用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法与流程

本发明属于虾黄头病病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法。

背景技术：

黄头病(Yellow Head Disease，YHD)是由黄头病毒(Yellow Head Virus，YHV)引起的对虾传染性疾病，黄头病毒属于套式病毒目(Nidovirales)杆套病毒科(Roniviridae)头甲病毒属(Okavirus)的单链RNA病毒，因濒死虾头胸部因肝胰腺发黄而变成黄色，被称为黄头病。黄头病毒传染率很高，且从对虾感染到死亡经历的时间只有几天时间，给水产养殖人员带来了巨大的经济损失。1992年，泰国因对虾感染了黄头病毒导致减产五千吨，经济损失重大。该病在感染初期的2～4天时会出现不正常的大量进食的现象,而后几乎完全停止进食,接下来便会发现有大量垂死的虾只会聚集在养殖池的池水表面或池塘周围，在严重发病时可使全池的虾在3天内基本全部死亡，死亡率很高。我国将其列为二类疫病，世界动物卫生组织(Office International des Epizooties，OIE)将其列为必须申报的疫病。已知的黄头病毒群有六种，分为YHV(YHV-1型)、鳃联病毒(Gill-associated virus，GAV)(YHV-2型)及其它4种基因型(YHV-3型–YHV-6型)。其中YHV-3型–YHV-6型常见于东非、亚洲和澳大利亚的健康的斑节对虾，表现为极少或从不引发疾病。YHV可以在海水中存活三天以上，在60℃下15分钟可以将其灭活。至今为止，国内外对于YHV的检测方法目前并不多，其中分子学检测方法主要为液相基因芯片法和RT-PCR法，OIE《水生动物诊断手册》(OIE，2012)推荐的为RT-PCR法，但需要后续的处理过程，步骤繁琐，耗时也较长，工作量较大。而实时荧光RT-PCR技术的发展，使病毒检测技术得到了进一步提高，这种检测技术也被应用到IHNV、VHSV和SVCV的检测中。实时荧光RT-PCR技术进一步提高了检测的特异性、灵敏度，减少了工作量，提高了工作效率，而且还可以对目的片段进行定量检测，但TaqMan荧光RT-PCR由于使用的荧光探针，其成本较普通PCR高。

综上所述，现有的虾黄头病病毒的检测方法存在步骤繁琐，耗时也较长，工作量较大，成本较高。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法，旨在解决现有的虾黄头病病毒的检测方法存在步骤繁琐，耗时也较长，工作量较大，成本较高的问题。

本发明是这样实现的，一种用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物，所述用于检测虾黄头病病毒的荧光引物的序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。

本发明的另一目的在于提供一种所述的用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物的设计方法，所述设计方法包括以下步骤：

按照LAMP引物设计原则，根据GenBank数据库中下载YHV基因组序列，进行多序列比对，寻找YHV的一段保守基因作为扩增对象，然后通过分子生物学软件LAMP Designer1.1.4设计引物；采用HPLC纯化方式；合成后的引物用DEPC水稀释成100μmol/L溶液，-20℃保存备用。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述用于检测虾黄头病毒荧光LAMP引物的用于检测虾黄头病毒的检测方法，所述用于检测虾黄头病毒的检测方法包括以下步骤：

步骤一，样品的核酸提取：按照核酸提取试剂盒Mag-BindViral DNA/RNA Kit(200)说明书提取样品核酸；

步骤二，反应管中成分配制：LAMP反应体系总体积为25μL，其中2×Taq反应液RM 12.5μL，内引物FIP、BIP40μmol/L各1.0μL，环引物LF和LB各1.0μL，外引物F3、B35μmol/L各1.0μL，Bst DNApolymerase 0.8μL，逆转录酶0.2μL，荧光染料0.5μL，RNA模版2.0μL，补水至25.0μL。最后加20.0μL的封闭液以避免体系挥发和产物污染；

步骤三，仪器检测：对反应置于60℃至65℃的反应环境中并以1℃递增进行优化，从多次重复试验中确定最佳反应温度；在荧光PCR仪上反应条件调整为保温阶段63℃1min，1个循环；循环阶段63℃15s，63℃45s，60个循环；于63℃45s处收集荧光信号，荧光通道选为FAM。

本发明提供的用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法，该引物能与靶序列上的6个特定区域结合，因此特异性高于传统的荧光PCR方法；而且没有探针的加入，使得成本大大降低。本发明旨在建立一种快速、准确、简单易操作的虾黄头病毒检测方法；环介导等温扩增技术(1oop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本Notomi等在2000年报道的一种新的核酸扩增技术。与传统的扩增技术相比，该技术扩增的特异性更强，反应过程只需在60～65℃的恒温条件下30～60min即可完成，不需要热循环。由于反应过程中不需要开启试管盖，因此大大降低了实验室污染的可能性，并且具有重复性好、特意性强、敏感度高和易于操作等特点。本发明是在原来LAMP技术的基础上引入荧光染料，建立了荧光LAMP检测技术，由于使用仪器进行荧光收集，检测的灵敏度进一步提高，更加客观，操作更加简便，容易将方法标准化，易于推广使用。

附图说明

图1是本发明实施例提供的用于检测虾黄头病病毒的荧光引物的检测方法流程图。

图2是本发明实施例提供的黄头病毒OIE方法临床试验示意图；

图中：1-10：虾样品；M：DL-2000DNAMarker；N：阴性对照；P：阳性对照。

图3是本发明实施例提供的黄头病毒LAMP检测方法建立示意图；

图中：P阳性对照；N：阴性对照。

图4是本发明实施例提供的黄头病毒LAMP方法特异性试验示意图；

图中：1-10：虾组织样品；N：阴性对照；P：阳性对照。

图5是本发明实施例提供的黄头病毒LAMP方法灵敏度检测示意图；

图中：1-9：拷贝数梯度依次为10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹；N：阴性对照。

图6是本发明实施例提供的检测方法稳定性试验1示意图。

图7是本发明实施例提供的检测方法稳定性试验2示意图。

图8是本发明实施例提供的样品检测结果示意图；

图中：1-10：虾样品；N：阴性对照；P：阳性对照。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

本发明实施例提供的用于检测虾黄头病病毒的荧光引物的序列为：

SEQ ID NO：1

FIP TCATAGACGCCTTCTGGACAGACACAGTCATTCGCATTACAAG

SEQ ID NO：2

BIP TATCGTCCCGGCAATTGTGATCAACCAGTGACGTTCGATG

SEQ ID NO：3

F3CAACATCCTCAAGATGGACAT

SEQ ID NO：4

B3GAATTGTCATGTCTTCATGTGG

SEQ ID NO：5

LF TGTTGTCTGGAGTGATGTCG

SEQ ID NO：6

LB CAACGCCGTCACGTATTG

如图1所示，本发明实施例提供的用于检测虾黄头病病毒的检测方法包括以下步骤：

S101：样品的核酸提取：按照核酸提取试剂盒Mag-BindViral DNA/RNAKit(200)说明书提取样品核酸；

S102：反应管中成分配制：LAMP反应体系总体积为25μL，其中2×Taq反应液RM 12.5μL，内引物FIP、BIP40μmol/L各1.0μL，环引物LF和LB各1.0μL，外引物F3、B35μmol/L各1.0μL，Bst DNApolymerase 0.8μL，逆转录酶0.2μL，荧光染料0.5μL，病毒核酸模板2.0μL，补水至25.0μL。最后加20.0μL的封闭液以避免体系挥发和产物污染；

S103：仪器检测：对反应置于60℃至65℃的反应环境中并以1℃递增进行优化，从多次重复试验中确定最佳反应温度；在荧光PCR仪上反应条件调整为保温阶段63℃1min，1个循环；循环阶段63℃15s，63℃45s，60个循环；于63℃45s处收集荧光信号，荧光通道选为FAM。

下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。

1.1黄头病病毒荧光LAMP检测方法

1.1.1样品和仪器

1.1.1.1基因黄头病病毒ORF1全基因合成并克隆测序；桃拉病毒NS全基因合成并克隆测序，在上海旭冠生物科技有限公司完成。

1.1.1.2样品

实验室保存的10份对虾送检样品，其中5份虾白斑病病毒检测阳性，5份加入桃拉病毒NS全基因合成质粒。用OIE手册中方法进行验证，证实其是否含有黄头病病毒核酸。

购买自市场的虾样品共10份，均由本实验室采集并于-80℃冰箱保藏。

1.1.1.3主要试剂

核酸恒温扩增试剂盒购自广州迪澳生物技术有限公司；核酸提取试剂盒Mag-BindViral DNA/RNA Kit(200)购自OMEGA公司。

1.1.1.4主要仪器

ABI 7500Fast Real-Time PCR System，为美国Applied Biosystems公司产品。SIGMA3-18K小型高速冰冻台式离心机，为德国Sartorius公司产品。NanoDrop ND-1000Spectrophotometer紫外分光光度计，为美国NanoDrop Technologies公司产品。Alpha Imager HP凝胶成像分析系统，为美国Alpha Innotech公司产品

1.1.2方法

1.1.2.1LAMP引物设计

按照LAMP引物设计原则，根据GenBank数据库中YHV的YHV-1型—YHV-6型的基因组序列，经多序列比对，以ORF1基因作为扩增对象，然后通过分子生物学软件LAMP Designer 1.14设计引物。引物由上海辉睿生物科技有限公司合成，采用HPLC纯化方式。合成后的引物用超纯水稀释成100μmol/L溶液，-20℃保存备用。引物序列见表1。

表1黄头病毒LAMP引物

1.1.2.2样品的RNA提取

核酸提取方法按照核酸提取剂盒说明书中要求进行。

1.1.2.3荧光LAMP反应体系

实时荧光LAMP反应体系总体积为25μL：2×反应液RM 12.5μL，内引物FIP、BIP 40μmol/L各1.0μL，外引物F3、B35μmol/L各1.0μL，Bst DNA聚合酶1.0μL，荧光染料0.5μL，病毒核酸模板2.0μL，补水至25μL。最后加20.0μL的封闭液以避免体系挥发和产物污染。

1.1.2.4荧光LAMP反应条件优化

根据设计的引物的Tm值和Bst酶适宜的反应温度，本发明对反应置于60℃至65℃的反应环境中并以1℃递增进行优化，从多次重复试验中确定最佳反应温度。最后在荧光PCR仪上反应条件调整为保温阶段63℃1min；循环阶段63℃15s，63℃45s，60个循环；于63℃45s处收集荧光信号，荧光通道选为FAM。

1.1.2.5荧光LAMP灵敏度检测

以重组质粒作为阳性标准品。用紫外分光光度计测定质粒浓度，根据阿伏伽德罗常数换算为目的基因的拷贝数，以10倍梯度稀释，得到浓度为10⁹至10的9个浓度梯度的模板，使用上述反应体系和反应条件进行LAMP扩增，以验证所设计引物及所建立方法的灵敏度。

1.1.2.6荧光LAMP特异性检测

以实验室保留的10份虾样品为模板，使用上述反应体系和反应条件进行LAMP扩增，以验证所设计引物及所建立方法的特异性。

1.2.2.7荧光LMAP稳定性试验

取10⁵浓度的阳性对照质粒，间隔1个月进行两次试验，每次做20个重复。统计检测结果之间的差异。

1.1.2.8样品检测

将购自市场的10份虾样品提取核酸之后，使用建立的方法进行检测。

1.1.3结果与分析

1.1.3.1样品验证结果

所有10份实验室保存样品使用OIE手册中提供的方法进行检测，均未检测到黄头病病毒阳性，见图2。

1.1.3.2荧光LAMP检测YHV方法建立

本实验利用荧光法，使用ABI ViiA7Real-Time PCR System来对实验进行实时观察。结果显示，阳性对照在12min左右出现扩增曲线，荧光增长明显，阴性对照荧光值没有显著变化。见图3。

1.1.3.3荧光LAMP特异性试验

将虾样品提取的核酸进行实时荧光LAMP检测，结果显示，除了阳性对照有明显的扩增曲线外，5份白斑病病毒阳性样品和5份加入桃拉病毒NS全基因合成质粒的虾样品均无扩增，曲线基本呈平滑状，见图4。

1.1.3.4荧光LAMP灵敏度试验

将稀释好的阳性质粒按照上述的反应体系和反应条件，用ABI 7500Fast Real-Time PCR System进行结果观察，发现YHV检测的最低检测浓度达到了10个拷贝的数量级，见图5。

1.1.3.5荧光LAMP稳定性试验

对批内和批间出现荧光增长的时间点进行统计分析，两次试验批内变异系数分别为2.80％和2.88％，批间变异系数为4.80％，所有变异系数均小于5.00％。因此，批内和批间试验稳定性较好，见图6和图7。

1.1.3.6样品检测

10份样品使用荧光LAMP方法检测，检验结果未检出YHV，见图8。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 用于检测虾黄头病病毒的荧光引物及其检测方法

<160> 6

<210> 1

<211> 43

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

TCATAGACGCCTTCTGGACAGACACAGTCATTCGCATTACAAG

<210> 2

<211> 40

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

TATCGTCCCGGCAATTGTGATCAACCAGTGACGTTCGATG

<210> 3

<211> 21

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

CAACATCCTCAAGATGGACAT

<210> 4

<211> 22

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

GAATTGTCATGTCTTCATGTGG

<210>5

<211> 20

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

TGTTGTCTGGAGTGATGTCG

<210> 3

<211> 18

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

CAACGCCGTCACGTATTG