本发明涉及一种瑞鲍迪苷d的提取方法，具体涉及一种从甜菊糖苷精制母液中提取高纯度瑞鲍迪苷d的方法。
背景技术：
甜菊糖苷中的主要糖苷有甜菊苷（st）和瑞鲍迪苷a（ra），其他已知糖苷包括瑞鲍迪苷b（rb）、瑞鲍迪苷c（rc）、瑞鲍迪苷d（rd）、瑞鲍迪苷f（rf）、杜克苷a、甜茶苷和甜菊双糖苷。
近年来研究发现，甜菊糖苷中口感最好的成分不是甜度最高的ra，而是rd，rd的甜度大约是蔗糖的150倍，口感好，无苦涩味，但是，rd在甜叶菊中的含量很低，仅1%左右，因此，想要高回收率的提取高纯度的rd较为困难。
cn102060892a公开了一种甜菊糖甙rd的提纯方法，是将母液糖料液流过大孔吸附树脂，再用乙醇洗脱，分段收集洗脱液，浓缩，干燥，精制，得到rd。但是，由于大孔树脂的吸附选择性差，通过分段洗脱，通过确定临界点的方法收集rd的可操作性较低，rd难以富集，因此，rd的收率不高。
cn102406113a公开了一种ra和rd复配甜菊糖的制备方法，是以甜叶菊为原料，通过水提取，大孔树脂吸附，洗脱，脱色，结晶，重结晶等步骤，得到ra和rd的混合产品。但是，该方法无法获得高含量的rd。
cn103709215a公开了一种从甜菊糖结晶母液糖中提取莱鲍迪甙d的方法，是将甜菊糖母液糖用水和甲醇保温，搅拌，反复结晶，得到rd产品。但是，该方法因结晶次数过多，收率较低，且rd的纯度仅50%左右。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种所得产品纯度、收率高，产品附加值高，绿色环保，成本低，适用于工业化生产的从甜菊糖苷精制母液中提取高纯度瑞鲍迪苷d的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种从甜菊糖苷精制母液中提取高纯度瑞鲍迪苷d的方法，包括以下步骤：
（1）结晶除杂：将甜菊糖苷精制母液加入醇溶液中，加热溶解，冷却析晶，过滤，得滤液；
（2）反相硅胶拌样：将步骤（1）所得滤液减压浓缩至无醇，在浓缩液中加入反相硅胶，混合均匀，干燥至恒重，得拌样硅胶；
（3）装柱：在空层析柱中，先装入反相硅胶，再在反相硅胶上装入步骤（2）所得拌样硅胶；
（4）洗脱：用洗脱剂对步骤（3）装柱后的层析柱进行洗脱，收集目标洗脱流出液，浓缩，干燥，得瑞鲍迪苷d粗品；
（5）精制：将步骤（4）所得瑞鲍迪苷d粗品用有机溶剂或水加热溶解，冷却，析晶，过滤，干燥，得瑞鲍迪苷d精品。
优选地，步骤（1）中，所述甜菊糖苷精制母液中瑞鲍迪苷d的质量含量为5～30%（更优选6～10%）。本发明所述甜菊糖苷精制母液来源于以甜叶菊提取物为原料，用有机溶剂结晶制备高纯瑞鲍迪苷a（ra）、甜菊苷（st）时所产生的母液。
优选地，步骤（1）中，所述醇溶液的用量为甜菊糖苷精制母液质量的4～20倍（更优选5～10倍）。
优选地，步骤（1）中，所述醇溶液中的醇为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇等中的一种或几种，醇溶液的体积浓度为50～99%。
优选地，步骤（1）中，所述加热溶解的温度为40～60℃。
优选地，步骤（1）中，所述冷却析晶的温度为10～25℃，时间为12～24h。
步骤（1）中，析晶过滤后的滤渣中含有高含量的ra和st，可用现有技术对这两种原料进行提取。
优选地，步骤（2）中，所述减压浓缩的温度为60～90℃，真空度为-0.06～-0.09mpa。
优选地，步骤（2）中，所述干燥的温度为60～90℃。
优选地，步骤（2）中，所述反相硅胶的用量为浓缩液质量的1～2倍。拌样的目的是使物料能和反相硅胶充分吸附；若反相硅胶的用量过少，则物料无法完全吸附；若反相硅胶的用量过多，则易造成浪费并增加洗脱的难度。
优选地，步骤（2）中，所述反相硅胶的类型为c4、c8或c18等中的一种或几种。
优选地，步骤（3）中，所述反相硅胶的用量为拌样硅胶质量的1～20倍（更优选5～15倍）。先加入反相硅胶的目的是，提供一个缓冲区域，使洗脱过程中各种成分在反相硅胶中保留不同的时间。若反相硅胶的用量过少，则各种成分保留的相对时间太接近，无法达到分离的目的；若反相硅胶的用量过多，则易造成浪费并增加洗脱剂的用量。
优选地，步骤（3）中，所述层析柱的高径比为5～20:1。若高径比过小，则分离的效果差；若高径比过大，将增加洗脱剂的用量和洗脱的时间。
优选地，步骤（4）中，所述洗脱剂的用量为2～10bv，洗脱的流速为0.5～2.0bv/h。所述1bv=1个柱床体积。所述目标洗脱流出液是通过薄层层析检测含有瑞鲍迪苷d的洗脱流出液段。
优选地，步骤（4）中，所述洗脱剂为体积浓度40～95%（更优选50～80%）的甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙腈、乙酸、丙酮、乙酸乙酯溶液或水等中的一种或几种。
优选地，步骤（4）中，浓缩至无溶剂，干燥至恒重。
优选地，步骤（5）中，所述有机溶剂或水的用量为瑞鲍迪苷d粗品质量的4～20倍（更优选4.5～10倍）。
优选地，步骤（5）中，所述有机溶剂为体积浓度40～95%（更优选60～90%）的甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、丙酮或乙酸乙酯溶液等中的一种或几种。
优选地，步骤（5）中，所述加热溶解的温度为40～60℃。
优选地，步骤（5）中，所述析晶的温度为10～25℃，时间为12～24h。
本发明方法的原理为：由于甜菊糖苷精制母液中rd的含量普遍不高，用醇溶解后难以达到rd可以结晶的浓度，rd不会结晶析出，而其它杂质成分，如ra和st的含量高，则可以在醇溶液中大量结晶析出，先将析出的杂质过滤之后，绝大部分rd就留在了结晶母液中，由此提高了rd的含量，降低了后续反相硅胶柱层析的难度。反相硅胶的特性之一是在洗脱过程中，极性大的成分先流出，极性小的成分后流出，rd是所有甜菊糖苷中极性最大的，因此，在反相硅胶柱的洗脱中是最先流出的，由此可以高效的将rd和其它糖苷分离，最后通过重结晶，得到高纯度的rd精品。
本发明方法的有益效果如下：
（1）本发明方法可以从廉价的甜菊糖苷精制母液中提取出高纯度的rd，所得rd精品呈白色结晶性粉末，经高效液相色谱法检测，rd的纯度可高达99.0wt%，rd的最终收率可高达92.4%，提高了甜叶菊资源的利用率；
（2）本发明方法原料天然，所采用的物理提取方式，生产过程绿色环保，成本低，产品纯净、无污染，rd的售价是原料的10倍以上，产品附加值高，适用于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的甜菊糖苷精制母液来源于湖南华诚生物资源股份有限公司以甜叶菊提取物为原料，用有机溶剂结晶制备高纯ra、st时所产生的母液，经高效液相色谱外标法检测，rd的质量含量为6.5%；本发明实施例所使用的c4、c8和c18反相硅胶均购于大连依利特分析仪器有限公司；本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
实施例1
（1）结晶除杂：将100g甜菊糖苷精制母液加入500g体积浓度为80%的乙醇溶液中，在40℃下，加热溶解，然后再在25℃下，冷却析晶16h，过滤，得滤液；
（2）反相硅胶拌样：将步骤（1）所得滤液在65℃，真空度为-0.06mpa下，减压浓缩至无醇，得60g浓缩液，在60g浓缩液中加入c4反相硅胶60g，混合均匀，在70℃下，干燥至恒重，得100g拌样硅胶；
（3）装柱：在高径比为15:1的空层析柱中，先装入1000gc4反相硅胶，再在c4反相硅胶上装入步骤（2）所得100g拌样硅胶；
（4）洗脱：用3bv，体积浓度为70%的乙腈溶液对步骤（3）装柱后的层析柱，在0.5bv/h的流速下，进行洗脱，通过薄层层析检测，收集含有瑞鲍迪苷d的目标洗脱流出液，浓缩至无乙腈，干燥至恒重，得7.6g瑞鲍迪苷d粗品；
（5）精制：将步骤（4）所得7.6g瑞鲍迪苷d粗品用38g体积浓度为85%的甲醇溶液，在50℃下，加热溶解，冷却至室温，在10℃下，析晶24h，过滤，干燥，得6.1g瑞鲍迪苷d精品。
本实施例所得瑞鲍迪苷d精品呈白色结晶性粉末，经高效液相色谱外标法检测，所得瑞鲍迪苷d精品的纯度为98.5wt%，瑞鲍迪苷d的最终收率为92.4%。
实施例2
（1）结晶除杂：将50g甜菊糖苷精制母液加入300g体积浓度为55%的异丙醇溶液中，在60℃下，加热溶解，然后再在15℃下，冷却析晶12h，过滤，得滤液；
（2）反相硅胶拌样：将步骤（1）所得滤液在85℃，真空度为-0.08mpa下，减压浓缩至无醇，得35g浓缩液，在35g浓缩液中加入c8反相硅胶70g，混合均匀，在90℃下，干燥至恒重，得82g拌样硅胶；
（3）装柱：在高径比为10:1的空层析柱中，先装入440gc8反相硅胶，再在c8反相硅胶上装入步骤（2）所得82g拌样硅胶；
（4）洗脱：用5bv，体积浓度为60%的甲醇溶液对步骤（3）装柱后的层析柱，在1bv/h的流速下，进行洗脱，通过薄层层析检测，收集含有瑞鲍迪苷d的目标洗脱流出液，浓缩至无甲醇，干燥至恒重，得3.9g瑞鲍迪苷d粗品；
（5）精制：将步骤（4）所得3.9g瑞鲍迪苷d粗品用30g体积浓度为90%的乙醇溶液，在55℃下，加热溶解，冷却至室温，在10℃下，析晶18h，过滤，干燥，得2.95g瑞鲍迪苷d精品。
本实施例所得瑞鲍迪苷d精品呈白色结晶性粉末，经高效液相色谱外标法检测，所得瑞鲍迪苷d精品的纯度为99.0wt%，瑞鲍迪苷d的最终收率为89.9%。
实施例3
（1）结晶除杂：将1kg甜菊糖苷精制母液加入8kg体积浓度为95%的甲醇溶液中，在50℃下，加热溶解，然后再在20℃下，冷却析晶24h，过滤，得滤液；
（2）反相硅胶拌样：将步骤（1）所得滤液在60℃，真空度为-0.09mpa下，减压浓缩至无醇，得650g浓缩液，在650g浓缩液中加入c18反相硅胶650g，混合均匀，在75℃下，干燥至恒重，得1.1kg拌样硅胶；
（3）装柱：在高径比为20:1的空层析柱中，先装入16.5kgc18反相硅胶，再在c18反相硅胶上装入步骤（2）所得1.1kg拌样硅胶；
（4）洗脱：用10bv，体积浓度为50%的乙醇溶液对步骤（3）装柱后的层析柱，在1.5bv/h的流速下，进行洗脱，通过薄层层析检测，收集含有瑞鲍迪苷d的目标洗脱流出液，浓缩至无乙醇，干燥至恒重，得77g瑞鲍迪苷d粗品；
（5）精制：将步骤（4）所得77g瑞鲍迪苷d粗品用380g体积浓度为60%的正丁醇溶液，在55℃下，加热溶解，冷却至室温，在25℃下，析晶24h，过滤，干燥，得60g瑞鲍迪苷d精品。
本实施例所得瑞鲍迪苷d精品呈白色结晶性粉末，经高效液相色谱外标法检测，所得瑞鲍迪苷d精品的纯度为98.6wt%，瑞鲍迪苷d的最终收率为91.0%。