用于检测猪水疱病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法与流程

本发明属于猪水疱病病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于检测猪水疱病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法。

背景技术：

猪水疱病病毒(Swine Vesicular Disease Virus,SVDV)是猪水疱病的病原体，根据国际病毒分类委员会(ICTV)第十五次报告(1991)，SVDV归为小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)。病毒粒子呈球形，在超薄切片中直径为22－23纳米，无囊膜，不含脂质和碳水化合物，不能凝集人和家兔、豚鼠、牛、绵羊、鸡、鸽等动物的红细胞，具有一个血清型，四个可区分基因组。相对于口蹄疫病毒，SVDV对pH 2.5-12.0表现稳定。目前，该病在部分国家和地区仍有零星发生，一般只对猪的肥育计划产生轻微影响，未造成大范围的流行和大规模的损失。但从临床角度看，该病的症状与口蹄疫的症状很难区分，从而妨碍了猪和猪产品的贸易与流通，世界动物卫生组织将其列为A类动物疫病，中国将其列为一类动物疫病。1966年发现猪水疱病以来，世界各国对SVDV的鉴别诊断进行了大量的研究工作。临床上，猪水疱病除了难以与口蹄疫、水疱性口炎等水疱类疾病相区分外，还因从感染SVDV到出现临床症状的时间较长，因此发生猪的水疱性疾病时应立即采集病变样品进行实验室诊断，以确诊疫病的种类。近年来，针对猪水疱性疾病的研究，已有多种实验室检测方法，如：病毒分离试验(VI)、血清中和试验(SN)、病毒中和试验(VN)、酶联免疫吸附试验(直接型、间接型、竞争型，ELISA)、逆转录聚合酶联合反应(RT-PCR)、实时荧光逆转录聚合酶联合反应(Real time RT-PCR)、生物晶片、免疫色层分析测试片(Lateral flow devices,LFD)等方法在国际期刊上发表。根据世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)针对猪水疱病检测方法的推荐情况，不同的适用对象有被推荐使用的不同检测方法，但纵观上述SVDV实验室检测方法，虽然具有各自的优点，但也有不同层面的不足或缺陷，或费时费力，或特异性和敏感性不高，或成本昂贵。近年逐渐发展成熟的环介导等温核酸扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的核酸扩增技术，其利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，并利用链置换型DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在60℃～65℃恒温条件下1h甚至更短的时间即可完成基因扩增。

综上所述，现有的猪水疱性疾病检测方法存在费时费力，特异性和敏感性不高，成本昂贵。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于检测猪水疱病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法，旨在解决现有的猪水疱性疾病检测方法存在费时费力，特异性和敏感性不高，成本昂贵的问题。

本发明是这样实现的，一种用于检测猪水疱病病毒的荧光引物，所述用于检测猪水疱病病毒的荧光引物的序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。

本发明的另一目的在于提供一种所述用于检测猪水疱病病毒的荧光引物的个设计方法，所述合成方法包括以下步骤：

引物的设计根据GenBank数据库中猪水疱病病毒的基因序列，选取其VP1基因上的一段高度保守区作为扩增对象，使用分子生物学软件LAMP designer1.14设计荧光LAMP引物，将设计的引物进行最佳配对筛选试验，采用HPLC方式进行纯化；合成后的引物用灭菌DEPC水稀释成100μmol/L溶液，保存于-20℃。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述用于检测猪水疱病病毒的荧光LAMP引物的猪水疱病病毒检测方法，所述猪水疱病病毒检测方法包括以下步骤：

步骤一，样品核酸的提取按照核酸提取试剂盒Mag-BindViral DNA/RNA Kit200说明书提取样品核酸；

步骤二，反应管中成分配制：LAMP反应体系总体积为25μL，其中2×Taq反应液RM 12.5μL，内引物FIP、BIP40μmol/L各1.0μL，环引物LF和LB各1.0μL，外引物F3、B35μmol/L各1.0μL，Bst DNA polymerase 0.8μL，逆转录酶0.2μL，荧光染料0.5μL，病毒核酸2.0μL，补水至25.0μL；最后加20.0μL的封闭液以避免体系挥发和产物污染；

步骤三，仪器检测：在荧光PCR仪上反应条件调整为保温阶段63℃30s，1个循环；循环阶段63℃15s，63℃45s，60个循环；于63℃45s处收集荧光信号，荧光通道选为FAM。

本发明提供的用于检测猪水疱病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法，使用环引物，使检测速度更快，一般40min之内就可以完成反应。另外，在反应体系中加入了荧光染料，可以在仪器上进行实时检测，灵敏度进一步提高，操作更加简便。本发明旨在建立一种快速、准确、简单易操作的传染性造血器官坏死病毒检测方法；环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本Notomi等在2000年报道的一种新的核酸扩增技术。与传统的扩增技术相比，该技术扩增的特异性更强，反应过程只需在60～65℃的恒温条件下30～60min即可完成，不需要热循环。由于反应过程中不需要开启试管盖，因此大大降低了实验室污染的可能性，并且具有重复性好、特意性强、敏感度高和易于操作等特点。本发明是在原来LAMP技术的基础上引入荧光染料，建立了荧光LAMP检测技术，由于使用仪器进行荧光收集，检测的灵敏度进一步提高，更加客观，操作更加简便，容易将方法标准化，易于推广使用。

附图说明

图1是本发明实施例提供的用于检测猪水疱病病毒的荧光LAMP引物的检测方法流程图。

图2是本发明实施例提供的猪水疱病病毒RT-PCR产物凝胶电泳结果示意图。

图3是本发明实施例提供的猪水疱病病毒荧光LAMP特异性试验示意图。

图4是本发明实施例提供的猪水疱病病毒荧光LAMP灵敏度试验示意图。

图5是本发明实施例提供的猪水疱病病毒荧光LAMP稳定性试验示意图。

图6是本发明实施例提供的样品检测结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的用于检测猪水疱病病毒的荧光引物的序列为：

SEQ ID NO：1

FIP CGAAGTTGTCGCCATCGGAGTGGAGAACTTCCTGTGC

SEQ ID NO：2

BIP CACACGGCAAGTTGCTCAACACGAAGGTCAACTCCAGA

SEQ ID NO：3

F3 AAGTTGTACCATCAGACACAAT

SEQ ID NO：4

B3 TGTTCCTGAGTGCTAGTGA

SEQ ID NO：5

LF TCATGGTTCTTGTATGTGGTGT

SEQ ID NO：6

LB TCGGAAGCTCGAACTGTTC

如图1所示，本发明实施例提供的用于检测猪水疱病病毒的荧光LAMP引物的检测方法包括以下步骤：

S101：样品核酸的提取按照核酸提取试剂盒Mag-BindViral DNA/RNA Kit(200)说明书提取样品核酸；

S102：反应管中成分配制：LAMP反应体系总体积为25μL，其中2×Taq反应液RM 12.5μL，内引物FIP、BIP 40μmol/L各1.0μL，环引物LF和LB各1.0μL，外引物F3、B3 5μmol/L各1.0μL，Bst DNA polymerase 0.8μL，逆转录酶0.2μL，荧光染料0.5μL，病毒核酸2.0μL，补水至25.0μL。最后加20.0μL的封闭液以避免体系挥发和产物污染；

S103：仪器检测：在荧光PCR仪上反应条件调整为保温阶段63℃30s，1个循环；循环阶段63℃15s，63℃45s，60个循环；于63℃45s处收集荧光信号，荧光通道选为FAM。

下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品生猪肉及猪内脏共8份，购于超市。

1.1.2 病毒株和基因猪水疱病病毒VP1全基因克隆载体、水疱性口病毒核蛋白全基因克隆载体、水疱疹病毒VP3全基因克隆载体。口蹄疫(O型、亚洲1型)灭活疫苗。

1.1.3 主要试剂RNA核酸恒温扩增试剂盒购自Deaou公司；RNA提取试剂盒Mag-BindViral DNA/RNA Kit(200)购自OMEGA公司；RT-PCR试剂盒TaKaRa One step RT-PCR Kit购自广州瑞真生物技术有限公司。

1.1.4 主要仪器ABI 7500 Real-Time PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；SIGMA高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer紫外分光光度计(美国NanoDrop Technologies公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成根据GenBank数据库中猪水疱病病毒的基因序列，选取其VP1基因上的一段高度保守区作为扩增对象，使用分子生物学软件LAMP designer1.14设计LAMP引物，将设计的引物进行最佳配对筛选试验，由上海Invitrogen生物科技有限公司合成，采用HPLC方式进行纯化。合成后的引物用灭菌DEPC水稀释成100μmol/L溶液，保存于-20℃。引物序列见表1。

表1 猪水疱病病毒荧光LAMP引物序列

1.2.2 样品RNA的提取按照RNA提取试剂盒Mag-BindViral DNA/RNAKit(200)说明书提取样品RNA。

1.2.3 反应体系和反应条件荧光LAMP反应体系为25μL：反应液RM(2×)12.5μL，40μmol/L FIP和BIP引物各1.0μL，20μmol/LLF和LB引物各1.0μL，10μmol/L F3和B3引物各1.0μL，Bst DNA polymerase 0.8μL，逆转录酶0.2μL，病毒核酸模板2.0μL，补水至25.0μL，加封闭液20.0μL。反应条件：63℃60min，每1min收集一次荧光。

1.2.4 扩增产物与靶基因的比对使用上述1.2.3的反应体系和反应条件进行荧光LAMP扩增，以扩增产物为模板，使用外引物(F3&B3)进行RT-PCR扩增，经凝胶电泳后用凝胶成像分析系统观察结果，回收目的片段，送宝生物公司进行TA克隆测序，将测序结果与靶基因进行比对，以验证荧光LAMP扩增的目的片段与靶基因的一致性。

1.2.5 引物浓度的优化为优化反应的最佳引物浓度，根据试剂盒的推荐范围，进行4组不同的内外环引物终浓度比例优化，浓度各自为：内引物1.6μM、外引物0.1μM、环引物0.8μM；内引物1.6μM、外引物0.2μM、环引物0.8μM；内引物0.8μM、外引物0.1μM、环引物0.4μM；内引物0.8μM、外引物0.2μM、环引物0.4μM。

1.2.6 特异性检测以上述1.1.2的疫苗毒所提取的猪水疱病病毒VP1基因、水疱性口炎病毒NP基因、水疱疹病毒VP3基因和口蹄疫病毒疫苗提取的核酸为模板，使用上述1.2.3的反应体系和反应条件进行荧光LAMP扩增，以验证所设计引物及所建立方法的特异性。

1.2.7 灵敏度检测提取上述1.2.4克隆测序所得的阳性质粒，用紫外分光光度计测定其浓度，根据阿伏伽德罗常数换算成目的基因的拷贝数，以10倍梯度稀释作为阳性样品，对梯度稀释的阳性样品使用上述1.2.3的反应体系和反应条件进行荧光LAMP扩增，以验证所设计引物及所建立方法的灵敏度。

1.2.8 重复性试验

取10⁵浓度的质粒，间隔1个月进行两次试验，每次做20个重复。计算检测结果之间的差异。

1.2.9 样品检测试验

生猪肉及猪内脏共8份

2 结果

2.1 扩增产物测序

使用上述1.2.3的反应体系和反应条件进行荧光LAMP扩增，以扩增产物为模板，使用外引物(F3&B3)进行PCR扩增，经凝胶电泳后用凝胶成像分析系统观察结果，由图2可见，凝胶电泳结果显示扩增产物大小约220bp，经克隆测序，序列结果显示扩增的目的基因与靶序列一致。

2.2 条件优化

经比较，当内引物浓度为1.6μM、外引物浓度为0.2μM、环引物浓度为0.8μM，反应温度为63℃，反应时间为60min时，荧光LAMP扩增效果最佳。

2.3 特异性试验

如图3所示，从所检测的目标阳性样品SVDV出现实时荧光增长曲线，有较强的实时荧光信号，表现为阳性扩增，时间少于20min，所检测的目标阴性样品FMDV、VSV、VESV及空白对照均无扩增曲线。

2.4 敏感性试验

以上述1.2.3克隆测序的质粒作为阳性样品，对稀释度为10至10⁹的猪水疱病病毒核酸模板进行荧光LAMP扩增，结果如图4所示，稀释度为10至10⁹的阳性样品均出现实时荧光增长曲线，具有较强的实时荧光信号，不同稀释度的阳性样品均在25min以内出现扩增曲线，方法的灵敏度达到10拷贝。

2.5 稳定性试验

对批内和批间各自的Ct值用SPSS13.0分析，2次批内变异系数分别为0.85％和0.93％，批间变异系数为1.34％，说明批内和批间的稳定性差异很小，符合程度较高，结果稳定，见图5A和图5B。

2.6 样品检测结果

如图6所示，8份样品的检测结果均为阴性。

3 讨论

3.1 各类SVDV检测方法

猪水疱病常用检测方法中，VI法、VN法和ELISA法耗时长、重复性差且易出现假阳性，这些方法与生物晶片、免疫色层分析测试片均不适用于大规模的实验室的筛查检测。随后，RT-PCR法的出现使SVDV检测方法得到了丰富、改进和提高，但其自身的灵敏度、可能存在的交叉污染及无法定量检测的问题也决定了其无法完全取代之前的检测手段。20世纪90年代以后，随着荧光标记技术的迅速发展，具有敏感、特异、快速、高通量等优点的Real time RT-PCR法开始被大型实验室广泛采用，而本发明所使用的荧光LAMP法除具有上述Real time RT-PCR法的优点外，特异性高(引物结合点多)、耗时短(一般为40-60min)、检测成本低(无需合成探针)、检测过程恒温(一般为60-65℃)是其独有的优势，且反应过程中所采用的Bst聚合酶对血液、细胞培养液等各种物质表现出的耐受性高于Real time RT-PCR法反应过程中所采用的Taq聚合酶。因此，相对于其它检测方法，荧光LAMP法更适用于无法进行或不便进行病毒分离的大规模样品检测，在临床检测和流行病学调查中也具有十分重要的推广意义。

3.2 引物及其扩增产物

荧光LAMP反应依赖于具有高链置换活性的Bst聚合酶和两对内外引物(FIP、BIP和F3、B3)进行基础扩增，并依靠环引物(LF、LB)加速反应进程、提高扩增效率。因此，内、外、环引物的设计均十分关键，且其扩增产物的片段长度也直接影响着扩增效率，更有研究显示环状引物的参与能使荧光LAMP法的检测灵敏度达到或超过Real-time PCR法。考虑引物特异性及扩增效率等因素，本发明建立的方法其扩增产物片段大小为220bp。

3.3 特异性和灵敏度

本发明选取了发病症状与研究对象猪水疱病相似的水疱性口炎、口蹄疫和猪水疱疹的弱毒苗和基因作为参照对象，以充分验证所建立方法的特异性，实验结果可见，SVDV出现扩增曲线，VSV、FMDV和VESV均未出现扩增曲线，表明所建立的方法特异性强，能够显著区别于具有相似症状的其他病毒。同时，灵敏度试验结果可见稀释度为10¹至10⁹的阳性样品均出现扩增曲线且时间小于25min，表明所建立的方法灵敏度高，可达到10个拷贝的数量级。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 用于检测猪水疱病病毒的荧光引物及其检测方法

<160> 6

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

CGAAGTTGTCGCCATCGGAGTGGAGAACTTCCTGTGC

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

CACACGGCAAGTTGCTCAACACGAAGGTCAACTCCAGA

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

AAGTTGTACCATCAGACACAAT

<210>4

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

TGTTCCTGAGTGCTAGTGA

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

TCATGGTTCTTGTATGTGGTGT

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

TCGGAAGCTCGAACTGTTC