本发明涉及高通量测序领域，具体涉及一种引物标签结合深度测序法从外周血游离DNA扩增癌症基因的引物组、标签设计方法及应用。
背景技术：
血浆游离DNA又称cfDNA(cell free DNA)，是指外周中游离于细胞外的DNA，cfDNA的来源既包括正常细胞，也有异常细胞(如肿瘤细胞)或者外源的微生物(如病毒DNA)，具体包括自身正常细胞代谢的凋亡小体，肿瘤细胞碎片，外泌体等。
循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA)ctDNA是指从原发肿瘤甚至是转移形成的新肿瘤细胞破裂掉落下来到循环外周血中的DNA。ctDNA在临床医学中具有重要意义，通过检测ctDNA在肿瘤的早期检测，肿瘤的靶向治疗和后期的疾病监控等方面具有重要的临床价值。
ctDNA与所有cfDNA一样是以核小体微单位，以单个、双联或者三联的形式进入血液，片段长度主要在166bp左右(即缠绕在每个组蛋白上面的DNA的长度)，并逐步分解，通常半衰期只有2个小时。一般10ml外周血中cfDNA含量约在32ng(Newman et al,2016)。
ctDNA含量非常少，以10ml外周血为例，从中可以提取到cfDNA含量约30ng，占总DNA的1％，ctDNA在所有cfDNA中的比例非常少，按1％计算,只有约300pg，也就是大约45个细胞裂解的DNA量，实际情况下，如果是做早期筛查，ctDNA的含量可能更低到10ml外周血中只有1～2个细胞的，所以对检测方法的敏感性要求非常高。
目前用于液体活检中目标基因检测的方法主要分为四类：一代测序(Sanger)，二代高通量测序(NGS)，数字液滴PCR(ddPCR)，和ARMS(又称等位基因特异性PCR)。对于肿瘤基因的筛查来说，NGS检测在同类中的性价比远高过其他几种方法。利用高通量测序技术来测定肿瘤患者中ctDNA片段，根据分析得到的ctDNA所携带的肿瘤基因信息，就能够全面地反映肿瘤的特征。这一技术凭借着准确、灵敏、无创、高通量、可以以相对低的成本一次测上万个位点，甚至更多等特点，可以从肿瘤防治诊断、治疗参考、用药指导、病情监控、复发预警等方面为医生及患者提供有效助力。
中国专利申请(申请号CN201410771006.9)公开了一种利用囊胚腔液游离DNA检测胚胎染色体异常的方法，包括以下步骤：囊胚腔液游离DNA的获取、囊胚腔液DNA的检测、游离DNA全基因组扩增、全基因组扩增产物分析、基因组DNA进行片段化处理、片段化目的DNA进行定量分析和片段大小分析、文库构建、上机测序、生物信息分析。该方法避免了传统的DNA分析方法只能对单细胞基因组的部分区域进行研究的不足，能完整地分析单细胞基因组的遗传信息，操作简便，省时高效；同时，使用囊胚腔液游离DNA作为检测样本，取材方便、安全，导致后期胚胎发育出现异常的概率小，能保证胚胎在后续发育中不会受到影响。
中国专利申请(申请号CN201610018232.9)公开了一种基于大规模数据挖掘的癌症检测试剂盒，所述试剂盒包括：DNA提取试剂盒、高通量测序文库制备试剂、基因序列比对软件、染色体覆盖度计算软件。其中，所述DNA提取试剂用于提取外周血游离DNA，通过所述高通量测序文库制备试剂制备高通量测序文库，通过对测序文库高通量测序，利用所述基因序列比对软件将测序数据与人类参考基因组作比较，通过染色体覆盖度计算软件进行数据分析以区分癌症和非癌症病人，具体操作为：通过计算每一条染色体测序覆盖度，除以总测序量，来计算相对覆盖度；健康情况下，人每条染色体均为两个拷贝，染色体之间的拷贝数差异非常小；反之，如果相对覆盖度超过一定的阈值，则判断为疑似癌症患者。并进一步分析判断肿瘤类型和可能原发灶器官。
然而，目前采用NGS方法的主流检测过程(包括中国专利申请CN201410771006.9、CN201610018232.9中公开的技术方案)均会涉及到PCR扩增和测序，这两个过程都会出现一些系统错误，如illumina Hiseq平台的测序错误率在0.05％，在普通大量样本模板检测中问题并不大，但是，在肿瘤早期筛查中，由于本身模板类就是在万分之一到千分之一的范围之内，这些测序错误跟我们的检测下线在一个数量级，就会对结果造成非常严重的干扰，其次，由于PCR引入的错误也无法进行有效识别。所以目前急需要开发一种新的方法，用于鉴别真正的基因突变和这些系统错误。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种引物标签结合深度测序法从外周血游离DNA扩增癌症基因的引物组、引物标签设计方法及应用。
第一方面，本发明提供了一种引物标签结合深度测序法从外周血游离DNA扩增癌症基因的引物组。
值得注意的是，本发明所述的引物组的引物数量不限，可以是一钟或多钟引物。
本发明所述癌症为实体瘤或血液病，具体地，所述的癌症包括但不限于头颈部癌症、消化道癌症、脑癌、肺癌、生殖系统癌症、泌尿系统癌症、皮肤癌、淋巴癌、白血病；其中所述头颈部癌症为口腔癌、鼻咽癌、舌癌或喉癌；所述消化道癌症为食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌或肠癌；所述生殖系统癌症为乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌或睾丸癌；所述泌尿系统癌症为膀胱癌或肾癌。
本发明所述的深度测序法，可做本领域技术人员常规理解，比如与高通量测序技术、NGS等概念在多数情况下可互换。
本发明所述的深度测序法采用的测序设备包括但不限于Roche/454、Illumina测序仪(NextSeq系列，Hiseq系列，MiSeq系列，XTen，以及后续测序仪系列)、BGI(华大公司，BGI500系列以及后续测序仪)的测序仪、LifeTech测序仪器(Ion，Proton以及后续测序仪器系列)、PacBio测序仪器(RSII，Sequel以及后续测序仪器)或基于Nanopore的测序仪器(Genia，Nanopore以及类似的第三代测序仪)。
第二方面，本发明提供了一种引物标签结合深度测序法从外周血游离DNA扩增癌症基因的标签设计方法，包括如下步骤：
1)设计引物标签；
2)给模板中的每个DNA分子都接上引物标签；
3)针对目标癌症基因设计PCR引物或PCR引物组；
4)进行PCR扩增和测序，筛选出合格的引物标签。
本发明提供的从外周血游离DNA中扩增癌症基因的分子标签设计的基本原则：通过给每个起始样品模板两边加标签的方式，给模板中的每个DNA分子都贴上分子标签，在经过PCR和测序以后，可以通过分子标签将样本中原始的DNA分子都鉴别分类。由于经过PCR扩增以后的分子都跟原始模板携带同样的分子标签，所以理论上来说，来源于同一个分子标签的某类DNA分子应该携带相同的序列，如果后期中间的产物在PCR过程中发生的突变，就可以通过标签去除这些突变序列，避免他们干扰最后的测序结果。同样的，测序错误也可以通过这个方法进行鉴别。
第三方面，本发明提供了一种用于深度测序法从外周血游离DNA扩增癌症基因的引物标签。
第四方面，本发明提供了一种如第一方面提供的引物组、如第二方面提供的引物标签设计方法、或如第三方面提供了的引物标签在从外周血游离DNA扩增癌症基因中的应用、或在高通量测序中的应用。
附图说明
图1是本发明实施例提供的四种ctDNA检测方法的通量和敏感性分布示意图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。
本发明实施例中若特别说明，测序文库构建参照罗氏、illumina或ABI的高通量测序文库构建说明书。
在本发明第一实施例中，本发明提供了一种引物标签结合深度测序法从外周血游离DNA扩增癌症基因的引物组。
值得注意的是，本发明所述的引物组的引物数量不限，可以是一钟或多钟引物。
本发明所述癌症为实体瘤或血液病，具体地，所述的癌症包括但不限于头颈部癌症、消化道癌症、脑癌、肺癌、生殖系统癌症、泌尿系统癌症、皮肤癌、淋巴癌、白血病；其中所述头颈部癌症为口腔癌、鼻咽癌、舌癌或喉癌；所述消化道癌症为食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌或肠癌；所述生殖系统癌症为乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌或睾丸癌；所述泌尿系统癌症为膀胱癌或肾癌。
本发明所述的深度测序法，可做本领域技术人员常规理解，比如与高通量测序技术、NGS等概念在多数情况下可互换。
本发明所述的深度测序法采用的测序设备包括但不限于Roche/454、Illumina测序仪(NextSeq系列，Hiseq系列，MiSeq系列，XTen，以及后续测序仪系列)、BGI(华大公司，BGI500系列以及后续测序仪)的测序仪、LifeTech测序仪器(Ion，Proton以及后续测序仪器系列)、PacBio测序仪器(RSII，Sequel以及后续测序仪器)或基于Nanopore的测序仪器(Genia，Nanopore以及类似的第三代测序仪)。
在本发明第二实施例中，本发明提供了一种引物标签结合深度测序法从外周血游离DNA扩增癌症基因的标签设计方法，包括如下步骤：
1)设计引物标签；
2)给模板中的每个DNA分子都接上引物标签；
3)针对目标癌症基因设计PCR引物或PCR引物组；
4)进行PCR扩增和测序，筛选出合格的引物标签。
本发明提供的从外周血游离DNA中扩增癌症基因的分子标签设计的基本原则：通过给每个起始样品模板两边加标签的方式，给模板中的每个DNA分子都贴上分子标签，在经过PCR和测序以后，可以通过分子标签将样本中原始的DNA分子都鉴别分类。由于经过PCR扩增以后的分子都跟原始模板携带同样的分子标签，所以理论上来说，来源于同一个分子标签的某类DNA分子应该携带相同的序列，如果后期中间的产物在PCR过程中发生的突变，就可以通过标签去除这些突变序列，避免他们干扰最后的测序结果。同样的，测序错误也可以通过这个方法进行鉴别。
在本发明第三实施例中，本发明提供了一种用于深度测序法从外周血游离DNA扩增癌症基因的引物标签。
在本发明第四实施例中，本发明提供了一种如第一方面提供的引物组、如第二方面提供的引物标签设计方法、或如第三方面提供了的引物标签在从外周血游离DNA扩增癌症基因中的应用、或在高通量测序中的应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。