本发明属于分子生物学特别是基因诊断领域，尤其是pak5在癌症诊断预后治疗及药物筛选中的应用。
背景技术：
：：肾细胞癌(renalcellcarcinoma,rcc)，又称肾癌，约占所有恶性肿瘤的3％(jemal,a.,etal.,cancerstatistics,2010.cacancerjclin,2010.60(5):p.277-300)，其起源于肾小管上皮，主要由透明细胞癌、嫌色细胞癌以及乳头状癌等构成，其中，以肾透明细胞癌最为多见，约占总体的4/5(zeng,z.,etal.,astudyexploringcriticalpathwaysinclearcellrenalcellcarcinoma.expthermed,2014.7(1):p.121-130.)。近年来，肾癌的发病率逐年上升，并且逐渐低龄化，据统计，其发病率以每年约2.5％的速度增长(cohen,h.t.andf.j.mcgovern,renal-cellcarcinoma.nengljmed,2005.353(23):p.2477-90.)。对于早期肾癌，手术切除是主要的治疗手段，且大部分早期肾癌的患者可通过手术治疗得到根治。然而，由于肾癌早期症状不明显，病情进展较快，在确诊时通常就有20～30％的患者存在转移性病变，错过了手术最佳时间，而肾癌本身对放化疗不敏感，且自身免疫治疗效果欠佳(bleumer,i.,etal.,immunotherapyforrenalcellcarcinoma.eururol,2003.44(1):p.65-75.)，因此，发现与肾癌转移相关的特异性蛋白，并研究其生物学特性和分子机制，对于早期诊断肾癌、控制肾癌的转移、延长晚期肾癌患者的生存时间并提高其生活质量至关重要。肾癌是一种泌尿系统独特的恶性肿瘤，临床表现及肾外表现极为丰富，临床病理学高度多样，很难做到早期诊断和治疗。血尿、疼痛和腹部包块称为肾肿瘤的三联征。值得注意的是目前肾癌中有30％～50％病例系偶然发现的无症状患者。三联征齐全时多已属晚期，且30％的肾癌在诊断时已有或将发生转移病变(jonasch,e.,j.gao,andw.k.rathmell,renalcellcarcinoma.bmj,2014.349:p.g4797)。肾癌的主要治疗方法是外科手术根治，但即使早期肾癌患者手术后，仍有30.4％将发生转移。转移性肾癌预后较差，对放化疗等治疗不敏感，平均生存时间仅3.33个月，3年存活率低于5％(maclennan,s.,etal.,systematicreviewofoncologicaloutcomesfollowingsurgicalmanagementoflocalisedrenalcancer.eururol,2012.61(5):p.972-93)。随着影像学的发展，尤其是超声的广泛应用和ct检测的普及，越来越多的肾癌被早期诊断。但是依然有相当多的患者发现时已经是晚期或者局部晚期，单纯手术预后差。肾癌的组织病理类型较多，尚有形态学不明确的病理亚型，而且不同病理类型的肾癌具有不同的临床特点、治疗方案和预后。肾癌恶性程度决定其手术方式，术前影像学技术只能判别其临床分期，尚不能提示肿瘤恶性程度。目前国内肾癌一线化疗药索拉非尼对于肾癌的辅助治疗和新辅助治疗有显著的效果，但是部分患者出现化疗耐药(poprach,a.,etal.,efficacyofsunitinibinpatientswithmetastaticorunresectablerenalcellcarcinomaandrenalinsufficiency.eurjcancer,2015.51(4):p.507-13)。晚期或局部晚期的肾癌预后较差。所以对肾癌患者的早期诊断对于该病的鉴别病理分型、提示恶性程度、监测化疗耐药以及预后复发判断的十分重要，但是目前对于肾癌乃至多数实体瘤来说尚未找到合适的早期诊断和预后随访生物标志物。而目前已有的研究显示某些蛋白质有可能会成为一种潜在的早期诊断和治疗肾癌的新途径。技术实现要素：本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。鉴于上述和/或现有治疗癌症的技术空白，提出了本发明。因此，本发明其中的一个目的是解决现有技术中的不足，提供一种pak5基因或pak5蛋白在制备诊断或预后癌症的试剂或试剂盒的用途。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：对pak5基因或pak5蛋白进行定量检测的试剂以及相应的标签或说明书；其中，所述癌症，其为肾癌。本发明的另一个目的是解决现有技术中的不足，提供一种癌症诊断试剂盒。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括，该试剂盒含有容器，容器中含有核酸探针，其中的核酸探针为pak5基因特异性核酸探针；其中，所述癌症，其为肾癌。作为本发明所述癌症诊断试剂盒的一种优选方案，其中：所述探针，其偶联有可检测基团。作为本发明所述癌症诊断试剂盒的一种优选方案，其中：所述可检测基团选自生色团、化学发光基团、荧光团或同位素。本发明的另一个目的是解决现有技术中的不足，提供一种癌症诊断试剂盒。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：该试剂盒含有容器，容器中含有抗体，其特征在于：包括，其中，所述抗体是抗pak5抗体；其中，所述癌症，其为肾癌；其中，所述抗pak5抗体，其偶联有可检测基团。作为本发明所述癌症诊断试剂盒的一种优选方案，其中：所述可检测基团，其为自生色团、化学发光基团、荧光团或同位素。本发明的另一个目的是解决现有技术中的不足，提供一种pak5蛋白或其核酸序列在制备癌症诊断试剂或试剂盒的用途；其中，所述癌症，其为肾癌；其中，所述癌症诊断试剂是抗pak5蛋白特异性抗体或pak5基因的特异性核酸探针。本发明的另一个目的是解决现有技术中的不足，提供一种筛选治疗癌症的候选化合物的方法。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括，测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中pak5的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中pak5的表达量和/或活性；其中，若测试组中细胞的pak5的表达量和/或活性大于对照组，就表明该测试化合物是对pak5的表达和/或活性有促进作用的治疗癌症的候选化合物。作为本发明所述筛选治疗癌症的候选化合物的方法的一种优选方案，其中：包括，测试组中，癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察癌细胞的数量和/或生长情况；在对照组中，在癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察癌细胞的数量和/或生长情况；其中，若测试组中癌细胞的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对癌细胞的生长或增殖有抑制作用的治疗癌症的候选化合物。本发明的另一个目的是解决现有技术中的不足，提供一种pak5基因或pak5蛋白或其抑制剂在制备治疗癌症的药物中的用途；其中，所述癌症，其为肾癌。本发明的有益效果：本发明发现了一种诊断肾癌的分子标志物，使用该分子标志物可以在肾癌发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。另外，通过预测患者的预后，本发明能够提供有意义的信息来为患者决定治疗方案策略。本发明的包括pak5基因或蛋白的抑制剂的治疗药物可用作新的肾癌的治疗药物。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1显示利用qpcr检测pak5基因在肾癌组织与癌旁正常肾组织中的表达情况。图2显示利用免疫组织化学法检测pak5蛋白在肾癌组织与癌旁正常肾组织中的表达情况。图3显示利用westernblot检测sirna对pak5基因的干扰效率。图4显示抑制pak5基因表达对肾癌细胞增殖的影响。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。pak5蛋白和多核苷酸在本发明中，“本发明蛋白”、“本发明多肽”、“pak5蛋白”可互换使用，指简称为pak5。应理解，所述术语还包括pak5的活性片段和衍生物。在本发明中，“本发明基因”、“本发明多核苷酸”指编码pak5蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正义和反义核酸。在本发明中，术语“pak5蛋白”、“pak5多肽”或“癌症标志物pak5”可互换使用，都指具有人蛋白pak5氨基酸序列的蛋白或多肽。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。抗体本发明还包括对pak5蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人pak5基因产物或片段。较佳地，指那些能与pak5基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链fv分子；或嵌合抗体。激动剂和药物组合物利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与pak5蛋白发生相互作用的物质，尤其是激动剂等。本发明pak5蛋白的激动剂，当在治疗上进行施用(给药)时，可促进pak5蛋白的表达和/或活性，进而抑制癌细胞(包括肾癌)的生长或增殖。通常，可将这些激动剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地ph约为6-8，尽管ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明pak5蛋白或其激动剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克～10毫克/千克体重。检测方法和试剂盒本发明还涉及定量和定位检测人pak5蛋白水平或mrna水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人pak5蛋白水平，可以用于诊断肾癌。一种检测样品中是否存在pak5蛋白的方法是利用pak5蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与pak5蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在pak5蛋白。pak5蛋白或其多核苷酸可用于pak5蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或dna芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗pak5的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的pak5蛋白。本发明还提供了一种检测肾癌的试剂盒，它含有特异性扩增pak5的引物对和/或pak5特异性抗体。筛选方法本发明还提供了基于pak5进行药物筛选的方法。一种方法是先筛选影响(促进)pak5表达或活性的化合物，然后对筛选出的化合物进一步测试其对癌细胞。一种筛选方法可基于pak5的mrna的表达水平。其中，代表性的癌细胞包括(但不限于)：肾癌细胞。实施例1本发明基因的差异表达1、样品收集：肾癌组织样品：收集肾癌患者，全部患者均经手术治疗，包括34对肾癌及其癌旁正常肾组织。所有患者均经过病理检查确诊患有肾癌。其他入组条件为：所有患者入院前未接受过任何治疗：未合并其它恶性肿瘤；未合并其它激素相关性疾病；临床资料完整。2、在mrna水平上进行验证2.1提取组织rna：使用trizol一步法提取组织总rna，通过nanodropnd-1000读取260nm和280nm处的吸光度值(od值)测定rna溶液的浓度。经1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察，检查rna的完整性。2.2逆转录使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对1μg总rna进行逆转录合成cdna。采用25μl反应体系，每个样品每个样品取1μg总rna作为模板rna，在pcr管中分别加入以下组分：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmol/ldntp，0.1mmol/l/dtt，30μmol/loligodt，200u/μlmmlvrt，模板rna。42℃孵育1小时，72℃10分钟，短暂离心。2.3pcrpak5基因引物序列如下：上游引物：5’-tgttcatgcattctagagaaagtgg-3’下游引物：5’-gcatttcaccacagtgtatttctga-3’gapdh基因引物序列如下：上游引物：5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’下游引物：5’-ggtggaatcatattggaaca-3’以上引物序列由上海生工生物工程股份有限公司提供。2.4结果结果如图1所示，与癌旁正常肾组织相比，肾癌组织中pak5基因的mrna水平明显上调，差异具有统计学意义(p<0.05)实施例2pak5蛋白的差异表达1、样品收集：肾癌组织样品：收集肾癌患者，全部患者均经手术治疗，包括307例肾癌标本和34例正常肾组织的组织芯片。所有患者均经过病理检查确诊患有肾癌。其他入组条件为：所有患者入院前未接受过任何治疗：未合并其它恶性肿瘤；未合并其它激素相关性疾病；临床资料完整。2、按照如下方法检测pak5的表达水平：(1)封闭过氧化物酶：取组织芯片进行脱蜡，脱蜡至水化(脱蜡过程如下：二甲苯ⅰ10min→二甲苯ⅱ10min→无水乙醇5min→95％乙醇5min→85％乙醇5min→75％乙醇5min)后，用3％h2o2溶液于暗处封闭内源性过氧化物酶，室温孵育15min；(2)蒸馏水漂洗：切片置于蒸馏水中，摇床上洗5min/次，共三次；(3)抗原修复：加入ph8.0的tris-edta或ph6.0的柠檬酸钠溶液，在95℃水浴锅中水浴50min，进行抗原修复；(4)蒸馏水漂洗：取出切片，自然冷却至室温后，用蒸馏水洗三遍，再用washbuffer润洗一次；(5)孵育一抗：用免疫组化笔将组织圈住，在圈内滴加pak5抗体液(为pak5抗体与抗体稀释液混合配制，二者比例为1:100)，4℃孵育过夜；(6)蒸馏水漂洗：用蒸馏水洗三遍，washbuffer润洗一次；(7)滴加二抗：滴加hrp标记的二抗工作液(为hrp二抗与抗体稀释液混合配制，二者比例为1:1)，室温孵育60min；(8)蒸馏水漂洗：蒸馏水洗3次，每次5min；(9)dab显色：滴加显色底物dab，在显微镜下观察显色情况，于蒸馏水中终止反应；(10)苏木素复染：将切片放入苏木素染液中染色2min，1％盐酸酒精分化后，流水冲洗10min；(11)脱水透明：经80％、95％、100％梯度酒精脱水、二甲苯透明，于通风厨中干燥；(12)封片：用中性快干胶封片，在光学显微镜下观察，采图。采图后，根据肺癌患者和远端组织的肿瘤细胞染色强度及阳性面积给予免疫组化评分。3、免疫组化评分标准：肿瘤细胞染色强度*肿瘤细胞阳性面积＝0-9分，结果统计：阴性：0分；低度阳性：1-3分；高度阳性>3分。其中，肿瘤细胞染色强度、阳性面积的评分如下：由两名经验丰富的病理医生独立对肿瘤细胞染色强度结果进行评分。4、结果分析：采用spss16.0肾癌组织组和癌旁正常肾组织对照组进行统计学分析。结果如图1所示，与癌旁正常肾组织相比，肾癌组织中pak5蛋白的表达水平明显上调，差异具有统计学意义(p<0.001)。实施例3抑制pak5基因的表达1、sirna的设计合成针对pak5的sirna序列：5’-caaagtcttcgtacctgaatc-3’阴性对照序列：5’-ucuacucuuucuaggagguuguga-3’以上sirna序列与阴性对照sirna序列(sirna-nc)均由上海艾博思生物科技有限公司提供。2、肾癌细胞的培养与转染2.1细胞培养786-o细胞培养于rpmi1640培养基(含10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100g/ml链霉素)中，achn细胞培养于dmem培养基(含10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100g/ml链霉素)中，均在37℃，5％co2饱和湿度的培养箱中连续培养。2.2细胞转染(1)转染前24小时，在500μl无双抗培养基中接种1-2*105个细胞，转染时细胞融合度为30-50％。铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长。(2)用50μl无血清培养基稀释sirna(转染细胞的终浓度为33nm，轻轻吹吸3-5次混匀)。(3)轻轻颠倒混匀转染试剂，用50μl无血清培养基稀释1μllipofectamine2000轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。(4)混合转染试剂和sirna稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。(5)转染复合物加入到24孔细胞板中，100μl/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。(6)细胞板置于37℃，5％co2培养箱中培养18-48小时。转染4-6小时后可换新鲜培养基。3、利用westernblot检测sirna的干扰效率3.1提取细胞总蛋白利用常规方法进行操作。3.2将提取的蛋白定量进行sds-page电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色。3.3统计学处理：使用imagej软件对蛋白条带的灰度值进行分析，以β-actin为内参，将目的条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss16.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。3.4结果结果如图3所示，sirna-pak5能够有效地抑制pak5蛋白的表达，差异具有统计学意义。实施例4pak5基因的表达对肾癌细胞增殖能力的测定1、步骤：1.1取对数生长期的肾癌细胞，消化、离心后以5*103个/孔接种于96孔板中，设置4个复孔，每孔加培养基至100μl，融合度为60％时转染。将细胞培养板在培养箱中预培养24h(37℃，5％co2的条件下)。1.2用lipofectamine2000试剂进行转染(空白组转染pbs、模拟阴性对照组转染空载体、实验组转染sirna-pak5小干扰片段)，8-12h即可，12h后直接弃去转染液，加新鲜培养基测24h增殖情况。1.3转染成功后加入10μlcck-8溶液(注意在孔中不要生成气泡，它们会影响吸光度，即od值的度数)。1.4将培养板在37℃，5％co2细胞培养箱内孵育4h(需根据自己细胞于0.5、1、2、4h分别测1次，选od值在0.2-2.0的结果较好的1次的时间点作为孵育时间点)。1.5用酶标仪测定在450nm处各孔的od值。1.6如果暂时不测定od值，打算以后测定，可以向每孔中加入10μlstopsolution，并遮盖培养板避光保存在4℃条件下，在7天内吸光度不会发生变化。2、结果检测结果如图4所示，与转染sirna-nc的细胞对照组相比，转染sirna-pak5的肾癌细胞的增殖能力明显受到抑制。上述实验结果表明，pak5基因表达促进了肾癌细胞的增殖。实施例5transwell实验检测pak5基因表达对细胞侵袭能力的影响1、步骤：1.1从-20℃的冰箱中取出冻存的matrigel胶，然后在4℃温度条件下过夜，使其变为液体。1.2取出200μl无血清细胞培养基，加入50μl的matrigel试剂，在低温条件，最好是在冰面上操作将其混合均匀，然后各加入100μl，放在37℃，5％co2的培养箱中培育5h，此间常观察液体情况，当液体变成稍白色时，说明其已变为凝固态。1.3将转染过的细胞用胰酶消化，用不含血清的培养基清洗2次，然后计数，再将其配成细胞悬浮液。1.4用无血清的培养基将凝胶轻轻洗1次，然后将4*104个786-o细胞悬浮于100μlrpmi1640培养基中(1*105个achn细胞悬浮于100μldmem培养基中)，再接种于transwell上室。1.5下室中加入480μl对应的培养基和120μlfbs。1.637℃培养箱中，培养12h后，取出transwell小室，每组均重复3个样品。1.7其中1个小室弃去培养基，用pbs洗3遍，4％多聚甲醛固定10min，棉签擦掉上层未穿过上室的细胞，pbs洗3遍，结晶紫染色，在显微镜下观察。剩余2个小室同样方式处理观察。2、结果：侵袭实验结果显示，转染sirna-nc的786-o细胞组侵袭个数平均为214个，achn细胞组为287个，转染sirna-pak5的786-o细胞组侵袭个数平均为94个，achn细胞组为135个，差异具有统计学意义(p<0.05)。应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页12当前第1页12