多肽、脂蛋白样纳米粒子及其应用的制作方法

本发明具体涉及一种螺旋-环-螺旋结构多肽、基于螺旋-环-螺旋结构多肽的脂蛋白样纳米粒子及其作为载药系统的应用，属于纳米生物
技术领域：
。
背景技术：
：在药物运输领域，脂质体由于其生物相容性好，毒性小，缓释等优点，被广泛用于细胞毒性药物、基因、蛋白质等物质的输送。纳米级别的脂质体易穿透肿瘤组织的脉管系统和细胞间隙，从而大大促进药物在肿瘤组织的运输扩散。然而脂质体的粒径越小，表面张力越大，易导致脂质体的融合，造成结构的崩塌和内容物的释放。另外，脂质体非特异的与血清蛋白，细胞，组织等结合，引起较大的副作用。为了解决这些问题，各种表面修饰层出不穷，其中多聚物修饰最为常见。多聚物(例如聚乙二醇、泊洛沙姆，葡聚糖和聚乙烯醇等)可以与脂质共价交联，在脂质体表面形成亲水保护层，降低表面张力和非特异性的吸附。另外在多聚物保护的基础上脂质体表面可以修饰靶向元件，进一步的提高脂质体的特异性。但是这些修饰仍然存在一些问题，例如聚乙二醇在体内无法降解，累积之后产生细胞毒性和免疫反应，另外，靶向元件的功能有可能被临近的聚乙二醇分子掩盖，造成功能的丢失。总体来说，脂质体的表面修饰涉及共价交联和混合制备的过程，步骤复杂，可控性差。在生物体内，存在多种由脂质和蛋白组成的天然囊泡结构，例如突触囊泡，胞外膜泡和脂蛋白等。这些结构是天然的运输载体，在体内运输疏水或亲水物质。在这些结构中，蛋白质是必不可少的组成部分，它们不仅用于脂质分子的稳定和表面张力的控制，而且可以提供特定的靶向识别功能。目前研究人员提取天然膜结构(例如胞内体、细菌外膜小泡和红细胞等)作为药物运输的载体。这类载体具有复杂精细的天然结构，生物相容性好，但是造价比较高，并且根据不同的目标进行修饰较困难。高密度脂蛋白是体内存在的一种最小且最紧密的一种天然纳米粒子，主要用于胆固醇的运输。高密度脂蛋白主要由载脂蛋白和磷脂组成。在载脂蛋白中，载脂蛋白A-I(ApoA-I)占主体地位，约为70％。ApoA-I由243个氨基酸组成，形成一系列高度同源的双亲螺旋结构。此蛋白与脂质结合，决定高密度脂蛋白的粒径和形貌。为了在体外构建高密度脂蛋白纳米粒子，进行药物输送，研究人员从活体内提取或者体外重组表达ApoA-I蛋白。然而， ApoA-I蛋白合成成本较高，并且难以进行功能化修饰，从而导致高密度脂蛋白纳米粒子的应用受到限制。如何在保证脂蛋白样纳米粒子(高密度脂蛋白样纳米粒子)稳定形成的基础上，实现纳米粒子的多功能化，是业界一直渴望解决的难题。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种多肽，基于所述多肽的改良脂蛋白样纳米粒子及其应用，从而克服现有技术中的不足。为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：在一些实施例中提供了一种多肽，其包含至少两个双亲性α螺旋，所述的至少两个双亲性α-螺旋之间通过至少一个连接肽连接，所述连接肽包含有环状结构。在一些实施方案中，所述多肽包括由依次串联的α螺旋多肽、连接肽和α螺旋多肽组成的结构单元。在一些实施例中提供了一种脂蛋白样纳米粒子，其包含至少一种磷脂和至少一种所述的多肽。在一些实施方案中，所述多肽的双亲性α螺旋陷入所述脂蛋白样纳米粒子表层，而连接肽的环状结构自所述脂蛋白样纳米粒子表面伸出。进一步的，所述多肽的双亲性α螺旋陷入所述脂蛋白样纳米粒子的脂质表层，而连接肽的环状结构自所述脂质表面伸出。在一些实施例中还提供了所述脂蛋白样纳米粒子的用途，例如在医药领域的用途。例如在制备药物或药物组合物中的用途。在一些实施方案中提供了一种药物，其包含所述的脂蛋白样纳米粒子。在一些实施方案中提供了一种组合物，其包含所述的脂蛋白样纳米粒子或所述的药物。与现有技术相比，本发明的优点至少在于：(1)采用主要由α螺旋多肽、环状序列连接肽和α螺旋多肽组成的螺旋-环-螺旋结构多肽与磷脂等构建形成脂蛋白样纳米粒子，特别是使所述多肽的螺旋部分陷入脂蛋白样纳米粒子表层，可以促进大小均一且粒径较小的脂质纳米颗粒的稳定形成，同时通过使环状序列伸出脂蛋白样纳米粒子表面,还便于功能序列的插入，从而实现脂蛋白样纳米粒子的多功能化；(2)提供的脂蛋白样纳米粒子的核心可用于疏水功能物质的包裹，进而还可进一步扩展其用途，例如使其可作为载药系统而应用于癌症的诊断与治疗等，该载药系统具有低毒性、高稳定性、便于功能化等特点，为肿瘤细胞的靶向杀伤和细胞、组织成像提供简便有 效的手段。(3)提供的脂蛋白样纳米粒子的由双亲性α螺旋多肽、环状结构连接肽和双亲性α螺旋多肽串联组成的螺旋-环-螺旋结构多肽中，其环状结构连接肽的序列可选自多种具有环状结构的靶向肽，从而使脂蛋白样纳米粒子具有靶向特定的细胞、组织和器官的功能。附图说明图1是本发明一典型实施方案中一种多肽与一种脂蛋白样纳米粒子的结构示意图；图2为实施例1中A多肽和AL3A、AL5A、AL7A多肽形成脂蛋白样纳米粒子能力的比较图谱；图3为实施例1中A多肽和AL3A、AL5A、AL7A多肽在脂蛋白样纳米粒子上螺旋程度的比较图谱；图4为实施例1中使用动态激光光散射(DLS)系统测试基于A多肽的脂蛋白样纳米粒子的粒径测试图谱；图5为实施例1中基于A多肽的脂蛋白样纳米粒子的透射电子显微镜成像图像；图6为实施例1中使用动态激光光散射(DLS)系统测试基于AL3A多肽的脂蛋白样纳米粒子的粒径测试图；图7为实施例1中基于AL3A多肽的脂蛋白样纳米粒子的透射电子显微镜成像图像；图8为实施例1中使用动态激光光散射(DLS)系统测试基于AL5A结构多肽的脂蛋白样纳米粒子的粒径测试图；图9为实施例1中基于AL5A结构多肽的脂蛋白样纳米粒子的透射电子显微镜成像图像；图10为实施例1中使用动态激光光散射(DLS)系统测试基于AL7A结构多肽的脂蛋白样纳米粒子的粒径测试图；图11为实施例1中基于AL7A结构多肽的脂蛋白样纳米粒子的透射电子显微镜成像图像；图12为实施例2中使用动态激光光散射(DLS)系统测试包裹Ir(ppy)2-DIP的基于AL3A结构多肽的脂蛋白样纳米粒子的粒径测试图；图13为实施例2中包裹Ir(ppy)2-DIP的基于AL3A结构多肽的脂蛋白样纳米粒子的透射电子显微镜成像图像；图14为实施例2中基于A和AL3A结构多肽的脂蛋白样纳米粒子包裹Ir(ppy)2-DIP化合物稳定性的测试图；图15为实施例3中使用动态激光光散射(DLS)系统测试基于A(His)5A结构多肽的包裹脂溶性物质Ir(ppy)2-DIP脂蛋白样纳米粒子的粒径测试图；图16为实施例3中基于A(His)5A结构多肽的包裹脂溶性物质Ir(ppy)2-DIP脂蛋白样纳米粒子的透射电子显微镜成像图像；图17为实施例3中包裹Ir(ppy)2-DIP的A(His)5A-脂蛋白样纳米粒子和AL5A-脂蛋白样纳米粒子与Ni柱孵育2小时后，上清残余荧光量的比较图；图18为实施例3中包裹Ir(ppy)2-DIP的A(His)5A-脂蛋白样纳米粒子和AL5A-脂蛋白样纳米粒子与Ni柱孵育2小时后，脂蛋白样纳米粒子与Ni柱结合量的比较图；图19为实施例4中使用动态激光光散射(DLS)系统测试基于A(RGD)A结构多肽的包裹脂溶性物质Ir(ppy)2-DIP脂蛋白样纳米粒子的粒径测试图；图20为实施例4中基于A(RGD)A结构多肽的包裹脂溶性物质Ir(ppy)2-DIP脂蛋白样纳米粒子的透射电子显微镜成像图像；图21为实施例4中A(RGD)A-LNP包裹Ir(ppy)2-DIP后与Ir(ppy)2-DIP溶血率的比较图；图22为实施例4中A(RGD)A-LNP包裹Ir(ppy)2-DIP后与Ir(ppy)2-DIP对HLF细胞杀伤率的比较图；图23为实施例4中A(RGD)A-LNP包裹Ir(ppy)2-DIP后与Ir(ppy)2-DIP对HT1080细胞杀伤率的比较图；图24为实施例5中包裹Ir(ppy)2-DIP的A(RGD)A-LNP，A(SRGDS)A-LNP，AL3A-LNP在HT1080细胞中入胞荧光量和细胞形态的比较图；图25为实施例5中包裹Ir(ppy)2-DIP的A(RGD)A-LNP，A(SRGDS)A-LNP，AL3A-LNP不同浓度对HT1080细胞杀伤作用的比较图；图26为实施例5中包裹Ir(ppy)2-DIP的A(RGD)A-LNP，AL3A-LNP在20μM作用下不同时间对HT1080细胞杀伤作用的比较图；图27为实施例1中AL5A的质谱分析图。具体实施方式体现本发明特征与优点的典型实施例将在以下的说明中详细叙述。应理解的是本发明能够在不同的实施例上具有各种的变化，其皆不脱离本发明的范围，且其中的说明及图示在本质上是当作说明之用，而非用以限制本发明。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实 施例的目的，不是旨在于限制本发明。根据本发明的一个方面，提供了一种多肽，其包含至少两个双亲性α-螺旋，所述的至少两个双亲性α-螺旋之间通过至少一个连接肽连接，所述连接肽包含有环状结构。在一些实施方案中，所述多肽包括由依次串联的α螺旋多肽、连接肽和α螺旋多肽组成的结构单元。所述多肽亦可认为是螺旋-环-螺旋结构多肽，其中的螺旋多肽为具有明确的亲疏水面的双亲α螺旋结构的多肽，并且氨基酸的构型可为L型或D型，其中的环状序列为具有环状结构的氨基酸序列，环状序列在结构上将双亲α螺旋多肽进行二价化，可以进一步提高多肽的螺旋程度。所述多肽还可被称为ALmA多肽，进一步可统称ALA多肽，其中A指α螺旋多肽，L指具有环化序列的连接肽，m为环化序列所含氨基酸数量。其中，所述的多肽可采用业界所知的任何合适方式合成，例如可参考如下文献所述及之方式合成：文献1.Merrifield,R.B.,SolidPhasePeptideSynthesis.I.TheSynthesisofaTetrapeptide.J.Am.Chem.Soc1963,85.文献2.Barlos,K.；Gatos,D.；Kapolos,S.；Poulos,C.；W.；Yao,W.Q.,Applicationof2-chlorotritylresininsolidphasesynthesisof(Leu15)-gastrinIandunsulfatedcholecystokininoctapeptide.SelectiveO-deprotectionoftyrosine.Int.J.Pept.ProteinRes.1991,38(6),555-561.根据本发明的一个方面，提供了一种非天然存在的脂蛋白样纳米粒子(LNP)，其包含至少一种磷脂和至少一种所述的多肽(即所述的螺旋-环-螺旋结构多肽)。参阅图1，在一些实施例中，所述脂蛋白样纳米粒子含有：a)至少一种磷脂；b)至少一种所述的多肽，所述多肽包括由依次串联的α螺旋多肽(图中称为“双亲性螺旋多肽”)、连接肽和α螺旋多肽组成的结构单元，所述连接肽包含有环状结构(图中简称为“连接环”)；以及，c)一种或多种疏水性内容物，例如胆固醇油酸等。在一些实施方案中，所述多肽的双亲性α螺旋陷入所述脂蛋白样纳米粒子的脂质表层，而所述连接肽的环状结构自所述脂蛋白样纳米粒子表面伸出。而该螺旋-环-螺旋结构多肽与脂蛋白样纳米粒子结合时，螺旋部分陷入脂蛋白样纳米粒子表层,用于促进大小均一且粒径较小的脂质纳米颗粒的稳定形成，而环状序列伸出脂蛋白样纳米粒子表面,便于功能序列的插入，进而利于实现脂蛋白样纳米粒子的多功能化。进一 步的，通过采用脂蛋白样纳米粒子的核心进行疏水功能物质的包裹，可以进一步扩展其用途，特别是在医药领域的用途，例如作为载药系统而用于癌症的诊断与治疗。该载药系统具有低毒性、高稳定性、便于功能化等特点，为肿瘤细胞的靶向杀伤和细胞、组织成像提供简便有效的手段。在一些实施方案中，所述的连接肽为靶向肽或由亲水性氨基酸组成的序列。优选的，所述的连接肽为靶向肽序列。在一些实施方案中，所述连接肽包含但不限于至少通过二硫键、酰胺键，硫酯键和内酯键中的任意一种形成的环状结构。优选的，所述连接肽的环状结构系通过二硫键形成。在一些较为优选的实施方案中，所述连接肽的环状结构含有C(X)nC氨基酸序列，n选自3～11中的任一整数。其中，C指用于环化的半胱氨酸，X为能用于组成所述环状结构的任意氨基酸。在一些较为优选的实施方案中，参与形成所述连接肽的环状结构的氨基酸数量为3～7。在一些具体实施方案中，所述连接肽的环状结构的氨基酸序列包含CSGSC、CSGSGSC、CSGSGSGSC、CRGDC、CHHHHHC中的任意一种或两种以上的组合。在一些实施方案中，至少一个所述双亲性α-螺旋的对应氨基酸序列选自模拟ApoA-I功能的多肽氨基酸序列。在一些较为优选的实施方案中，至少一个所述双亲性α-螺旋的对应氨基酸序列选自A-I多肽序列(CGVLESFKASFLSALEEWTKK)或其反向序列、18A多肽序列(DWLKAFYDKVAEKLKEAF)或其反向序列、4F多肽序列(DWFKAFYDKVAEKFKEAF)或其反向序列、GSFLSALEEWTKKLN或其反向序列。这些多肽不仅利于促进高密度脂蛋白纳米粒子的形成，而且可以共价交联功能序列，赋予纳米粒子特定功能。在一个较佳的具体实施方案中，其中两个双亲性α螺旋对应的氨基酸序列分别为GSFLSALEEWTKKLN和NLKKTWEELASLFSG。在一些实施方案中，所述磷脂包括磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE,1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)、磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。例如，所述磷脂优选采用磷脂酰胆碱。例如，所述磷脂优选采用二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)。较为优选的，在一些实施方案中，所述脂蛋白样纳米粒子还包括至少一种疏水性内容物。其中，该至少一种疏水性内容物可被包裹于由所述至少一种磷脂和所述至少一种多肽组成的外壳内。在一些实施方案中，所述疏水性内容物包括胆固醇、胆固醇酯、疏水性药物，显影剂和示踪剂中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。例如，所述疏水性内容物为胆固醇与胆固醇酯中的任一者与选自疏水性药物、显影剂、示踪剂中的任一种的组合。例如，所述疏水性内容物可以优选自胆固醇酯和/或疏水性药物，例如可以为胆固醇酯和疏水性药物的组合。例如，所述疏水性内容物可以优选自胆固醇油酸酯和/或Ir(ppy)2-DIP，例如可以为该两者的组合。在一些实施方案中，所述脂蛋白样纳米粒子包含活性剂、抗癌剂等。本发明的脂蛋白样纳米粒子可以任选地掺入疏水性药物或标记化合物，或者可以被用在掺入药物或标记化合物的制剂的制备中，其中所述含脂蛋白样纳米粒子提供降低药物或标记化合物的副作用的益处和/或也防止药物或标记化合物的降解和/或效应丧失。根据本发明的另一个方面，还提供了制备和应用本说明书所述的脂蛋白样纳米粒子的方法。相应的，在一些实施例中还提供了所述脂蛋白样纳米粒子的用途，例如在医药领域的用途。在一些实施方案中提供了一种药物，包含所述的脂蛋白样纳米粒子。在一些实施方案中提供了一种组合物，其包含所述的脂蛋白样纳米粒子或所述的药物。根据本发明的又一个方面，所述脂蛋白样纳米粒子可以用于治疗或诊断癌症(例如，乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、结肠癌、胰腺癌、非小细胞性肺癌、小细胞肺癌、脑癌、肝癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌或血液恶性病(例如，白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等)。“α螺旋”在本说明书中“α螺旋”用来指蛋白质的二级结构中常见的基序。α-螺旋是卷曲的构象，类似于弹簧，其中每个骨架N-H基团向早期的氨基酸四个残基的骨架C＝O基团贡献氢键。典型地，由天然存在的氨基酸形成的α-螺旋将是右旋的，但是左旋构象也是已知的。“双亲性”“双亲性”是描述具有亲水性和疏水性性能的化合物的术语。双亲性α螺旋通常是生物活性肽和蛋白质中通常遇到的二级结构基序，并指的是具有沿着螺旋的长轴定向的相对的极性和非极性面的α螺旋。“螺旋-环-螺旋结构”在本说明书中“螺旋-环-螺旋结构多肽”是指由由依次串联的双亲性α螺旋多肽、具有环状结构的连接肽和双亲性α螺旋多肽组成的结构单元。“氨基酸”在本说明书中，既包括L-氨基酸，也包括D-氨基酸，既可以是天然存在的氨基酸，也可以是非天然存在的、人工合成的氨基酸。同时这些氨基酸可以被任意的化学修饰。“靶向肽”在本说明书中，术语“靶向肽”是指特定分子在给予受试者后相对特异地结合至特定器官或组织中存在的分子。通常，选择性的特征部分在于，检测比对照器官或组织至少两倍更大的所述分子与器官或组织的选择性结合。在一些实施方式中，选择性结合比对照器官或组织至少三倍或四倍更大。已经被鉴定出来，含有环状结构的、可作为靶向肽的包括但不限于表1、表2中列出的氨基酸序列：表1.蛋白靶向肽蛋白靶标肽序列(名称)Her2/ErB2WTGWCLNPEESTWGFCTGSFαvβ3CDCRGDCFC(RGD-4C)α5β1GACRGDCLGA(pIII)APN/CD13CNGRCMMP-9CTTHWGFTLC(CTT)TAG-72GGVSCMQTSPVCENNLVEGFR-3CSDSWHYWCPhosphatidylSerineCLSYYPSYC表2.肿瘤靶向肽应该注意的是，本发明所述的靶向肽不限于上述已发现的肽序列，通过在其他已知线性靶向肽的两端添加半胱氨酸、或以其它方法使其成环，均有可能作为本发明所述脂蛋白样纳米粒子的多肽中的连接肽。在一些实施方式中，本发明的脂蛋白样纳米粒子(LNP)包含抗癌剂。这样的活性剂可以为化疗剂、光动力学治疗剂、硼中子俘获治疗剂或用于放射治疗的放射性核。在一些实施方式中，所述抗癌剂选自由烷基化剂(烷化剂)、蒽环类药、抗生素、芳香酶抑制剂、双磷酸盐类、环加氧酶抑制剂、雌激素受体调节剂、叶酸拮抗剂、无机砷酸盐、微管抑制剂、修饰剂、亚硝基脲(nitrosourea)、核苷类似物、破骨细胞抑制剂、含钼化合物、类维生素A、拓扑异构酶1抑制剂、激酶抑制剂(诸如，但不限于酪氨酸激酶抑制剂)、抗血管生成剂、表皮生长因子抑制剂和组蛋白脱乙酰基酶(脱乙酰基转移酶)抑制剂组成的组。综述之，本发明利用螺旋-环-螺旋结构多肽稳定纳米粒子的同时可以为生物功能化提供良好的接口和插入位点，进而还可以根据需要在螺旋-环-螺旋结构多肽中添加具有特定功能的氨基酸序列，并且在纳米粒子的核心包裹疏水性的物质，实现纳米粒子的多功能化。下面结合附图和实施方式对本发明做进一步详细的说明。如下实施例中采用的ALA多肽可以参考前文的文献1和文献2所记载的方式合成。实施例1本实施例的基于螺旋-环-螺旋结构多肽的脂蛋白样纳米粒子中，螺旋-环-螺旋结构多肽 (ALA多肽)是由α螺旋多肽、环化序列和α螺旋多肽以共价键的形式串连而成。其中α螺旋多肽的氨基酸序列为：GSFLSALEEWTKKLN，但是并不仅限于此序列。环化多肽序列分别为SGS、SGSGS、SGSGSGS，但是并不仅限于此序列，也可以为其它具有特定功能的序列。其中一种AL5A多肽的合成过程具体如下：采用固相合成法(参照文献1及文献2)，使用Fmoc氨基酸，二氯三苯甲基树脂为载体，在其上由C末端向N末端按所设计序列进行氨基酸缩合反应，在多肽反应完成最后一个氨基酸后，使用TFA将多肽从树脂上裂解下来，并进行纯化脱盐处理，处理完毕后，将纯品浓缩得到线性多肽。将所述线性多肽溶解在蒸馏水中，调节pH值约为8，经过氧气缓慢氧化(或者加入一些催化剂如铁氰化钾，碘等)，使其多肽序列中两个半胱氨酸的巯基形成二硫键，即形成环肽粗品。环肽粗品经过再次浓缩，并经过HPLC纯化再冻干得到纯品，即所述ALA多肽，进而采用质谱分析技术确定其分子量(4048.2)与所设计多肽的预计分子量(4048.55)基本一致(参阅图27)，即可以确定其序列正确。而AL3A、AL7A等亦可参考前述方式合成。一种制备基于所述螺旋-环-螺旋结构多肽的脂蛋白样纳米粒子的方法包括如下步骤：(1)将3μmolDMPC(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、0.1μmol胆固醇脂(Cholesteryloleate，简称CO)充分溶于氯仿溶液中；(2)用稳定的氮气流将离心管内的氯仿吹干，使混合物在管底部形成一层薄膜；(3)向离心管中加入1ml的PBS缓冲液(pH值7.4)，利用涡旋震荡仪将试管底部的薄膜充分重悬，以形成乳白色的悬浊液；(5)向离心管冲入氮气，进行密封，将离心管置于超声仪中，48℃超声1h；(6)向离心管中加入含有螺旋-环-螺旋结构多肽的PBS溶液，混匀后密封，4℃放置过夜。(7)第二天，通过超滤将脂蛋白样纳米粒子溶液进行纯化并收集有效溶液备用。利用上述步骤合成的螺旋-环-螺旋结构多肽的脂蛋白样纳米粒子(AL(3-7)A-LNP)可以通过FPLC等方式表征。图2为FPLC的时间曲线图，A多肽与磷脂分子的摩尔比为1:5，对应的ALA多肽与磷脂分子的摩尔比为1:10。图2中出现位置相差较远的双峰，从左依次为Peak1和Peak2，Peak1为多肽组装形成的纳米粒子，Peak2为游离多肽。通过比较发现所有ALA-LNP中Peak1的峰值和峰面积均高于单体-LNP，Peak2的峰值和峰面积均小于单体-LNP，说明多肽通过环化序列二价化之后可以大大提高多肽的利用率以及形成纳米粒子的数量。除此之外CD结果显示，多肽二价化之后可以有效的提升其螺旋程度(图3)。 当环状序列中的氨基酸个数为5个或7个时，与AL3A多肽呈现相同结果。DLS和TEM的结果显示选取的A多肽和合成的AL3A、AL5A、AL7A多肽均能形成粒径均匀(<30nm)、分散性好的脂蛋白样纳米粒子，如图4-图11所示。这些结果表明设计的AL(3-7)A多肽可以高效率的组装脂质分子，并且环化连接结构中的氨基酸个数可以进行调整。实施例2根据实施例1结果显示合成的AL3A、AL5A、AL7A多肽可以成功稳定脂蛋白样纳米粒子。在本实施例中对脂蛋白样纳米粒子的载药能力进行研究。以AL3A多肽为例进行研究。在本实施例中脂蛋白样纳米粒子制备方法的步骤和反应物的用量与实施例1基本一致，不同之处在于，在步骤(1)中采用了3μmolDMPC、0.15μmol胆固醇脂(Cholesteryloleate，简称CO)、0.2μmolIr(ppy)2-DIP的氯仿溶液。在脂蛋白样纳米粒子的疏水性核心中填充具有荧光和毒性的化合物Ir(ppy)2-DIP。图12和图13显示AL3A-LNP包裹Ir(ppy)2-DIP后仍可以形成粒径均一、分散度好的脂蛋白样纳米粒子(AL3A-LNP(Ir))。图14所示在储存环境中包裹Ir(ppy)2-DIP的A-LNP不稳定，48小时Ir(ppy)2-DIP的释放量高达50％。包裹Ir(ppy)2-DIP的AL3A-LNP在储存环境或者在1640培养基中都可以稳定存在，便于进行以下的功能研究。实施例3在本实施例中，将具有特定功能的-HHHHH-序列插入到环化结构中进行功能研究。在本实施例中脂蛋白样纳米粒子(A(His)5A-LNP(Ir))制备方法的步骤和反应物的用量与实施例2基本一致，不同之处在于，在步骤(6)中，螺旋-环-螺旋多肽为A(His)5A。在步骤(6)之后，用100K的超滤管对脂蛋白样纳米粒子进行纯化，去除游离的分子。通过DLS和TEM进行检测，结果显示包裹Ir(ppy)2-DIP的A(His)5A-LNP形成粒径均匀的纳米粒子，见图15-图16。A(His)5A-LNP(Ir)超滤纯化后进行多肽定量，然后与一定量的Ni柱在室温孵育1小时后，离心，吸取上清进行荧光检测。图17显示，环状序列为HHHHH时可以与Ni柱结合，经过离心，Ni柱与A(His)5A-LNP(Ir)沉淀到底部，改变上清中的荧光值。将孵育后的Ni柱稀释后滴加到载玻片上进行荧光显微镜检测，根据图18结果显示，Ni柱有效的与A(His)5A-LNP(Ir)结合，呈现出绿色的荧光。以上结果显示，A(His)5A多肽与脂蛋白样纳米粒子结合后，环状结构保持与Ni柱的高亲和力。实施例4在本实施例中，将与整合素具有较高亲和力的RGD序列插入到环状序列中进行研究。DLS和TEM结果显示RGD序列的插入对脂蛋白样纳米粒子的形成没有明显影响。本实施例中脂蛋白样纳米粒子制备方法的步骤和反应物的用量与实施例2基本一致，不同之处在 于，在步骤(6)中，螺旋-环-螺旋多肽为A(RGD)A多肽，所形成的脂蛋白样纳米粒子为A(RGD)A-LNP(Ir)。A(RGD)A-LNP(Ir)和Ir(ppy)2-DIP在不同浓度下与2×107个红细胞37℃孵育1h，进行Absorbance540的检测。图21所示，60μM时Ir(ppy)2-DIP的溶血率达到90％，A(RGD)A-LNP(Ir)没有明显的溶血现象，说明Ir(ppy)2-DIP化合物包裹进脂蛋白样纳米粒子后，可以大大降低化合物的溶血性，降低副作用。进一步对环状RGD的选择杀伤作用进行研究。通过比较A(RGD)A-LNP(Ir)和Ir(ppy)2-DIP对HLF(αvβ3-)细胞和HT1080(αvβ3+)细胞的杀伤作用可以得出，Ir(ppy)2-DIP对HLF和HT1080细胞均具有较强的杀伤作用，而A(RGD)A-LNP(Ir)对HLF细胞毒性比较小，对HT1080细胞的杀伤作用呈现出与Ir(ppy)2-DIP相同的趋势(参阅图22-图23)。这些结果显示脂蛋白样纳米粒子的包裹可以有效降低Ir(ppy)2-DIP的副作用，同时RGD序列的引入可以实现Ir(ppy)2-DIP的靶向输送。实施例5在本实施例中，将对环状结构的功能进行进一步的验证，其中采用未环化的A(SRGDS)A多肽作为对照进行实验。A(SRGDS)A多肽构成脂蛋白样纳米粒子A(SRGDS)A-LNP(Ir)的方法与实施例2的步骤基本相同，不同之处在于，在步骤(6)中，螺旋-环-螺旋多肽为A(SRGDS)A多肽。首先将20μM的所述A(RGD)A-LNP(Ir)、A(SRGDS)A-LNP(Ir)、AL3A-LNP(Ir)与HT1080细胞孵育2h后进行细胞形态和荧光强度的观察。参阅图24所示，A(RGD)A-LNP(Ir)组细胞荧光强度较强，并且细胞皱缩变圆，出现明显的死亡迹象；A(SRGDS)A-LNP(Ir)和AL3A-LNP(Ir)组胞内荧光亮度较弱，细胞形态完好。不同浓度的A(RGD)A-LNP(Ir)、A(SRGDS)A-LNP(Ir)、AL3A-LNP(Ir)与HT1080细胞孵育6h，进行MTT测定。参阅图25所示，A(RGD)A-LNP(Ir)可以明显杀伤HT1080细胞，A(SRGDS)H-LNP(Ir)、AL3A-LNP(Ir)对HT1080细胞无太大的杀伤作用。最后，将20μM的A(RGD)A-LNP(Ir)、AL3A-LNP(Ir)与HT1080细胞孵育不同的时间，观察细胞生存状态。参阅图26所示，A(RGD)A-LNP(Ir)与细胞孵育2h细胞开始死亡，6h时细胞大量死亡，生存率约为20％，而AL3A-LNP(Ir)在6h时才开始引起细胞死亡，生存率高于80％。上述结果说明环状结构有利于保持靶向序列的功能性。应理解的是，本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。当前第1页1 2 3