一株高效转化人参皂苷Rb1为Rd木豆内生真菌及应用的制作方法

本发明涉及一株高效转化人参皂苷rb1为rd的内生真菌及其应用，属于微生物技术应用领域。

技术背景

植物内生真菌(endophyticfungi)是指在其生活史的某一阶段在植物组织内生活，但没有引起植物明显病害症状的真菌。通过与药用植物的“协同进化”，某些内生真菌具有了产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质的能力(陈立军等，2006)。内生真菌具有丰富的物种多样性，其次生代谢产物也十分丰富。通过对内生真菌的营养培养以及发酵培养可以产生一系列的酶类，这些微生物来源的酶类可与底物发生作用，使其结构发生变化，因此，内生真菌这类微生物转化具备了生物量积累快、转化时间短、转化效率高、便于工业化生产等特点(郭从亮等，2016)。

三七[panaxnotoginseng(burk.)f.h.chen]。俗称山膝、金不换、田七，为伞形目五加科植物，主要分布于云南、广西、四川等地。三七为我国传统名贵中药材，距今已有400多年的应用历史，在国内外久负盛名，自古就有“止血神药”的美称。三七复杂的化学成分是其良好功效的基础，目前从三七中发现的化学成分主要以皂苷类和三七素为主，皂苷类又可分为人参皂苷、三七皂苷和七叶胆皂苷等(中国药典，一部)，其中以人参皂苷rg1和rb1含量最高。三七的药理作用与其本身的化学成分是密不可分的，主要体现在对血液系统、心血管系统、脑血管系统、神经系统、代谢、免疫调节系统等的影响(冯陆冰等，2008)。

人参皂苷rd(ginsenosiderd)，分子式为c48h82o18，属于达玛烷型人参皂苷中的二醇型，为三七中的稀有皂苷。研究发现，人参皂苷rd的药理活性要优于其他主要皂苷，rd是主要皂苷代谢后在肠道中吸收利用的主要形式之一，能够保护心血管及肾脏功能，发挥抗肿瘤、调节免疫等多种药理作用，对于中枢神经系统亦显示出良好的神经保护效应(张琛等，2011)。由于人参皂苷rd在植物中的含量较低，从原植物药材直接提取会造成成本高、目的化合物流失大且原料的收集受到时间和空间的限制，难于形成规模化生产，而通过内生真菌代谢产生的酶对三七人参皂苷进行生物转化，具有反应条件温和、不破坏皂苷结构、专一性强、转化率高、无污染等特点，有望实行大规模的工业化生产。

技术实现要素：

本发明提供了一株高效转化三七人参皂苷rb1为rd的木豆内生真菌(fusariumproliferatum)g11-7及其应用。本发明克服了传统获取方式中含量低，高能耗，污染环境等缺点，可实现规模化生产，具有较高的应用价值。

本发明提供一株高效转化三七人参皂苷rb1为rd的木豆内生真菌及其应用，其特征在于该木豆内生真菌在pda固体培养基培养时，气生菌丝呈白色略带紫色，菌核多呈蓝紫色，当菌核大量存在时，菌落的下表面呈现黑紫色，分生孢子呈黄褐色至橙色，散生或以粘分生孢子团聚生，单孢，无厚垣孢子。

本发明木豆内生真菌菌株，将其基因序列提交至ncbi，通过blast比对，获得基因登录号为ky303906，利用mega6软件构建系统发育进化树，结合形态学观察结果，确定内生真菌g11-7为层生镰刀菌(fusariumproliferatum)。

本发明木豆内生真菌层生镰刀菌(fusariumproliferatum)g11-7，已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno:13195，保藏日期为2016年12月7日。该菌株具有将三七人参皂苷rb1高效转化为rd的能力及其实验表明人参皂苷rd产生了很好的转化效果。

附图说明

图1为人参皂苷rb1、rd结构式；

图2为木豆内生真菌g11-7菌落形态图；

图3为木豆内生真菌g11-7在光学显微镜下的孢子形态图；

图4位木豆内生真菌g11-7菌株在纤维素-刚果红培养基上的菌落及透明圈形态图；

图5为层生镰刀菌(fusariumproliferatum)g11-7菌株的系统发育进化树；

图6为三七人参皂苷rb1、rd经内生真菌g11-7转化前后的hplc图；

具体实施方式

实施例1：本发明中层生镰刀菌(fusariumproliferatum)g11-7的分离。

本实施方式中层生镰刀菌(fusariumproliferatum)g11-7，该菌株从健康的木豆根中分离得到,木豆根采自东北林业大学植物园,植株年龄3个月,其样本现存于东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室；它按照以下步骤进行分离培养：

(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)的配制：选择成熟、表面光滑、无芽无溃烂的马铃薯洗净去皮，称取200g马铃薯切块，沸水煮30min，经4层纱布过滤后得到的马铃薯液中加入葡萄糖20g、琼脂粉20g，添加蒸馏水定容至1l，ph自然，121℃高温高压灭菌15min；

(2)取健康木豆植株，用蒸馏水清洗植株表面，依次用75％乙醇漂洗1min、5％naclo溶液漂洗5min、10％双氧水漂洗3min进行表面消毒，用无菌水冲洗3-4次；

(3)将消毒之后的木豆根、茎、叶组织分别用灭菌的手术刀切成直径约1cm的小块组织，用无菌的镊子将小块组织接种于pda固体培养基表面，放置于恒温箱中，28℃恒温倒置培养7-10天；

(4)观察培养基上从各植物组织块内部向周围长出的菌丝，采用尖端菌丝挑取法，用无菌牙签，挑取样品的不同部位边缘切口处长出的菌丝，转接到新鲜配置pda培养基平板上，28℃恒温培养，待新的菌落长出后，再次挑取其尖端菌丝，转接到pda培养基平板上，如此重复操作4次以上，直至得到纯化的单一菌株为止(如图2、图3)；

(5)将分离到的真菌菌株编号，分别接种于pda斜面，于4℃条件下保存；

(6)分子鉴定:木豆内生真菌发酵液经四层纱布过滤获得菌丝体，提取菌丝总dna后进行目的片段的pcr扩增，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，所测定的核普酸序列在ncbi数据库中进行blast同源性比对,并根据分子生物学研究的基本原理选择相应种属代表菌株的its序列，应用软件mega6以近邻结合法(neighbor-joining)构建系统发育树，确定目标菌株的分类地位。

实施例2：本发明中定向转化三七人参皂苷rb1为rd的层生镰刀菌(fusariumproliferatum)g11-7菌株的筛选。

(1)筛选培养基的配制：纤维素-刚果红固体培养基含有0.2％羧甲基纤维素钠，0.2％(nh4)2s04，0.05％mgso4·7h2o，0.1％kh2p04，1.5％琼脂，调ph为7.0，121℃高温高压灭菌15min；

(2)取所述的木豆内生真菌菌株接种到纤维素-刚果红固体培养基中，培养至长出规则菌落，在菌落上覆盖质量浓度为1mg/ml的刚果红溶液，10～15min后，倒去刚果红溶液，加入物质的量浓度为lmol/l的naci溶液，15min后倒掉nacl溶液，此时，产生纤维素酶的菌落周围将会出现透明圈，透明圈直径与菌落直径的比值越大说明所产纤维素酶的活力越高；

(3)实验结果表明：通过纤维素-刚果红固体培养基的筛选，确定了一株名为g11-7的木豆内生真菌，该菌株的透明圈与菌落直径的比值为1.23(见图4)，选取g11-7菌株进行后续的转化实验。

实施例3：本发明中层生镰刀菌(fusariumproliferatum)g11-7菌株定向转化三七人参皂苷rb1为rd。

(1)菌种活化：将所述的木豆内生真菌层生镰刀菌(fusariumproliferatum)g11-7接种到pda固体斜面培养基上培养7-10天；

(2)转化培养基的配制：选择成熟、表面光滑、无芽无溃烂的马铃薯洗净去皮，称取200g马铃薯切块，沸水煮30min，经4层纱布过滤后得到的马铃薯液定容至1l，ph自然；

(3)三七药材原粉的预处理：将三七原药材粉碎后过40目筛，得到三七原药材粉末，向50ml转化培养基中添加2g三七药材原粉，121℃高温高压灭菌40min；

(4)发酵转化：取步骤1中生长的斜面菌种g11-7，将菌种表面孢子刮取下来制成一定浓度的孢子悬液，向经过预处理的三七药材原粉中加入10ml孢子悬液进行生物转化，转化温度为30℃，转速为120r/min，转化时间为48h；

(5)人参皂苷的提取：通过离心去除菌丝体与三七药材原粉，得到上清液，将正丁醇与上清液进行等体积萃取，重复操作三次，合并有机相并减压浓缩，得到人参皂苷粗提物。

实施例4：本发明中层生镰刀菌(fusariumproliferatum)g11-7菌株定向转化三七人参皂苷rb1为rd的检测。

高效液相色谱检测转化产物步骤如下:将人参皂苷粗提物经色谱甲醇稀释后,用高效液相色谱仪进行分析检测。色谱条件为agilent1100色谱仪，hiqsilc18w(5μm)色谱柱，流动相：水(a)-乙腈(b)，柱温30℃；检测波长203nm，流速0.8ml/min，进样量10μl，梯度洗脱条件：0-5min,25-30％(b)；5-15min,30-40％(b)；15-16min,40-41％(b)；16-20min,41-42％(b)；20-30min,42-50％(b)；30-35min,50-60％(b)；35-60min,60-40％(b).

检测结果表明：采用本发明木豆内生真菌g11-7菌株进行发酵生物转化，每升发酵液中人参皂苷rd的含量从118.36mg增加到478.44mg[如图6所示]。同时，转化三七人参皂苷rb1为rd所需时间短、转化率高、绿色无污染，可实现规模化生产，具有较高的应用价值。