本申请是以下申请的分案申请：申请日2010年2月24日，申请号201080010073.9，发明名称“通过选择性酶促酯交换生产蓖麻油酸酯的方法”。一般说来，本发明涉及油酯化学(oleochemistry)领域。更具体地说，本发明涉及从纯的或混合的植物油，特别地蓖麻油，制备蓖麻油酸酯的方法，所述方法至少包括酶促酯交换的一个步骤，该步骤在轻质醇的存在下和通过类型选择性(typoselective)脂肪酶进行，并且产生富集蓖麻油酸酯的级分。
背景技术：
：：脂肪酸酯通常是在催化剂，特别地酸或碱催化剂的存在下通过精制植物油的化学酯交换获得的。产生脂肪酸酯的这种路线使以良好的收率获得所述酯成为可能；然而它具有许多缺点，特别地与需要除去所用的催化剂，难以回收甘油和高能量消耗有关的缺点。这类方法仍然是费力的，因为它包括许多物理化学转化步骤，这导致由此产生的脂肪酸酯的高成本。此外，对于脂肪酸的类型来说，所用的酸或碱催化剂不是选择性的，并且将全部脂肪酸链酯交换，产生酯的混合物。然而，将具有较接近的物理性能的各种脂肪酸酯分离是非常困难的。另外，这类方法没有使从通过酯交换反应获得的脂肪酸酯的混合物选择性提取官能化的、特别地羟基化的脂肪酸酯成为可能。因此令人期望的是获得富集羟基化的脂肪酸酯的级分，其包含例如蓖麻油酸甲酯(或12-羟基-顺-9-十八烯酸甲酯)，因为这样的级分是在生产11-氨基十一烷酸(rilsan®11的组成单体，其是由申请人开发的具有优异的物理性能的聚酰胺)中的起点。在生产11-氨基十一烷酸期间，蓖麻油酸甲酯经受气相热裂化。为此，它必须包含最低量的甘油酯，即甘油三、二和单酯，因为这些产品非常难以汽化，并且常常在汽化前分解，这导致裂化选择性降低。同样，蓖麻油酸甲酯必须包含最低量的蓖麻油酸，其同样难以汽化。根据上述内容，申请人本身设定了发现一种用于含蓖麻油酸的植物油的酯交换的方法的目的，该方法解决了已知酯交换方法的上述缺点并且使获得富集蓖麻油酸酯的级分成为可能。在脂肪酶的存在下酯化或水解植物油中所含的甘油三酯的方法是众所周知的。这些酶具有若干优点：它们不需要辅助因素，常常是市售可得的并且具有高活性和高选择性，甚至是在非水性体系中。甘油的酯或甘油三酯是它们的天然底物。这些脂肪酶中的一些显示出位置特异性（spécificitédeposition）(或区域选择性（régioséléctivité）)，这使得它们在中心位置(sn-2)和甘油的两个外部位置(sn-1和sn-3)之间区分。然而，这种特异性可以在存在于蓖麻油中的蓖麻油酸(ar)的情况下仅仅以收率损失为代价被利用，因为后者主要由ar残基构成(85至90wt%)，存在的其它脂肪酸残基特别地是油酸，亚油酸，硬脂酸，棕榈酸和亚麻酸的那些。蓖麻油酸优选地占据外部位置，但也可能在内部位置中被发现。此外，文献没有描述在酯交换反应中对ar特异性的任何脂肪酶。甚至从蓖麻油植物提取的脂肪酶，在水解反应期间其显示出对于ar的优先性，没有显示出与此相关的类型选择性(typoselectivity)。其它脂肪酶相对于脂肪酸的性质显示出类型选择性(typoselectivity)或特异性。因此已知在酯化或水解反应中，从白地霉(geotrichumcandidum)提取的脂肪酶，类酵母真菌(ayeast-likefungus)，显示出对顺-9单不饱和的脂肪酸的强特异性。文件de4124248描述了从白地霉提取的胞外脂肪酶用于特别地断开油酸酯(ch3(ch2)7ch=ch(ch2)7cooh)的用途。文件us5633151描述了相同的脂肪酶用于特别地断开芥酸酯(ch3(ch2)7ch=ch(ch2)11cooh)的用途。fogliat.a.等的出版物,eur.jlipidsci.technol.102(2000):612-617描述了用于测定某些脂肪酶对植物来源的脂肪酸的选择性的测试结果。表1中所示的结果表明在借助于商业固定的脂肪酶(commercialimmobilizedlipase)的在30℃进行1至4小时的蓖麻油部分水解反应期间，白地霉脂肪酶是对蓖麻油酸(以下由ar表示)有认别性的。此外，表2中所示的结果表明在游离脂肪酸与1-丁醇的混合物的酯化反应期间这种酶也对ar具有认别性。在白地霉的存在下的酯化，在24小时的反应后，导致由12%的脂肪酸丁酯和88%的游离脂肪酸组成的混合物(按质量计)，ar占所述游离脂肪酸的94.5%。所述混合物因此包含大约83%的ar。在水解反应期间相对于底物的酶的特定性能没有使在酯交换或酯化反应期间预见其对相同底物的性能成为可能。脂肪酶的特异性在彼此反应类型之间不同。vayssel.等的出版物,enzymemicrob.technol.31(2002):648-655通过表1和2中所示的结果显示，在水解，酯交换和酯化反应期间相同脂肪酶可以分别地对相同脂肪酸酯或游离脂肪酸具有不同的性能。技术实现要素：申请人已经进行研究，目的在于确定在蓖麻油酯交换反应期间白地霉脂肪酶对存在于蓖麻油中的脂肪酸，特别地蓖麻油酸(ch3(ch2)5ch(oh)ch2ch=ch(ch2)7cooh)的作用。这些研究已经表明，令人惊讶地，所述脂肪酶在轻质醇的存在下在酯交换反应中对ar具有认别性。本发明的目标是提供一种酯交换的方法，其允许蓖麻油酸酯的生物选择性提取，并且因此从蓖麻油或任何其它含ar残基的油中产生富集这种酯(包含多于85wt%的酯)的级分。为此，根据第一方面，本发明涉及一种用于从含蓖麻油酸的植物油，特别地蓖麻油中生产蓖麻油酸酯的方法，包括以下步骤：i)在轻质醇(alcoolléger)和从白地霉提取的脂肪酶的存在下进行的第一酯交换反应，产生含ar甘油单、二和三酯、非ar的脂肪酸的酯、和醇的混合物m；ii)将所述混合物m分离为至少两种级分的转化步骤，包括富含ar甘油酯的级分a和富含非ar的脂肪酸的酯的级分b；iii)将所述ar甘油酯转化为ar酯的步骤，形成富集ar酯的级分c和富集醇的级分。有利地，所述脂肪酶选择性地断开涉及非ar的脂肪酸，特别地油酸和亚油酸的酯键，并且几乎留下完整的涉及ar残基的酰基键。实施根据本发明的方法使获得特别富集蓖麻油酸酯的级分c成为可能。因此，根据第二方面，本发明涉及富集ar酯的级分，当原材料是纯蓖麻油时，其含至少91wt%，并且优选地94至98wt%，的蓖麻油酸甲酯。这样的级分非常有利地适于用作合成中间化学产品如11-氨基十一烷酸的原材料。根据另一实施方案，实施根据本发明的方法使获得富集蓖麻油酸酯的级分c成为可能。因此，根据第三方面，当原材料是具有低蓖麻油酸含量的油时，如下文限定的，根据本发明的方法使获得含至少75wt%并且优选地82至91wt%的蓖麻油酸甲酯的富集ar酯的级分成为可能。这样的级分特别适合用作合成中间化学产品如11-氨基十一烷酸的原材料，因为它然后具有相当于常规蓖麻油的蓖麻油酸含量。附图说明其它特性和优点将从随后的根据本发明生产蓖麻油酸酯的方法的详细说明和所附的图1至10显露出来，图1至10是：-图1举例说明了以游离形式和各种商用脂肪酶的形式用白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶获得的在甲醇的存在下在酯交换反应中乙酯转化至甲酯的转化率。-图2显示了在甲醇的存在下通过白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶催化的酯交换反应期间在蓖麻油中的最初以甘油酯的形式的蓖麻油酰基(ricinoleoyl)，亚油酰基(linoleoyl)和油酰基(oleoyl)基团转化为甲酯或相应脂肪酸的动力学；-图3举例说明了在甲醇的存在下通过白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶催化的蓖麻油的酯交换期间偏甘油酯（partialglycerides）级分的ar浓度的变化；-图4显示了在甲醇的存在下通过白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶催化的50:50w/w(按重量计)蓖麻油/三亚油精（castoroil/trilinolein）混合物的酯交换反应期间亚油酰基(linoleoyl)基团和酰基基团转化为甲酯的动力学的比较；-图5举例说明了[ar/(ar+al)]和[mear/(mear+meal)]比例的变化，其代表了在甲醇的存在下通过白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶催化的50:50w/w蓖麻油/三亚油精混合物的酯交换反应期间白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶对蓖麻油酰基(ricinoleoyl)基团的识别力和其对于亚油酰基(linoleoyl)基团的选择性；-图6表示了在甲醇的存在下通过白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶催化的50:50w/w蓖麻油/三亚油精混合物的酯交换期间偏甘油酯级分中ar浓度的变化；-图7举例说明了在甲醇的存在下通过白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶催化的90:10w/w蓖麻油/三亚油精混合物的酯交换反应期间亚油酰基(linoleoyl)基团和酰基基团转化为甲酯的动力学的比较；-图8举例说明了[ar/(ar+al)]和[mear/((mear+meal))]比例的变化，其代表了在甲醇的存在下90:10w/w蓖麻油/三亚油精混合物的酯交换反应期间白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶对蓖麻油酰基(ricinoleoyl)基团的识别力和其对于亚油酰基(linoleoyl)基团的选择性；-图9显示了在甲醇的存在下通过白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶催化的90:10w/w蓖麻油/三亚油精混合物的酯交换期间偏甘油酯级分的ar浓度的变化；-图10显示了在甲醇的存在下通过白地霉的固定的类型选择性(typoselective)脂肪酶催化的50:50w/w蓖麻油/三亚油精混合物的酯交换反应期间最初以甘油酯的形式的蓖麻油酰基(ricinoleoyl)和亚油酰基(linoleoyl)基团转化为甲酯或相应的脂肪酸的动力学。具体实施方式本发明涉及与化学或酶促酯交换的方法联系的含蓖麻油酸（acidericinoléique）的植物油的酶促酯交换的方法，以便产生富集蓖麻油酸酯的级分。特征上，该方法使用了一种酶，其显示出对蓖麻油酸的"抗"-选择性(也称为识别力（discrimination）)，即其优选地对链而不是蓖麻油酸进行酯交换。这种效果特别地显示在非蓖麻油的蓖麻油酸的两个主要的脂肪酸上：油酸和亚油酸。本发明的酶促酯交换的方法特别合适于"具有低含量"的蓖麻油酸，即包含小于82wt%的蓖麻油酸的油。这种情况是具有低蓖麻油酸含量的蓖麻油的情况，或者包括蓖麻油及来源于至少一种其它产油的（oleaginous）、产油的/产蛋白的（oleaginous/protein-producing）或产蛋白（protein-producing）的植物的其他植物油的混合物的情况，所述混合物包含至少10wt%的蓖麻油酸，或者来源于单独地产生蓖麻油酸的基因修饰植物或来源于产生蓖麻油酸的基因修饰植物与任选地被基因修饰的产油的植物的混合物并且包含至少10wt%的蓖麻油酸的油的情况。参考pilarrijas-barros等在cropscience44(2004):76-80,and45(2005):157-162中的出版物，表述"具有低蓖麻油酸含量的蓖麻油"还被理解为是指来源于突变株如ole-1的油，其描述于这些出版物中并且产生含约10%的蓖麻油酸的油。参考k.m.hosamani在chemistryandphysicsoflipids,152(2008)9-12中的文章，表述"具有低蓖麻油酸含量的油"还被理解为是指橡胶树(heveabrasiliensis)和棉叶麻风树(jatrophagosypiifolia)的油，其中已经发现蓖麻油酸的含量为大约18%。参考同一作者在phytochemistry,vol.37,no.6,pp.1621-1624，1994中发表的另一篇文章，所述表述还被理解为是指斯里兰卡毛束草(trichodesmazeylanicum)的油，其看起来包含22%的蓖麻油酸。也可提及非洲黄果藤黄木(mammeaafricana)，其在它的果实的籽中包含20%的蓖麻油酸，以及蓮子草(alternantheratriandra)syn.a.无柄籽(sessilisseed)的油，其包含大约22%的蓖麻油酸(k.m.hosamanietal.,industrialcropsandproducts,2004,19(2),133-136)。因此，表述"含蓖麻油酸的植物油"，在本发明的范围中，覆盖了蓖麻油以及全部这些上述的油和油混合物。现在已经发现从白地霉微生物提取的胞外的脂肪酶在轻质醇的存在下进行的含蓖麻油酸的植物油的酯交换反应期间相对于非蓖麻油酸的在顺-9位单不饱和的脂肪酸有选择性。根据第一方面，本发明的主题是从含蓖麻油酸的植物油，特别地蓖麻油产生蓖麻油酸酯的方法，包括以下步骤：i)在轻质醇和从白地霉菌株提取的类型选择性(typoselective)脂肪酶的存在下进行的第一酶促酯交换反应，产生含ar甘油单、二和三酯、非ar的脂肪酸的酯、和醇的混合物m；ii)将所述混合物m分离为至少两种级分的步骤，包括富含ar甘油酯的级分a，和富含非ar的脂肪酸的酯的级分b；iii)将级分a中所含的所述ar甘油酯转化为ar酯的步骤，以便形成富集ar酯的级分c和富集醇的级分。有利地，在步骤i)期间，酯交换反应的持续时间是至多1小时，优选地至多30分钟，其相应于在混合物m的偏甘油酯级分中，相对于其它脂肪酸的至少90wt%的ar的含量。根据第一实施方案，酯交换方法的步骤iii)由以下构成：在碱性催化剂如氢氧化钠的存在下在包括ar甘油酯和醇的相上进行的化学酯交换反应，以便获得富集ar酯的所述级分c。根据第二种实施方案，步骤iii)由以下构成：在轻质醇和例如选自南极假丝酵母b（candidaantarcticab)(特别地固定形式的n.435®，novonordisk)，米黑根毛霉(rhizomucormiehei)(特别地固定形式的rm®im，novozymes)，thermomyceslanuginosa(特别地固定形式的tl®im，novozymes)，洋葱假单胞菌（pseudomonascepacia），黑曲霉（aspergillusniger），米根霉（rhizopusoryzae），少根根霉（rhizopusarrhizu），皱褶假丝酵母（candidarugosa），爪哇毛霉(mucorjavanicus)，猪胰脂肪酶（porcinepancreaticlipase）和产生富集ar酯的所述级分c的任何其它脂肪酶的脂肪酶的存在下进行的第二酶促酯交换反应。所用的轻质醇是低级脂族醇如甲醇，乙醇，异丙醇和正丙醇，和优选地是甲醇。在步骤i)中的底物/醇比例为1:4.5至1:0.75，在一次或多次添加中添加所述醇。假定蓖麻油的组成(见实施例1)，非ar的脂肪酸的最主要的酯是油酸酯和亚油酸酯。分离蓖麻油酸甘油酯/油酸的甲酯/亚油酸的甲酯的混合物的步骤ii)包括至少一种选自以下的操作：蒸馏，离心，滗析，用非极性有机溶剂如己烷或石油醚的液-液萃取，和通过选择吸附的色谱分离。白地霉是dipodascaceae科的endomycete，其具有接近于丝状真菌的形态。其野生广泛分布并且在许多食物，包括乳制品中被发现。它也是人和动物中的消化道的腐生菌。表述"从白地霉提取的脂肪酶"意图在本文中是指根据例如在文件de4124248中描述的规程从这种酵母中提取的胞外脂肪酶的粗制混合物，和通过异种表达编码这些脂肪酶之一的白地霉基因获得的酶。以提供良好的收率以便在工业规模上使用为目的，这种酶优选地以固定(immobilisée)形式用于本发明的范围中。在酯交换阶段期间使用白地霉的脂肪酶的条件是以下的：-温度20至40℃，优选地大约30℃；-脂肪酶/底物比例大于或等于0.5%；-充分搅拌以便良好的均化间歇类型的反应介质，或者足够的流速以便最佳的接触时间(催化床)；-大气压或更高，这取决于所进行的方法。在低温和接近于大气压力的压力下进行该方法。停留时间也是受限制的，因为不意图将全部脂肪族链转化，而仅仅是存在的杂质(非蓖麻油酸的脂肪酸)。在一个实施方案变化中，含源于根据本发明方法的蓖麻油酸酯的级分c可以有利地直接用于合成11-氨基十一烷酸。当蓖麻油酸酯不是足够纯的，另外的提纯步骤可能是必需的，然后使其经受热解反应。这样获得的11-氨基十一烷酸主要地意图于根据以下系列反应通过聚酰胺11或rilsan®11的缩合来合成：-裂解或裂化蓖麻油酸酯，特别地甲酯，产生庚醛和十一碳烯酸甲酯；-十一碳烯酸甲酯的水解，产生十一烯酸；-十一烯酸的溴氢化，产生11-溴十一烷酸，和-11-溴十一烷酸的胺化，产生11-氨基十一烷酸。根据一种实施方案变化，富集非ar的脂肪酸的酯的级分b经受一系列的化学和/或物理反应，产生生物柴油。在这种情况下，脂肪酸酯可以通过各种另外的分离技术经受分离反应，例如通过蒸馏，包括分子蒸馏，通过液-液萃取(在甲醇/己烷介质中的逆流色谱)或通过模拟移动床色谱分离。当阅读以下非限制性示范性实施方案后，本发明将更清楚地被理解。1.蓖麻油的脂肪酸组成分析来源于印度的蓖麻油的样品其的脂肪酸组成。为该测定，根据包括两个相继步骤的程序，将油转化为甲酯：碱性甲醇醇解，随后酸性酯化。在第一步骤中，甘油酯(甘油单、二和三酯)通过甲醇钠的作用，被转化为甲酯，游离脂肪酸，其可能存在，被转化为皂。在第二步骤期间，添加乙酰氯的甲醇溶液导致这些皂转化为甲酯。然后通过气相色谱法(agilent6890系列gc，装备有火焰电离检测器-fid)分析这样获得的甲酯。在supelcowax10柱(agilenttechnologies，30m×0.32mm×0.25μm；载体气体：1ml/分钟的氦；最初的烘箱温度150℃，5℃/分钟的温度程序直至225℃并且在这一温度保持7分钟)上进行分离。通过这种技术识别的主要的脂肪酸是：-蓖麻油酸86.0wt%；-亚油酸5.3wt%；-油酸4.1wt%；-硬脂酸1.5wt%；-棕榈酸1.3wt%。2.生产白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶使用文件de4124248中描述的操作规程获得来源于这种酵母的胞外脂肪酶的粗制提取物。此外，利用重组技术通过巴斯德毕赤氏酵母(yeastpichiapastoris)的发酵也获得脂肪酶。因此，在30小时的发酵后，收集含胞外脂肪酶的发酵上清液。在这个阶段，上清液特征在于蛋白质浓度为2.46mg/ml并且对油酸乙酯测量的特定的水解活性(30℃)为90u/毫升(其中u=1μmol的水解的乙酯/每分钟，在30℃，ph6.5)。然后，上清液经受一系列过滤，目的在于使其澄清并且将其浓缩，而没有影响脂肪酶的特定活性，其包含：i)膜微量过滤(中止阈值5μm然后0.45μm)，膜超滤，目的在于将上清液浓缩14倍，然后用50mm磷酸钠缓冲溶液(ph6.5)渗滤。所获得的浓缩物的蛋白质含量为18mg/ml，对于油酸乙酯的特定活性为522u/毫升，对于橄榄油的特定活性为900u/毫升(30℃)。脂肪酶的固定从白地霉提取的脂肪酶的混合物(或根据上述规程在发酵后获得的浓缩物)被固定在选自以下的载体上：-微孔聚丙烯，例如accurel®mp1000型，由accurelsystems,membarnagmbh,obernburg,germany制造；-deae纤维素；-celite(硅藻土)。举例来说，将白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶固定在accurel®mp1000上包括，在第一步骤中，物理吸附，接着在第二步骤中在戊二醛的存在下交联。3.在甲醇的存在下在酯交换反应中在模拟底物（modèle）上白地霉的游离类型选择性(typoselective)脂肪酶的活性和特异性在甲醇的存在下在酯交换反应中白地霉的游离类型选择性(typoselective)脂肪酶的活性可与商品化酶(南极假丝酵母b，n®435，novonordisk；米根霉，fap15®,amano；r.mieihei，lipozymerl-im，novozymes；tl-im，lipozyme，novozymes)(c.antarcticab,n®435,novonordisk;r.oryzae,fap15®,amano;r.mieihei,lipozymerl-im,novozymes;tl-im,lipozyme,novozymes)的活性相比。油酸、亚油酸和蓖麻油酸的乙酯(油酸乙酯、亚油酸乙酯、蓖麻酸乙酯（ricinoléated’ethyle）)的等摩尔混合物与酶(脂肪酶/底物重量比：5%)接触。以1.5:1的甲醇/底物摩尔比添加甲醇，并且然后在30℃培养混合物24小时。根据实施例1中详述的方法，通过气相色谱法量化所形成的甲酯。在附图1中给出了所获得的结果，其举例说明用白地霉的游离类型选择性(typoselective)脂肪酶和各种商品化脂肪酶获得的，在甲醇的存在下在酯交换反应中乙酯至甲酯的转化率(24小时，30℃，3份相同样品，脂肪酶/底物比例=1.5%w/w，甲醇/底物摩尔比=1.5:1)。无论酶如何，对于油酸乙酯和亚油酸乙酯来说，获得了40%至50%的转化率。对于蓖麻酸乙酯，仅仅白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶产生了小于40%的转化，值为2%至5%。这些结果表明白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶对油酰基和亚油酰基(linolenoyl)基团的作用的非常强的选择性，并且因此，对蓖麻油酰基(ricinoleoyl)基团的识别力的非常强的选择性。4.在甲醇的存在下在酯交换反应中在蓖麻油上白地霉的游离类型选择性(typoselective)脂肪酶的活性和特异性在分子筛(3埃，perlform，直径2mm)的存在下，其数量为10%w/w的底物(蓖麻油)，在大气压力，在30℃，进行甲醇醇解反应。将白地霉类型选择性(typoselective)脂肪酶浓缩物蛋白/底物比例调节到1.5%w/w并且在反应的0、2和4小时在3次顺序添加中建立4.5:1的甲醇/蓖麻油甘油三酯摩尔比。通过涡旋(10秒)均化整个反应介质。在各个时间，从反应介质中取出等分试样，并且在丙酮/乙腈(1:1v/v)中稀释，然后通过以下所述的色谱技术进行分析。有可能通过薄层色谱法(tlc)和高效液相色谱法(hplc)表征酯交换反应动力学。更具体地说，tlc使显现所形成的脂质实体的类型成为可能，同时在标定曲线确定后通过hplc可以量化这些实体中的一些。通过将以10mg/ml溶解在丙酮/乙腈(50/50v/v)中的样品沉积到预涂有二氧化硅的玻璃板(100×200mm，sig60，merck)上，进行tlc分离。用自动沉积设备(linomativ,camag)进行沉积(10μl)。在用由己烷/二乙醚/乙酸(40:60:1v/v)构成的流动相洗脱后，通过用硫酸铜的饱和溶液和磷酸(50:50v/v)喷雾和培养(10分钟，180℃)显示所存在的实体。通过与标准化合物的比较，确定以下表i中给出的保持系数。脂质种类保持系数*单蓖麻油酸甘油酯0.02非羟基化的甘油单酯0.07二蓖麻油酸甘油酯0.13单羟基化的甘油二酯(1,2)0.17单羟基化的甘油二酯(1,3)0.22三蓖麻精(rrr)0.36蓖麻油酸(ar)0.42二羟基化的甘油三酯0.47蓖麻醇酸甲酯0.58非羟基化的脂肪酸0.65单羟基化的甘油三酯0.69其它酯0.95*保持系数=实体迁移距离/溶剂前沿迁移距离tablei。使用基于泵(p1000xr)、样品转换器(as1000)和光散射检测器(alltech500elsd)的自动系统(thermo-finningan,courtaboeuf,farnce)进行通过hplc的产品分离。使用串联安装的两个interchimc18柱(5μm;4.6×250mm,modulocartqs,lichrosphere500ds2)用于分离。根据丙酮/乙腈/甲酸(70:30:1，v/v；x)和氯仿(y)的混合物的梯度洗脱样品(1mg/ml)。根据以下线性梯度以1ml/min的流速进行洗脱：0分钟100%x，30分钟90%x，50分钟90%x，在5分钟的过程中回到初始条件并且保持这些条件另外的15分钟。在以下表ii中给出了根据上述规程通过hplc分析的主要实体的停留时间。在甲醇的存在下在酯交换期间获得的产品基本上是蓖麻油酸(ar)，亚油酸(al)，油酸(ao)和相应甲酯，蓖麻醇酸甲酯(mear)，亚油酸甲酸(meal)和油酸甲酯(meao)。所分析的实体停留时间(分钟)蓖麻油酸7.2蓖麻醇酸甲酯8.1单蓖麻油酸甘油酯9.3亚油酸9.5二蓖麻油酸甘油酯11.5亚油酸甲酸11.8油酸12.3油酸甲酯14.6三蓖麻精19.8三亚油精22.6表ii。在图2中举例说明了在甲醇的存在下通过白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶催化的酯交换反应期间在蓖麻油中的最初以甘油酯的形式存在的蓖麻油酰基(ricpresentinoleoyl)，亚油酰基(lpresentinoleoyl)和油酰基基团转化为甲酯或相应脂肪酸的动力学(30℃，3份相同样品，脂肪酶提取蛋白质/底物比例=1.5%w/w，在t=0，2和4小时的三次分别添加过程中甲醇/甘油三酯摩尔比=4.5:1)。蓖麻油酰基(ricinoleoyl)，亚油酰基(linoleoyl)和油酰基基团(最初在蓖麻油中酯化)转化为脂肪酸和甲酯导致偏甘油酯级分的出现，其中ar含量在反应0.5至2小时的时候处于其最大值。附图3举例说明了在甲醇的存在下通过白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶催化的蓖麻油的酯交换期间偏甘油酯级分的ar浓度的变化(30℃，3份相同样品，脂肪酶提取蛋白质/底物比例=1.5%w/w，在t=0，2和4小时的三次分别添加过程中甲醇/甘油三酯摩尔比=4.5:1)。5.在甲醇的存在下在酯交换反应中在混合物中的蓖麻油上白地霉的游离类型选择性(typoselective)脂肪酶的活性和特异性在以下全部实施例中，在类似于实施例3中所述的条件下，进行甲醇醇解反应。5.1蓖麻油/三亚油精50/50w/w附图4显示了在甲醇的存在下通过白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶催化的在50:50w/w蓖麻油/三亚油精混合物上进行的酯交换反应期间亚油酰基(linoleoyl)基团和酰基基团转化为甲酯的动力学的比较(30℃，3份相同样品，脂肪酶提取蛋白质/底物比例=1.5%w/w，在t=0，2和4小时的三次分别添加过程中甲醇/甘油三酯摩尔比为4.5:1)。在6小时的反应中达到了最初在油混合物中酯化的亚油酰基(linoleoyl)基团的80%的转化率。在反应产品中蓖麻油酰基(ricinoleoyl)基团与全部蓖麻油酰基(ricinoleoyl)和亚油酰基(linoleoyl)基团的比例表征了脂肪酶对蓖麻油酰基(ricinoleoyl)基团的识别力，并且相反地，其对亚油酰基(linoleoyl)基团的选择性。与这种甲醇醇解反应平行，由脂肪酶浓缩物提供的水分子导致通过水解反应形成游离脂肪酸(ar，al)。这种识别力在甲醇醇解反应中大于在水解反应中，如附图5中所表示的。该图举例说明了[ar/(ar+al)]和[mear/((mear+meal))]比例的变化，其代表了在甲醇的存在下通过白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶催化的在50:50w/w蓖麻油/三亚油精混合物上进行的酯交换反应期间白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶对蓖麻油酰基(ricinoleoyl)基团的识别力和其对于亚油酰基(linoleoyl)基团的选择性(30℃，3份相同样品，脂肪酶提取蛋白质/底物比例为1.5%w/w，在t=0，2和4小时的三次分别添加过程中甲醇/甘油三酯摩尔比为4.5:1)。最后，这种识别力导致在6小时的反应后将最初的35%的ar浓度(在起始油混合物中以甘油酯的形式的ar)富集为反应介质的偏甘油酯级分中的多于77%，如在附图6中所表示的，其举例说明了在甲醇的存在下通过白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶催化的50:50w/w蓖麻油/三亚油精混合物的酯交换期间偏甘油酯级分的ar浓度的变化(30℃，3份相同样品，脂肪酶提取蛋白质/底物比例为1.5%w/w，在t=0，2和4小时的三次分别添加过程中甲醇/甘油三酯摩尔比为4.5:1)。5.2蓖麻油/三亚油精10/90w/w比较在甲醇的存在下通过白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶催化的在90:10w/w蓖麻油/三亚油精混合物上进行的酯交换反应期间亚油酰基(linoleoyl)基团和酰基基团转化为甲酯的动力学(30℃，3份相同样品，脂肪酶提取蛋白质/底物比例为1.5%w/w，在t=0，2和4小时的三次分别添加过程中甲醇/甘油三酯摩尔比为4.5:1)，并且所获得的结果示于附图7中。图8显示了[ar/(ar+al)]和[mear/((mear+meal))]比例的变化，其代表了在甲醇的存在下在90:10w/w蓖麻油/三亚油精混合物上进行的酯交换反应期间白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶对蓖麻油酰基(ricinoleoyl)基团的识别力和其对于亚油酰基(linoleoyl)基团的选择性(30℃，3份相同样品，脂肪酶提取蛋白质/底物比例为1.5%w/w，在t=0，2和4小时的三次分别添加过程中甲醇/甘油三酯摩尔比为4.5:1)。图9显示了在甲醇的存在下通过白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶催化的90:10w/w蓖麻油/三亚油精混合物的酯交换期间偏甘油酯级分的ar浓度的变化(30℃，3份相同样品，脂肪酶提取蛋白质/底物比例为1.5%w/w，在t=0，2和4小时的三次分别添加过程中甲醇/甘油三酯摩尔比为4.5:1)。5.3蓖麻油/亚麻子油50/50w/w以与蓖麻油的混合物形式使用的亚麻子油由主要地包括亚油酰基(linolenoyl)(45%)，亚油酰基(linoleoyl)(25%)和油酰基(19%)基团的甘油酯组成。在类似于实施例3中所述的反应条件下，在2小时后达到17%的这些酰基至甲酯的总转化率。于是，甲酯级分中蓖麻醇酸甲酯(mear)的水平是6%。这些结果表明白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶对亚油酰基(linolenoyl)基团的选择性类似于对亚油酰基(linoleoyl)基团的选择性。5.4蓖麻油/亚麻子油10/90w/w在类似于实施例3中所述的反应条件下，在2小时后达到12%的这些酰基至甲酯的总转化率。然后，甲酯级分中蓖麻醇酸甲酯(mear)的水平是2%。6.在甲醇的存在下在酯交换反应中在混合物中的蓖麻油上白地霉的固定类型选择性(typoselective)脂肪酶的活性和特异性在甲醇的存在下在50:50w/w蓖麻油/三亚油精混合物上在酯交换反应中(30℃，3份相同样品，酶/底物比例为1.5%w/w，甲醇/甘油三酯摩尔比为1.5:1)测试固定在accurel®mp1000载体上的白地霉的类型选择性(typoselective)脂肪酶。图10举例说明了在甲醇的存在下通过白地霉的固定的类型选择性(typoselective)脂肪酶催化的在50:50w/w蓖麻油/三亚油精混合物上进行的酯交换反应期间(30℃，3份相同样品，酶/底物比例为1.5%w/w，甲醇/甘油三酯摩尔比为1.5:1)最初以甘油酯的形式的蓖麻油酰基(ricinoleoyl)和亚油酰基(linoleoyl)基团转化为甲酯或相应的脂肪酸的动力学。这些结果表明固定的脂肪酶保持了其对亚油酰基(linoleoyl)基团的非常强的选择性，尽管它的活性显著地下降。固定的酶的水合(aw=0.96)导致水解反应并且与甲酯一起出现游离脂肪酸。当前第1页12当前第1页12