种于多聚赖氨酸(Sigma公司)处理后的100mm细胞培养皿，37℃、5％CO₂培养箱内培养，待细胞密度达70％～80％时进行转染。

(2)将转移质粒12μg、psPAX2 8μg，pMD2.G 4μg以1.5mL Opti-MEM培养基稀释；50μL Lipofectamine 2000以1.5mL Opti-MEM培养基稀释；孵育5min后将稀释后的质粒与Lipofectamine 2000充分混匀，室温孵育25min。

(3)将孵育后的质粒与Lipofectamine2000混和物加入细胞，轻轻混匀；37℃、5％CO₂培养6h后以含2％FBS的H-DMEM全量换液，继续培养42h；

(4)分别观察培养24h、48h和72h后的GFP表达情况，荧光显微镜下可观察到GFP表达情况，GFP⁺细胞率＞85％，如图4所示。分别收集转染后48h和72h(转染即可为0小时计起)的293FT细胞上清液；以0.45μm滤器过滤上清液于40mL超速离心管中；以DMEM培养基配平后4℃70000g离心2h；弃上清，4℃静置4h，以总量为0.5mL的Opti-MEM培养基重悬病毒颗粒；-80℃保存备用。

实施例5慢病毒滴度测定

(1)测定前1天，293FT细胞铺板，96孔板，每孔加4×10⁴个细胞，体积为100μL。

(2)取8个无菌EP管，每管中加入90μL的无血清培养基。取待测病毒原液10μL加入第一管中，混匀后，取10μL加入第二管中。继续相同的操作直到最后一管。

(3)96孔板中每孔吸去90μL培养基，丢弃。加入90μL稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养24h，加入完全培养基100μL。

(4)4天后，观察荧光表达情况：荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。病毒滴度公式为：病毒滴度＝(GFP阳性细胞个数×稀释倍数)/mL。两种病毒滴度分别为LV-10D8A7：(2.06±0.67)×10⁸TU/mL；空载体LV-Ctrl：(8.03±0.18)×10⁸TU/mL。

实施例6 IL1RAP特异性CAR-T细胞疫苗的制备

(1)人原代CD3⁺T细胞分离

采集健康志愿者外周血15mL，用等量Ficoll-Hypaque(购自GE Healthcare公司)离心(400g，30min)，吸取中间层，分离得到单个核细胞悬液，PBS洗两遍(800g，10min)；弃上清，按每10⁷个细胞加入100μL PBS，10μL Ab-PE(human CD19antibodies、PE-Mouse Anti-Human CD56、PE-Mouse Anti-Human CD33)(购自BD Biosciences公司)混匀，4℃避光孵育10min；按每10⁷个细胞加入PBS 1-2mL，300g离心10min 4℃；弃上清，按每10⁷个细胞加入80μL PBS重悬，加20μL Anti-PE磁珠(德国美天旎公司)，混匀，4℃避光孵育15min；PBS洗细胞；细胞悬液由分选柱分选。

(2)CD3⁺T细胞的活化

以1×10⁶/mL的密度将CD3⁺T细胞接种于固相包被抗CD3和CD28抗体(OKT3、CD28.2)，终浓度为5μg/mL(购自eBioscience公司)的RPMI1640培养液(购自美国GIBCO公司)中，培养48～72h。

(3)慢病毒感染CD3⁺T细胞

以感染复数(MOI)为20的病毒液(LV-Gene及LV-Ctrl)感染活化后的CD3⁺T细胞，并加入终浓度为8μg/mL的Polybrene(德国Fluke公司)促进病毒吸附，置37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后再次加入等量病毒液。重复感染24h后更换新鲜10％FBS的RPMI 1640培养液，继续培养。如图5所示，荧光镜下可见绿色荧光，且随着时间推移，48h、72h、96h荧光逐渐增强，GFP阳性率达30％-70％。

上述实验分3组：空白对照组BC(正常CD3⁺T细胞)、空载体对照组LV-Ctrl(CAR^--T细胞)、实验组LV-Gene(CAR⁺-T细胞)。

实施例7IL1RAP特异性CAR-T细胞疫苗的功能鉴定

1.白血病细胞系细胞表面表达IL1RAP蛋白的检测

(1)收集KU812、K562、SUP-B15细胞各1×10⁶个，1×PBS洗2次。

(2)用100μL 1×PBS重悬细胞，加2μL anti-hIL-1RAcP-PE(美国R&D公司)，室温避光孵育15min，2mL PBS洗1次。

(3)200μL 1×PBS重悬后流式细胞术检测。

流式检测结果显示，SUP-B15细胞表面基本检测不到IL1RAP表达量，K562细胞表达低水平的IL1RAP，而KU812细胞表面高表达IL1RAP蛋白，如图6所示。因此，在后续IL1RAP特异性CAR-T细胞疫苗杀伤实验中，我们选择KU812细胞作为靶细胞。

2.CCK-8法检测CAR-T细胞对KU812细胞增殖的影响

(1)取上述3组活化后的CD3⁺T细胞(正常CD3⁺T细胞、CAR^--T细胞、CAR⁺-T细胞)及KU812细胞(各1×10⁴个)，加入96孔板中，每孔加入100μL培养基。

(2)效靶细胞共培养24h后，向各孔中加入10μL CCK-8溶液(购自日本同仁化学研究所)，每组设3个复孔；同时设仅加培养基及CCK-8的空白对照孔。

(3)37℃，5％CO₂细胞培养箱内孵育4h后酶标仪450nm处测OD值。

如图7，CCK-8法检测结果显示，LV-Gene组OD值(0.23±0.06)显著低于BC组(0.54±0.16)和LV-Ctrl组(0.48±0.12)，差异具有统计学意义(P<0.05)；而LV-Ctrl组OD值虽低于BC组，但差异无统计学意义。提示CAR⁺-T细胞对KU812细胞有杀伤作用。

3.流式细胞术检测KU812细胞凋亡

(1)取上述3组活化后的CD3⁺T细胞(正常CD3⁺T细胞、CAR^--T细胞、CAR⁺-T细胞)及KU812细胞(1:1)，将细胞悬液调整密度为2×10⁶/mL，加入24孔板中共培养24h后，1×PBS洗一次(800g离心3min)，弃上清后，加入1mL 1×缓冲液洗一次。

(2)上机管中分别加入各组细胞悬液100μL，加入5μL Annexin V(购自eBioscience公司)，轻轻混匀，避光孵育15min。

(3)1×缓冲液洗一次，弃上清，加入200μL 1×缓冲液重悬，加入7-AAD(eBioscience公司)5μL，避光孵育10min，上机检测。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限为正常细胞(AnnexinV^-/7-AAD^-)；右下象限为早期凋亡细胞(AnnexinV⁺/7-AAD^-)；右上象限为晚期凋亡细胞(AnnexinV⁺/7-AAD⁺)。

如图8，AnnexinV/7-AAD标记流式细胞术检测显示，与BC组((9.26±1.30)％)相比，LV-Ctrl组早期凋亡细胞比例((11.16±1.27)％)无明显变化；LV-Gene组早期凋亡细胞比例((36.56±3.17)％)显著增高，与BC组及LV-Ctrl组相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)。然而，三组间晚期凋亡细胞比例无显著差异。上述结果说明，CAR⁺-T细胞可表达识别IL1RAP蛋白的抗体，且能够有效结合靶细胞表面的IL1RAP蛋白，进而对IL1RAP阳性的细胞起到杀伤作用。