利用RT－LAMP方法快速检测玉米粗缩病病原与流程

本发明涉及玉米粗缩病病原的快速检测技术及其在病害诊断和测报上的应用，属于农业科学技术领域。

背景技术：
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玉米粗缩病(Maize rough dwarf disease，MRDD)在我国病原物为水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)，属于呼肠孤病毒科斐济病毒属第二组成员，以灰飞虱为主要传毒介体进行持久性传播，灰飞虱一旦染毒，终身带毒，并能连续传毒，但不经卵传毒。自然条件下，主要寄主有水稻、玉米、大麦、小麦、高粱、粟、看麦娘、稗草及狗尾巴草等禾本科植物。感染玉米粗缩病玉米植株的典型症状为植株矮缩，叶色浓绿，叶片僵直、宽短而厚，叶背面出现蜡白色短条状突起，后期变褐色，籽粒较少或不结籽粒。自1954年在新疆和甘肃省发现该病害以来，玉米粗缩病在我国各玉米产区均有不同程度发生，特别是近年来由于气候环境变化和种植结构的调整，玉米粗缩病的发生呈现明显的上升趋势，给玉米产量带来严重损失。

目前植物病毒鉴定常用的方法有：生物学接种实验、血清学检测、电镜观察及分子生物学方法。这些方法大都需要特定仪器且耗时久，不适用于田间快速检测。环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi T等在2000年发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法，是一种高灵敏链置换技术，一种新型PCR替代技术。LAMP特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶-Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA polymerase在恒温(60-65℃)的条件下反应1小时左右即可完成核酸扩增反应。钙黄绿素是一种荧光染料，在LAMP反应之前加入到反应体系中，避免了开盖造成的反应产物污染，这与SYBR Green I染料不同。通过荧光染色直接目测比色就可以得到清晰的反应结果。不需要长时间的温度循环，不需要PCR仪等昂贵的仪器，不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。目前已广泛应用于人类和动植物各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测和快速诊断中。

技术实现要素：
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本发明提供了一种快速检测玉米粗缩病病原的方法，通过该方法可以快速诊断出玉米是否携带该病毒。

本发明所提供的一种快速检测玉米粗缩病病原的方法，是通过以下方法获得的：

1)根据NCBI已报道水稻黑条矮缩病毒S10核苷酸序列，通过软件DNAstar分析后选择相对保守区域700-1700bp，利用AJ297433.1上对应区域通过在线引物设计软件primerExplorer V4(http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计4条引物，其中包括2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP；

2)Trizol reagent提取植株总RNA；

3)设置不同内外引物浓度比例、Mg²⁺浓度、Mn²⁺浓度、钙黄绿素浓度，确定最佳反应体系；分别改变反应时间和温度进行RT-LAMP扩增反应，确定最佳反应条件；

4)与RT-PCR方法进行比较，验证RT-LAMP方法的可靠性；

本发明提供的引物序列如下：

F3 TTTCGGCTTTGAAAACAGT

B3 TGCCATCGTAATTAGTGCG

FIP TGCGCTCCAAGTTTGTTCGATGAAAAAGAACTAAGTGTTTTGG

RIP ATTTGTTGAAACATGGCAGGTTAAACGTGGACAAACTGGTCAAT。

RT-LAMP的反应温度为60-65℃，反应时间为90-150min。

一种检测玉米上玉米粗缩病病原方法的应用包括：玉米疑似病株的快速诊断与鉴别。

利用这一方法可以快速鉴定出玉米植株是否感染玉米粗缩病，进而采取针对性的防治策略，减少病害带来的损失。

附图说明：

图1：不同反应温度条件下RT-LAMP结果的电泳图(A，RT-LAMP反应电泳图；B，钙黄绿素颜色变化图；M，标准分子量；1，60℃；2，61℃；3，62℃；4，63℃；5，64℃；6，65℃；7，阴性对照)。

图2：不同反应时间条件下RT-LAMP结果的电泳图(A，RT-LAMP反应电泳图；B，钙黄绿素颜色变化图；M，为标准分子量；1，30min；2，60min；3，90min；4，120min；5，150min；6，阴性对照)。

图3：RT-LAMP与RT-PCR灵敏性比较图(A，RT-LAMP反应电泳图；B，RT-PCR反应电泳图；C，钙黄绿素颜色变化图；1-9，1.0578μg/μL-1.0578×10^-8μg/μL；10为阴性对照)。

具体实施方式：

下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1，玉米粗缩病毒RT-LAMP反应条件的优化

(1)引物设计。

根据NCBI上已报道的水稻黑条矮缩病毒S10核苷酸序列设计引物。选取相对保守的一段序列699-1699bp作为模板，使用在线LAMP引物设计软件primerExplorer V4(http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计引物。将模板序列上传后，由系统软件计算获得初步的LAMP引物组合(F3，B3，FIP，BIP)，再通过软件提供的引物相应的3’端或5’端稳定性及引物二聚体等参数对设计出的多对引物进行比较选择，选取5组合适的引物，再用外引物F3/B3PCR验证，最终确定序列如下：

F3 TTTCGGCTTTGAAAACAGT

B3 TGCCATCGTAATTAGTGCG

FIP TGCGCTCCAAGTTTGTTCGATGAAAAAGAACTAAGTGTTTTGG

BIP ATTTGTTGAAACATGGCAGGTTAAACGTGGACAAACTGGTCAAT。

(2)温度梯度实验

从南京江苏省农业科学院采集玉米病株，参照季英华等RT-PCR方法筛选出玉米粗缩病样品用于RT-LAMP检测试验(季英华等，《中国水稻科学》，2011)。参照Reagents(康为世纪)使用说明，提取样品总RNA。虽然Bst DNA polymerase的最适反应温度为65.8℃，但许多报道已经证实RT-LAMP适宜反应温度在60℃-65℃之间，同时由于不同引物的Tm值不可能完全一致，而且RT-LAMP还要考虑到反转录酶的适宜反应温度，因此，本发明对RT-LAMP反应温度进行优化试验。RT-LAMP体系为：外引物F3和B3各0.2μM，内引物FIP和BIP各1.2μM，1.4mM dNTP混合物，8mM MgSO₄，0.5mM MnCl₂，50μM钙黄绿素，20mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％TritonX-100，Bst DNA聚合酶，大片段8U，M-MuLV反转录酶100U，RNase Inhibitor 20U，0.8M甜菜碱，2μL总RNA模板，补充DEPC水至25μL。混匀反应物在60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃六种条件下恒温反应90min，80℃反应5min终止RT-LAMP反应，直接目测比色或取2μL扩增产物上样，在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结果EB染色。结果显示在同样反应体系条件下，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃恒温反应90min后均有阶梯状扩增条带，61℃，62℃，63℃恒温反应90min后的扩增产物的电泳条带亮度几乎相同，64℃，65℃恒温反应90min后扩增产物的条带亮度略微有些减弱，阴性对照无阶梯状扩增带(图1)。因此本发明RT-LAMP的反应温度应为61-63℃。

(3)反应时间梯度实验

许多报道已经证实RT-LAMP反应时间少于90min也能检测到扩增产物。按照(2)中已经优化好的RT-LAMP体系加样后置于61℃恒温条件下反应，分别设置恒温反应30min，60min，90min，120min，150min五种处理，按(2)中完成反应后电泳检测。结果显示当反应时间为90min时才有扩增产物，但是当反应时间小于90min时，没有RT-LAMP扩增产物。此后当继续增加反应时间时，扩增产物的量几乎不发生改变(图2)。因此本发明确定的RT-LAMP的反应时间为90-150min。

(4)RT-LAMP与RT-PCR灵敏性比较

为了确定RT-LAMP和RT-PCR两种检测方法的灵敏度，将提取的总RNA用紫外分光光度计(Thermo NanoDrop 2000C)测定浓度(1.0578μg/μL)后用DEPC水进行10倍比稀释，-70℃保存作为模板。分别取总RNA倍比稀释液2μL作为模板，采用所设引物用(2)中RT-LAMP反应体系进行反应(反应时间为90min)。直接目测比色或取2μL扩增产物上样，在1％琼脂糖凝胶上电泳。同时，以RT-LAMP相同的2μL总RNA倍比稀释液为模板，参照反转录试剂盒(大连宝生物)说明进行反转录合成cDNA第一链。以RT合成的cDNA为模板，以F3和B3为引物进行PCR扩增，使用常规PCR反应体系。取2μL扩增产物上样，在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果EB染色。结果显示用RT-LAMP方法可以检测到浓度是1.0578×10^-6μg/μL的玉米粗缩病毒的总RNA，而RT-PCR只能检测到浓度是1.0578×10^-4μg/μL的玉米粗缩病毒的总RNA，即RT-LAMP比RT-PCR灵敏性高出100倍(图3)。

一种检测玉米植株上玉米粗缩病病原的方法应用包括：在玉米疑似病株的快速诊断与鉴别。

上述实施不以任何形式限定本发明。