一种调控人体固有免疫的全人源单克隆抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种全人源单克隆抗体及其制备方法和应用，特别涉及一种调控人体固有免疫的全人源单克隆抗体及其制备方法和在调控人体固有免疫中的用途，本发明属于医药技术领域。

背景技术：

单克隆抗体(monoclonalantibody)是继疫苗、重组蛋白后最重要的一类生物技术产品，具有明确的作用位点，与靶位点亲和力高，已成功应用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等。单抗技术经历40年的发展，经历鼠源性(murine)、嵌合体(chimeric)、人源化(humanize)和全人源(fullhuman)四个阶段(图1)。鼠源性单抗由鼠杂交瘤细胞分泌，免疫原性非常强，可诱导产生人抗鼠抗体，毒副作用明显；嵌合体单抗是将鼠源性单抗的fab段保留，fc段为人源性；人源化抗体是指抗体的恒定区部分(即ch和cl区)由人类抗体基因所编码；全人源单抗是指所有部分均由人类抗体基因所编码。全人源单克隆抗体不良反应小、半衰期长，疗效好，是未来研究发展的方向。全人源单克隆抗体靶向性强，特异性高、毒副作用低，在疾病机制的研究、疾病的诊断和治疗领域中得到了有力推广。

全人源单克隆抗体tanibirumab进行玻璃体内注射，具有抗血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactorreceptor)2的作用，能部分地抑制大鼠模型激光诱导脉络膜新生血管。胎盘钙粘蛋白(p-cadherin)介导肿瘤细胞的黏附、增殖和侵袭，全人源抗p-cadherin抗体pf-03732010通过干扰p-cadherin信号途径抑制原发肿瘤的生长和转移。

固有免疫是机体抵抗病原微生物的第一道防线，病毒感染后诱导的i型干扰素(interferon,ifn)是人体抗病毒天然免疫反应的重要介导因子。病毒、细菌或其它ifn诱生剂通过与细胞膜作用后，促使i型ifn基因脱抑制而被激活，开始转录形成ifn-α和ifn-β的mrna，并在胞浆核糖体上进一步翻译成i型ifn的前体，i型ifn前体被转运至细胞膜上，前体最终被剪切为成熟的i型ifn。i型ifn信号传导的经典通路——jak/stat(januskinase/signaltransducersandactivatorsoftranscription)路径：ifn-α和ifn-β与其相应的受体偶联后，导致i型ifn受体酪氨酸残基的磷酸化，促使细胞内与受体耦联的jak酪氨酸激酶被激活，jak的活化再进一步促使stat磷酸化，形成同源或者异源二聚体。活化的二聚体与结合蛋白结合组成三聚体，进一步转移到细胞核内，引起一系列抗病毒蛋白(antiviralprotein,avp)基因的表达，从而发挥i型ifn的各种生物学活性。

目前全人源单克隆抗体是治疗性抗体发展的主要方向，本发明通过人源杂交瘤技术获得了全人抗体克隆库，为抗体的制备筛选提供了良好的技术平台，筛选出来的抗体为人体内自然产生的抗体，避免了人源化过程引入的人为加工因素，更符合人体内的自然生理过程，具有广泛的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可用于调控人体固有免疫、激活i型ifn信号系统的全人源单克隆抗体及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

(1)从全人抗体库中筛选获得了一株能够促进i型ifn表达升高的人杂交瘤细胞株。

(2)扩增、纯化该全人源单克隆抗体，评价该抗体对正常肝细胞的安全性。

(3)对获得的单克隆抗体与肿瘤细胞作用进行生物学功能鉴定和比较，结果表明该全人源单克隆抗体能促进i型ifnmrna表达增加，抑制乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus,hbv)hbeag的表达，与hepg2.215细胞(来源于hepg2细胞，里面转染了两段完整的hbv全基因)能够结合。

(4)对产生该抗体的杂交瘤细胞进行抗体基因测序；

(5)将(4)中所述单克隆抗体重链序列和轻链序列克隆到真核表达载体，转染宿主细胞，获得的单克隆抗体再进行亲和力和其他生物学功能比较。

在上述研究的基础上，本发明筛选得到一株能够调控人体固有免疫的全人源单克隆抗体，由轻链和重链组成，所述轻链可变区的氨基酸序列为seqidno.6所示，所述重链可变区的氨基酸序列为seqidno.8所示。

在本发明中，优选的，所述轻链的氨基酸序列如seqidno:3所示，所述重链的氨基酸序列如seqidno:4所示。

本领域技术人员将知晓的是，抗体中的保守性氨基酸替换并不会实质性地影响抗体的亲和力和结构，尤其是所述保守性替换发生在恒定区时。因此，若氨基酸的变化发生在恒定区且变化后并不影响抗体的生物学活性，那么该抗体也应在本发明的保护范围之内。

进一步的，本发明还提出了包含所述全人源单克隆抗体的单个重链和/或单个轻链的单域抗体、嵌合抗体、抗体融合蛋白抗体、抗体/抗体片段-因子融合蛋白或抗体/抗体片段-化学偶联物。以及

所述的全人源单克隆抗体的抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段可选自fab、fab'、f(ab')2、scfv、fv、dsfv、双抗体、fd和fd'片段。

再进一步的，本发明还提出了一种分离的dna分子，其为编码所述的抗体或所述的抗原结合片段的核苷酸序列，优选的，所述的核苷酸序列包含seqidno:5和/或seqidno:6所示的核苷酸序列，更优选的，所述的核苷酸序列包含seqidno:1和/或seqidno:2所示的核苷酸序列。

含有所述的核苷酸序列或其组合的重组dna表达载体以及含有所述的核苷酸序列或所述的重组dna表达载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内，优选的，所述的宿主细胞选自原核细胞、酵母或哺乳动物细胞，更优选的，所述宿主细胞选自hek293f细胞、cho细胞或nso细胞。

所述hek293f细胞为人胚肾293f细胞(humanembryonickidney293fcell)；cho细胞为中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovarycell)；nso细胞为小鼠nso胸腺瘤细胞(mousethymomansocells)。

更进一步的，本发明还提出了所述的抗体、所述的抗原结合片段、所述的核苷酸序列、所述的载体或所述的宿主细胞在制备调控人体固有免疫，激活i型ifn信号系统的药物中的用途，所述药物是用于预防和治疗感染性疾病、肿瘤及免疫系统疾病。

其中，优选的，所述感染性疾病包括但不限于hiv病毒感染、甲型、乙型和丙型肝炎病毒感染、疱疹病毒感染、流感病毒感染、柯萨奇病毒感染、呼吸道合胞病毒感染、人乳头瘤病毒感染、eb病毒感染、肠道病毒71型感染；所述肿瘤包括但不限于胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴癌、黑色素瘤、急性或慢性白血病、肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌、头颈癌、结直肠癌、实体瘤；所述免疫系统疾病包括不限于系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、重症肌无力、多发性硬化症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、硬皮病、结节性多动脉炎、wegener肉芽肿病。

更进一步的，本发明还提出了制备调控人体固有免疫的全人源单克隆抗体的方法，包括如下步骤：

(1)提供表达载体，所述表达载体含有编码抗体或抗原结合片段的dna分子，以及与所述dna分子可操作相连的表达调控序列；

(2)用所述表达载体转化宿主细胞；

(3)在适合表达所述抗体的条件下，培养含有所述表达载体的宿主细胞；

(4)分离纯化获得所述的单克隆抗体；

其中，优选的，所述的表达载体为含有抗体分泌信号肽序列的真核表达载体pcdna3.4，所述的宿主细胞为hek293f细胞。

本发明提供的单克隆抗体可以通过调控人体固有免疫，激活i型ifn信号系统来预防和治疗疾病，本发明提供的单克隆抗体是全人源的，与其它动物源性(如鼠源性)的单克隆抗体相比，因物种差异导致的免疫原性大大减少，且特异性好、亲和力高，如果用于临床将大大降低副作用。在疾病的预防和治疗方面将具有良好的应用前景。

附图说明

图1为单克隆抗体技术发展的四个阶段；

图2为全人源单克隆抗体对人肝癌细胞系hepg2细胞(humanliverhepatocellularcells)中i型ifn表达的影响；

各组均与对照组mock比较，**p<0.01，***p<0.001；

图3为全人源单克隆抗体对hepg2.215细胞i型ifn表达的影响；

各组均与对照组mock比较，***p<0.001；

图4为全人源单克隆抗体对人正常肝细胞lo2细胞(humannormallivercells)增殖的影响；

图5为全人源单克隆抗体鉴定的蛋白电泳图；

a：sds-page电泳；b：westernblot实验；

图6为pcdna3.4质粒图谱；

图7为全人单克隆抗体对hbeag表达的影响；

3b5组与对照组mock比较，***p<0.001；

图8为全人单克隆抗体与hepg2.215细胞的结合情况。

具体实施方式

本发明详细的实施方法参见实施例，实施例中所述的实验方法和试剂，若无特殊说明均为常规实验方法和试剂。以下实施例仅用于说明和解释本发明，而不是以任何方式限制本发明。

实施例1、调控人体固有免疫的单克隆抗体的筛选

采用人源b细胞克隆技术建立全人源单克隆抗体库。hepg2细胞接种96孔板，将全人源单克隆抗体库中的抗体分别加入培养的hepg2细胞中，作用48h后，trizol试剂收取细胞，提取rna，进行rt-pcr获得cdna。利用genrunner及参考国外文献设计real-timepcr引物，采用takara公司生产的sybr试剂盒，罗氏定量pcr仪进行扩增。分析方法：根据循环数cp值，采用2^-△△cp法分析mrna表达情况。结果表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。

计算公式为：△△cp＝(cp目标基因-cp管家基因)实验组-(cp目标基因-cp管家基因)对照组

检测i型ifnmrna的表达水平，从而分析抗体对hepg2细胞i型ifn表达的影响。

通过该方法最终从全人抗体库中筛选获得了一株能够促进i型ifn表达升高的人杂交瘤细胞株，命名为3b5，该全人源单克隆抗体能够促进i型ifnmrna的产生(图2)。hepg2.215细胞获得了相似的结果，该全人源单克隆抗体能够促进ifn-α和ifn-βmrna的表达(图3)。

实施例2、评价全人源单克隆抗体3b5对lo2细胞的安全性

mtt实验研究全人源单克隆抗体3b5对lo2细胞增殖的影响。单克隆抗体作用于lo2细胞24h、48h、72h后，每孔加mtt溶液(5mg/ml用pbs配制，ph＝7.4)20μl。继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，。每孔加150μldmso，振荡10min，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。结果如图4所示，图4结果表明，该抗体对lo2细胞无抑制作用，说明该全人源单克隆抗体使用浓度对正常肝细胞的增殖无影响。

实施例3、纯化调控人体固有免疫的单克隆抗体

将实施例1获得的调控人体固有免疫阳性的杂交瘤细胞株3b5进行扩大培养，收集无血清细胞培养上清，蛋白电泳检测抗体表达，如图5。经过proteina亲和柱纯化，进行脱盐和浓缩、抽真空冻干后，获得纯化的单克隆抗体。

实施例4、抗体dna重组质粒构建与表达

将实施例1获得的调控人体固有免疫阳性的杂交瘤细胞3b5进行抗体全基因测序，获得抗体轻链和重链的基因序列：所述轻链(1g3-l1)的核苷酸序列为seqidno.1，氨基酸序列如seqidno.3所示，所述重链(1g3-h1)的核苷酸序列为seqidno.2，氨基酸序列如seqidno.4所示。

其中，轻链可变区核苷酸酸序列为seqidno.5，对应氨基酸序列为seqidno.6。重链可变区核苷酸酸序列为seqidno.7，对应氨基酸序列为seqidno.8。

将上述轻链和重链基因分别克隆至装有抗体分泌信号肽序列的真核表达载体pcdna3.4(图6)中。瞬时转染hek293f细胞，进行全抗体表达，蛋白电泳检测抗体表达，如图5。使用proteina亲和柱纯化获得抗体蛋白。

实施例5、全人单克隆抗体对病毒增殖的调控作用

全人源单克隆抗体3b5作用于hepg2.215细胞48h，elisa方法检测抗体对hbeag的影响，将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，5％小牛血清置37℃封闭40min，洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。加入待检测样品，置于37℃，60min，用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。加入酶标抗体，37℃1h。加入底物液，置37℃避光放置3-5min，加入终止液显色，采用490nm波长进行检测。结果显示全人单克隆抗体明显抑制hbeag的表达(图7)。

实施例6、调控人体固有免疫的单克隆抗体的细胞内结合实验

以hepg2.215细胞为底物，用正常人血清作为阴性对照(nc)，分析全人源单克隆抗体3b5的荧光分布。培养细胞在经4％多聚赖氨酸预处理的盖玻片上(盖玻片放置于6孔培养板内)培养，用预冷的0.1mpbs冲洗，4％的多聚甲醛固定30min，山羊血清封闭30min(37℃)；一抗孵育，4℃过夜，阴性对照用0.1mpbs代替一抗；0.1mpbs冲洗3次；fitc-标记的抗人igg，孵化37℃1h；pbs冲洗3次，荧光显微镜下观察。结果如图8所示，说明全人源单克隆抗体3b5与hepg2.215细胞能够结合。

对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采取了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其他场合的，均在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>哈尔滨医科大学

<120>一种调控人体固有免疫的全人源单克隆抗体及其制备方法和应用

<130>klpi170019

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<170>patentin3.5

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