一种利西拉来的制备方法与流程

本发明涉及多肽药物合成技术领域，尤其涉及一种利西拉来的制备方法。

背景技术：

利西拉来(lixisenatide)是胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂，是基于具降糖活性的glp-1类似物exendin-4的c末端6个赖氨酸残基的修饰而合成的新型glp-1类似物，能耐受体内二肽基肽酶ⅳ(dpp4)的降解作用。利西拉来的结构如式i所示：

其肽序为：

h-his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-met-glu-glu-glu-ala-val-arg-leu-phe-ile-glu-trp-leu-lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-ser-lys-lys-lys-lys-lys-lys-nh2

作为glp-1类似物的一种，利西拉来适用于服用二甲双胍、磺脲类、噻唑烷二酮类、二甲双胍和磺脲类联用、二甲双胍和噻唑烷二酮类联用的ii型糖尿 病患者中，不能有效控制血糖的患者的辅助治疗，以改善对血糖的控制。

目前一种常规合成利西拉来的方法是固相逐步合成(spps)法，该方法具有操作简单、设备要求低等特点。但是因为利西拉来由44个氨基酸组成，固相逐步合成法的产品收率低，肽在合成树脂上容易发生二级结构的弯曲，导致反应位点被包裹，得到的利西拉来粗肽纯度低，杂质繁杂，给产品纯化带来困难，不易得到较高纯度的利西拉来。

对于解决偶联困难的氨基酸问题，片段合成法是固相合成方法中一种常用的手段。片段合成法是先将偶联困难的序列制备成全保护肽片段，按照氨基酸序列将其作为整体直接偶联到指定肽树脂上，从而避开偶联困难的氨基酸位点，避免逐个氨基酸偶联产生的缺损等副反应，能够获得纯度相对高的粗肽，降低纯化难度。但片段合成法采用了常规的树脂外，还需使用大量价格较昂贵的2-ctc树脂制备片段肽树脂，且2-ctc树脂酸敏感性高，偶联时肽容易从树脂上脱落，从而导致制备的片段收率不高，操作步骤相对繁琐，生产成本也大幅度提高。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种利西拉来的制备方法，该方法操作简便，总收率高，所得产物纯度较高。

本发明提供了一种利西拉来的制备方法，包括：

步骤1：固相合成fmoc-lys-树脂；

步骤2：根据利西拉来的肽序在所述fmoc-lys-树脂上偶联氨基酸或二肽制得利西拉来肽树脂；所述二肽选自-gly-thr、-phe-thr、-thr-ser、-leu-ser、-ser-ser或-pro-ser；

步骤3：所述利西拉来肽树脂经裂解制得利西拉来。

本发明提供的方法将利西拉来肽序中第4～5位(-gly-thr，记为二肽a)、第6～7位(-phe-thr，记为二肽b)、第7～8位(-thr-ser，记为二肽c)、第10～11位(-leu-ser，记为二肽d)、第32～33位(-ser-ser，记为二肽e)或第31～32位、第37～37位(-pro-ser，记为二肽f)的氨基酸以二肽为原料进行偶联，选用的二肽原料为二肽a～f中任一种或多种，不采用二肽为原料的位点则采用单个氨基酸为原料进行偶联。该方法能够有效防止肽键旋转，抑 制肽链卷曲剂收缩，使活性官能团(伯胺)充分暴露，从而有利于氨基酸的偶联，减少缺损等副反应的发生。

在本发明的实施例中，

偶联-gly-thr采用fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh；

偶联-phe-thr采用fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh；

偶联-thr-ser采用fmoc-thr(tbu)-ser(psime,mepro)-oh；

偶联-leu-ser采用fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh；

偶联-ser-ser采用fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh；

偶联-pro-ser采用fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh。

其中，fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh的结构如式ii-a；

fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh的结构如式ii-b；

fmoc-thr(tbu)-ser(psime,mepro)-oh的结构如式ii-c；

fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh的结构如式ii-d；

fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh的结构如式ii-e；

fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh的结构如式ii-f。

在本发明中，fmoc-lys-树脂的树脂为rinkamide树脂、rinkamide-mbha树脂、rinkamide-am树脂或siber树脂。

其中，lys的保护基为boc。

作为优选，fmoc-lys(boc)-树脂的替代度为0.1mmol/g～0.6mmol/g。优选的，替代度范围为0.2mmol/g～0.4mmol/g。

在本发明的实施例中，偶联的偶联剂为hobt与dic的混合物；其中hobt与dic的摩尔比为1:1。

在本发明中，所述偶联的步骤包括：脱除fmoc保护后，以dcm和dmf的混合液为溶剂，与偶联剂混合后进行偶联反应。

作为优选，脱除保护的树脂与待偶联氨基酸的摩尔比为1:3。

重复偶联的步骤直至合成整个肽链。

在本发明中，偶联反应的条件为室温反应2h。所述室温为10℃～30℃。

作为优选，如偶联反应不完全则继续偶联反应1h。

在本发明中，偶联反应结束后以甲醇收缩，树脂真空干燥过夜。

在本发明的实施例中，裂解的裂解剂为裂解的裂解剂包括tfa与b组分；所述b组分选自phsme、phome、edt、h2o、tis或phoh。

作为优选，裂解剂中tfa、phsme、phome、edt、h2o、tis、phoh的体积比为(80～90)：(0～5):(0～3):(0～5):(0～5)：(0～2)：(0～5)。

优选的，裂解液中tfa、phsme、edt、tis、h2o的体积比为84:5:5:5:1。

优选的，裂解剂中tfa、phsme、edt、h2o的体积比为91:3:3:3。

优选的，裂解剂中tfa、phsme、edt、phome的体积比为90:5:3:2。

优选的，裂解剂中tfa、edt、h2o的体积比为90:5:5。

优选的，裂解剂中tfa、phsme、phoh、edt、h2o的体积比为85:5:3:5:2。

在本发明中，裂解的步骤包括：将利西拉来肽树脂与裂解液混合，室温裂解2.5h～3h后，以tfa洗涤树脂、以无水乙醚沉淀，获得利西拉来线性粗肽。

作为优选，无水乙醚沉淀的温度为0～4℃。

作为优选，利西拉来肽树脂与裂解液的质量-体积比为1:8～15。

在本发明的实施例中，步骤3后还包括纯化、转盐的步骤。

具体的，纯化的色谱采用novaseprp-hplc系统，检测波长220nm，色谱柱为反相c18柱，流动相a相为体积分数为0.1％的tfa水溶液，流动相b相为乙腈。洗脱梯度为18％乙腈-48％乙腈45min，48％等度15min：纯化后经转盐色谱，转盐。

具体的转盐为转化为醋酸盐，盐酸盐，枸橼酸盐，磷酸盐，三氟乙酸盐，钠盐，钾盐或铵盐。

在一些实施例中，仅引入二肽a，二肽c、二肽d、二肽e、二肽f，制备利西拉来。

偶联具体为依次偶联：fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-ser(psime，mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime，mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime，mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-ser(psime，mepro)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-gly-thr(psime，mepro)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh和boc-his(trt)-oh。

在一些实施例中，仅引入二肽a，二肽b、二肽d、二肽f，制备利西拉来。

偶联具体为依次偶联：fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、 fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh和boc-his(trt)-oh。

在一些实施例中，仅引入二肽a，二肽b、二肽d、二肽e，制备利西拉来。

偶联具体为依次偶联：fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh和boc-his(trt)-oh。

在一些实施例中，仅引入二肽b、二肽d、二肽e，制备利西拉来。

偶联具体为依次偶联：fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、 fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh和boc-his(trt)-oh。

在一些实施例中，仅引入二肽c、二肽e，制备利西拉来。

偶联具体为依次偶联：fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh和boc-his(trt)-oh。

在一些实施例中，仅引入二肽e，制备利西拉来。

偶联具体为依次偶联：fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、 fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe--oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh和boc-his(trt)-oh。

在一些实施例中，仅引入二肽d，制备利西拉来。

偶联具体为依次偶联：fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe--oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh或boc-his(trt)-oh。

在一些实施例中，仅引入二肽a，二肽b，二肽d，二肽e，二肽f，制备利西拉来。

偶联具体为依次偶联：fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh和boc-his(trt)-oh。

本发明根据利西拉来肽的肽序结构，采用特定的保护的丝氨酸二肽作为 原料偶联到肽序中，由于形成了类似脯氨酸的环状结构，能有效的防止肽键旋转，抑制肽链卷曲剂收缩，使活性官能团(伯胺)充分暴露，从而有利于氨基酸的偶联，减少缺损等副反应的发生。根据实验，本发明精肽收率可高达25.8％～28.8％，优于顺序逐个偶联方法(约15.4％)。同时，本发明精肽的纯度为99.3％。在保证了纯度的同时保证了收率。

附图说明

图1示实施例1制得制得粗肽的质谱图；

图2示对比例1制得制得粗肽的质谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种利西拉来的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试剂或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中，各材料的名称及缩写如表1：

表1各材料的名称及缩写

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

本实施例仅引入二肽a，二肽c、二肽d、二肽e、二肽f，制备利西拉来。

1.1fmoc-lys(boc)-rinkamide-mbharesin的制备

称取干燥rinkamide-mbharesin380g(替代度为0.45mmol/g)加入到固相反应柱中，首先dmf洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积dmf溶胀树脂30分钟，dmf洗涤3次，dcm洗涤2次，等待投料。

在冰浴冷却的条件下，将238.9gfmoc-lys(boc)-oh(510mmol)、72.4ghoat(536mmol)溶于dmf和dcm的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dic67.5g(535mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，dmf洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得fmoc-lys(boc)-rinkamide-mbharesin421克，检测树脂替代度为0.406mmol/g。

1.2lixisenatide肽树脂的制备

取1.1方法制备的替代度为0.406mmol/g的fmoc-lys(boc)-rinkamide-mbharesin421g(230mmol)，加入固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟后，用dblk脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤6次，。将239.1g(510mmol)fmoc-lys(boc)-oh，72.2g(536mmol)hobt，67.7g(535mmol)dic溶于体积比为1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。

重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到2018克lixisenatide肽树脂。

1.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备

取1.2得到的lixisenatide肽树脂700g置于裂解反应器中，以8ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(tfa：phsme：edt：tis：h2o＝84:5:5:5:1，(v/v))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽341g，质谱(图1)maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.216。粗肽重量收率为 99.4％，hplc纯度为69.1％。

取1.3中得到的lixisenatide粗肽44g进行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为反相c18柱，常规0.1％tfa/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽12.6g，hplc纯度99.3％，精肽收率28.8％。

实施例2

本实施例仅引入二肽a，二肽b、二肽d、二肽f，制备利西拉来。

2.1fmoc-lys(boc)-rinkamideresin的制备

称取干燥rinkamideresin356g(替代度为0.42mmol/g)加入到固相反应柱中，首先dmf洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积dmf溶胀树脂30分钟，dmf洗涤3次，dcm洗涤2次，等待投料。

在冰浴冷却的条件下，将210.9gfmoc-lys(boc)-oh(450mmol)、63.8ghobt(473mmol)、170.6ghbtu(450mmol)溶于dmf和dcm的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dipea87.6g(675mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，dmf洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得fmoc-lys(boc)-rinkamideresin390克，检测树脂替代度为0.385mmol/g。

2.2lixisenatide肽树脂的制备

取2.1方法制备的替代度为0.385mmol/g的fmoc-lys(boc)-rinkamideresin421g(150mmol)，加入固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟后，用dblk脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤6次，。将211.3g(450mmol)fmoc-lys(boc)-oh，64.8g(473mmol)hobt，63.9g(473mmol)dic溶于体积比为1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。

重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、 fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到1611克lixisenatide肽树脂。

2.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备

取2.2得到的lixisenatide肽树脂600g置于裂解反应器中，以10ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(tfa：phsme：edt：h2o＝91:3:3:3，(v/v))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽251g，质谱maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.017。粗肽重量收率为101.2％，hplc纯度为66.6％。

取2.3中得到的lixisenatide粗肽47g进行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为反相c18柱，常规0.1％tfa/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽12.4g，hplc纯度99.1％，精肽收率26.4％。

实施例3

本实施例仅引入二肽a，二肽b、二肽d、二肽e，制备利西拉来。

3.1fmoc-lys(boc)-siberresin的制备

称取干燥siberresin155g(替代度为0.35mmol/g)加入到固相反应柱中，首先dmf洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积dmf溶胀树脂30分钟，dmf洗涤3次，dcm洗涤2次，等待投料。

在冰浴冷却的条件下，将77.6gfmoc-lys(boc)-oh(165mmol)、23.5g hobt(173mmol)溶于dmf和dcm的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dic22.1g(173mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，dmf洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得fmoc-lys(boc)-siberresin368克，检测树脂替代度为0.323mmol/g。

3.2lixisenatide肽树脂的制备

取3.1方法制备的替代度为0.323mmol/g的fmoc-lys(boc)-siberresin368g(54mmol)，加入固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟后，用dblk脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤6次，。将77.9g(165mmol)fmoc-lys(boc)-oh，23.5g(173mmol)hobt，22.4g(173mmol)dic溶于体积比为1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。

重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到831克lixisenatide肽树脂。

3.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备

取3.2得到的lixisenatide肽树脂800g置于裂解反应器中，以12ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(tfa：phsme：edt：phome＝90:5:3:2，(v/v))，室温搅拌3h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无 水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽241g，质谱maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.512。粗肽重量收率为98.9％，hplc纯度为68.4％。

取3.3中得到的lixisenatide粗肽50g进行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为反相c18柱，常规0.1％tfa/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽13.7g，hplc纯度99.2％，精肽收率27.4％。

实施例4

本实施例仅引入二肽b、二肽d、二肽e，制备利西拉来。

4.1fmoc-lys(boc)-rinkamide-mbharesin的制备

称取干燥rinkamide-mbharesin135g(替代度为0.24mmol/g)加入到固相反应柱中，首先dmf洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积dmf溶胀树脂30分钟，dmf洗涤3次，dcm洗涤2次，等待投料。

在冰浴冷却的条件下，将46.8gfmoc-lys(boc)-oh(100mmol)、14.2ghobt(105mmol)溶于dmf和dcm的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dic13.5g(105mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，dmf洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得fmoc-lys(boc)-siberresin143克，检测树脂替代度为0.223mmol/g。

4.2lixisenatide肽树脂的制备

取4.1方法制备的替代度为0.223mmol/g的fmoc-lys(boc)-rinkamide-mbharesin143g(32mmol)，加入固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟后，用dblk脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤6次，将45.6g(96mmol)fmoc-lys(boc)-oh，13.8g(101mmol)hobt，12.7g(101mmol)dic溶于体积比为1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。

重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、 fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到401克lixisenatide肽树脂。

4.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备

取4.2得到的lixisenatide肽树脂400g置于裂解反应器中，以15ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(tfa：phsme：edt：phoh：h2o＝85:5:3:5:2，(v/v))，室温搅拌3h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽156g，质谱maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.347。粗肽重量收率为102.6％，hplc纯度为67.9％。

取4.3中得到的lixisenatide粗肽46g进行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为反相c18柱，常规0.1％tfa/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽11.6g，hplc纯度99.3％，精肽收率27.1％。

实施例5

本实施例仅引入二肽c、二肽e，制备利西拉来。

5.1fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin的制备

称取干燥rinkamide-amresin547g(替代度为0.56mmol/g)加入到固相反应柱中，首先dmf洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积dmf溶胀树脂30分钟，dmf洗涤3次，dcm洗涤2次，等待投料。

在冰浴冷却的条件下，将431.2gfmoc-lys(boc)-oh(918mmol)、130.5g hobt(964mmol)溶于dmf和dcm的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dic121.5g(964mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，dmf洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin621克，检测树脂替代度为0.508mmol/g。

5.2lixisenatide肽树脂的制备

取5.1方法制备的替代度为0.508mmol/g的fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin207g(105mmol)，加入固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟后，用dblk脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤6次，。将147.6g(315mmol)fmoc-lys(boc)-oh，44.8g(330mmol)hobt，41.6g(330mmol)dic溶于体积比为1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。

重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-phe--oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到1046克lixisenatide肽树脂。

5.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备

取5.2得到的lixisenatide肽树脂1000g置于裂解反应器中，以10ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(tfa：edt：h2o＝90:5:5，(v/v))， 室温搅拌3h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽487g，质谱maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.109。粗肽重量收率为100.6％，hplc纯度为67.1％。

取5.3中得到的lixisenatide粗肽43g进行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为反相c18柱，常规0.1％tfa/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽11.9g，hplc纯度99.3％，精肽收率28.1％。

实施例6

本实施例仅引入二肽e，制备利西拉来。

6.1fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin的制备

称取干燥rinkamide-amresin547g(替代度为0.56mmol/g)加入到固相反应柱中，首先dmf洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积dmf溶胀树脂30分钟，dmf洗涤3次，dcm洗涤2次，等待投料。

在冰浴冷却的条件下，将431.2gfmoc-lys(boc)-oh(918mmol)、130.5ghobt(964mmol)溶于dmf和dcm的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dic121.5g(964mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，dmf洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin621克，检测树脂替代度为0.508mmol/g。

6.2lixisenatide肽树脂的制备

取6.1方法制备的替代度为0.508mmol/g的fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin137g(70mmol)，加入固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟后，用dblk脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤6次。将98.5g(210mmol)fmoc-lys(boc)-oh，30.6g(220mmol)hobt，27.9g(220mmol)dic溶于体积比为1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。

重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe--oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到728克lixisenatide肽树脂。

6.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备

取6.2得到的lixisenatide肽树脂728g置于裂解反应器中，以10ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(tfa：edt：h2o＝90:5:5，(v/v))，室温搅拌3h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽338.9g，质谱maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.205。粗肽重量收率为99.6％，hplc纯度为61.8％。

取6.3中得到的lixisenatide粗肽58g进行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为反相c18柱，常规0.1％tfa/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽14.9g，hplc纯度99.2％，精肽收率25.8％。

实施例7

本实施例仅引入二肽d，制备利西拉来。

7.1fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin的制备

称取干燥rinkamide-amresin547g(替代度为0.56mmol/g)加入到固相反应柱中，首先dmf洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积dmf溶胀 树脂30分钟，dmf洗涤3次，dcm洗涤2次，等待投料。

在冰浴冷却的条件下，将431.2gfmoc-lys(boc)-oh(918mmol)、130.5ghobt(964mmol)溶于dmf和dcm的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dic121.5g(964mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，dmf洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin621克，检测树脂替代度为0.508mmol/g。

7.2lixisenatide肽树脂的制备

取7.1方法制备的替代度为0.508mmol/g的fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin137g(70mmol)，加入固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟后，用dblk脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤6次。将98.5g(210mmol)fmoc-lys(boc)-oh，31.6g(220mmol)hoat，27.9g(220mmol)dic溶于体积比为1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。

重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe--oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到742克lixisenatide肽树脂。

7.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备

取7.2得到的lixisenatide肽树脂742g置于裂解反应器中，以10ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(tfa：phsme：phoh：edt：h2o＝85:5:3:5:2，(v/v))，室温搅拌3h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽341.3g，质谱maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.318。粗肽重量收率为100.8％，hplc纯度为59.6％。

取7.3中得到的lixisenatide粗肽48g进行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为反相c18柱，常规0.1％tfa/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽12.8g，hplc纯度99.1％，精肽收率26.6％。

实施例8

本实施例仅引入二肽a，二肽b，二肽d，二肽e，二肽f，制备利西拉来。

8.1fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin的制备

称取干燥rinkamide-amresin547g(替代度为0.56mmol/g)加入到固相反应柱中，首先dmf洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积dmf溶胀树脂30分钟，dmf洗涤3次，dcm洗涤2次，等待投料。

在冰浴冷却的条件下，将431.2gfmoc-lys(boc)-oh(918mmol)、130.5ghobt(964mmol)溶于dmf和dcm的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dic121.5g(964mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，dmf洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin621克，检测树脂替代度为0.508mmol/g。

8.2lixisenatide肽树脂的制备

取8.1方法制备的替代度为0.508mmol/g的fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin136g(70mmol)，加入固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟后，用dblk脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤6次。将98.5g(210mmol)fmoc-lys(boc)-oh，31.6g(220mmol)hoat，109.5g (210mmol)pyaop，54.3g(420mmol)dipea溶于体积比为1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。

重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到751克lixisenatide肽树脂。

8.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备

取8.2得到的lixisenatide肽树脂742g置于裂解反应器中，以10ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(tfa：phsme：phoh：edt：h2o＝85:5:3:5:2，(v/v))，室温搅拌3h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽335.6g，质谱maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.478。粗肽重量收率为97.6％，hplc纯度为68.9％。

取8.3中得到的lixisenatide粗肽52g进行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为反相c18柱，常规0.1％tfa/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽14.5g，hplc纯度99.2％，精肽收率27.9％。

对比例1

d1.1fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin的制备

称取干燥rinkamide-amresin410g(替代度为0.56mmol/g)加入到固相反应柱中，首先dmf洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积dmf溶胀树脂30分钟，dmf洗涤3次，dcm洗涤2次，等待投料。

在冰浴冷却的条件下，将323.5gfmoc-lys(boc)-oh(690mmol)、97.9ghobt(725mmol)溶于dmf和dcm的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dic92.4g(725mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，dmf洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin462克，检测树脂替代度为0.51mmol/g。

d1.2顺序偶联制备lixisenatide肽树脂

取d1.1方法制备的替代度为0.51mmol/g的fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin462g(230mmol)，加入固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟后，用dblk脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤6次，。将323.6g(690mmol)fmoc-lys(boc)-oh，98.1g(725mmol)hobt，92.4g(724mmol)dic溶于体积比为1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。

重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、 fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到2350克lixisenatide肽树脂。

d1.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备

称取d1.2得到的lixisenatide肽树脂800克置于裂解反应器中，以12ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(tfa：phsme：phoh：edt：h2o＝85:5:3:5:2，(v/v))，室温搅拌3h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽370.6g，质谱(图2)maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.288。粗肽重量收率为96.8％，hplc纯度为44.5％。

取d1.3中得到的lixisenatide粗肽49g进行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为反相c18柱，常规0.1％tfa/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽7.5g，hplc纯度98.6％，精肽收率15.4％。

实施例9

检测实施例1～8和对比例1制得的精肽。其中，对实施例1制得粗肽的质谱图如图1，对对比例1制得粗肽的质谱图如图2。其他各实施例制得产品的质谱图与此相似。各实施例获得多肽纯度和收率如表2：

表2多肽纯度和收率

结果显示，引入二肽片段的技术方案无论从粗肽纯度、精肽纯度还是精肽收率上都高于对比例方案。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。