一种荧光定量检测方法与流程

本发明涉及一种荧光定量检测方法，属于荧光检测领域。

背景技术：

荧光定量检测方法即pcr定量方法，有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量pcr无需内标是建立在两个基础之上的：

1）ct值的重现性pcr循环在到达ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的ct值是恒定的。2）ct值与起始模板的线性关系由于ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量pcr是一种采用外标准曲线定量的方法。

但是现有技术的荧光定量检测方法，适用性较差，效率低，并且影响检测精度。

技术实现要素：

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种适用范围广，能够快速校对的检测效率、精度高的方案详尽，切实可行的荧光定量检测方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种荧光定量检测方法，包括以下步骤：

第一步，通过机械结构的固定，保证摄像机器的位置与光纤组件导光的位置不会偏移，在此条件下，定位光纤组件的位置；定位完成后，对摄像机器和光纤组件的位置进行一一对应；校正因为安装等不确定因素，造成的光纤导光率的不一致；

第二步，根据待测物的需要，设定试管件环境的温度；利用高精度测温探头对装有待测物的试管件进行测温，获取温度值传输给控制分析模块；控制分析模块根据温控算法控制制冷片制冷，调节试管件的温度，将装有待测物的试管件控制在设定温度；利用高精度测温探头对试管件进行测量校准，调整温控算法所涉及到的系数，进而调节制冷片的制冷量；当试管件达到预设温度，控制分析模块控制制冷片制冷量，使试管件保持恒温；

第三步，进行检测：激发光源模块进行发光，光线透过激发滤光片并通过激发光纤照射到待测物上，待测物产生荧光，所述荧光通过接收光纤并透过接收滤光片射出，摄像机器捕获光后，传输给控制分析模块的处理器进行数据分析；

第四步，采集数据，随着pcr反应的进行，pcr反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加；每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线；

第五步，修正荧光扩增曲线，通过修正算法公式将需要绘图的点光滑且不失真的表达；

第六步，设定荧光阈值为threshold，求取荧光阈值与修正荧光扩增曲线的交点；

第七步，根据ct值，完成样品的检测。

本发明在对待测物进行荧光反射之前，对摄像机器与光纤组件的位置进行校对，能够有效提高检测精度，适用性强。并对待测物进行温度控制，确保待测物处于恒温环境，避免因为温度的变化，影响待测物的活性，进而影响待测物的荧光反射情况，有效提升本发明的检测精确度。并且工序合理，能够有效提升检测效率。

作为优选技术措施，荧光域值（threshold）是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是pcr反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍，即：threshold，可根据实际需要灵活选择。

作为优选技术措施，第一步，进行定位的方法：采用特殊稳定的管腔件待测物，对放入管腔件的待测物，将光导入摄像机器后，由软件计算去除过明及过暗的像素点，保留正常的像素点，并且一一记录这些像素点的位置；对第一个孔位进行照射，摄像机器拍照后，得到一张图片，软件将该图片的每一个像素的值均数字化，参照设定的标准(50-200)，将所有不满足的像素全部剔除，并计算剩余像素点的位置的直径，直径单位为像素，并参照设定的标准，如果剔除后剩下的像素点位置，直径为小于等于设定像素值，软件记录所有像素点的位置，并保留做为第1孔位的光纤位置。

作为优选技术措施，进行对应的方法：当管腔件中的待测物，产生荧光时，会通过光纤束将光传输给摄像机器，摄像机器捕获光后，对捕获的光所在的像素位置进行比较，如果是在之前定位的位置之外，则认为是干扰光，予以剔除；若在之前孔定位的位置范围内，则保留光的数据，并且根据定位的位置，一一计算孔位；以孔位1为例，当接收光完成后，对比光的像素位置，保留定位的孔位1的位置，将所有的在孔位1的位置的光的值全部读出来，并且去除本底噪音，将所有的在孔位1的位置的像素的值全部相加，并除以孔位1所在的像素的个数，即得到孔位1的荧光的数值；将该数值发送给数据显示端，数据显示端显示后，实验人员能够清晰的感觉到每次实验的荧光的变化。

作为优选技术措施，进行校正的方法：用一高亮度的且稳定的荧光试剂对每个孔位进行一一照射，设定孔位数为96，得到荧光值a1--a96，同理，用中亮度照射，得到b1--b96，再用低亮度照射，得到c1--c96，最后用水最为本底，得到d1--d96；将a、b、c的值分别对应减去d的值，得到e1--e96、f1--f96、g1--g96；将e、f、g的值分别平均，得到e平、f平、f平；用e1--e96的值分别除以e平，得到x1--x96，f的值除以f平，得到y1--y96，g的值除以g平，得到z1--z96，之后将每个孔位的x、y、z三个数字加权平均，得到最终的伸张系数：系数1--系数96；最后的荧光值h=(拍照得到的荧光值i-(本底值-1))*系数+(1-1/系数)。

作为优选技术措施，第二步，所述温控算法为out=kc*(spn—pvn)+kc*ts/ti*(spn—pvn)+mx+kc*td/ts*(spn—pvn—spn-1+pvn-1)

其中out是最终的输出，

kc是回路增益，即比例系数，

spn是在采样时间n时设定点的温度值，

spn--1是在采样时间n--1时设定点的温度值，

pvn是在采样时间n时过程变量的温度值，

pvn--1是在采样时间n--1时过程变量的温度值，

mx是在采样时刻n--1时的积分项的数值，

td是回路的微分周期，也称为微分时间或速率，

ts是回路采样时间，

ti是回路的积分周期，也称为积分时间或复位，

kc的值为常数，需要边测试边调整，

mx的值为常数，需要边测试边调整，

td的值为常数，需要边测试边调整，

ti的值为常数，需要边测试边调整。

作为优选技术措施，经过实验得到：kc=1.65~1.85；mx=0.50~0.63；td=1.24~1.36；ti=0.80~0.94。

作为优选技术措施，第五步，所述的修正算法公式：

y1=x1；

y2=(x1+x2+x3)/3;

y3=(x1+x2+x3+x4+x5)/5;

y(n-2)=(x(n-2)+x(n-1)+xn+x(n+1)+x(n+2))/5;

y(n-1)=(x(n-2)+x(n-1)+xn)/3;

yn=yn;

xn为第n次循环实际采集的荧光强度信号，n=1,2,3,4…

yn为第n次循环修正后的荧光强度信号，n=1,2,3,4…

通过上述算法公式，将需要绘图的点光滑且不失真的表达，减少数据采集过程中受到的干扰。

作为优选技术措施，第六步，根据修正荧光扩增曲线以及荧光阈值做图，获得与两者交点的横坐标值gn相邻的两个整数横坐标：即gn在g1~g2之间，由于g1、g2表示具体某次循环数，通过采集的数据，获得g1对应的荧光亮度信号值p1，获得g2对应的荧光亮度信号值p2，进而带入ct计算公式进行计算，求出ct值。所述ct计算公式如下：

ct=g1+height/delta_p；

其中：height=threshold-p1，delta_p=p2-p1。

作为优选技术措施，第七步，根据ct值，求出样品的起始拷贝数；建立ct值与起始模板的对应关系公式，每个模板的ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下；ct=-1/lg(1+ex)*lgx0+lgn/lg(1+ex)；其中n为扩增反应的循环次数，x0为初始模板量，ex为扩增效率，n为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量；起始拷贝数越多，ct值越小；利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代ct值；因此，只要获得未知样品的ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明在对待测物进行荧光反射之前，对摄像机器与光纤组件的位置进行校对，能够有效提高检测精度，适用性强。并对待测物进行温度控制，确保待测物处于恒温环境，避免因为温度的变化，影响待测物的活性，进而影响待测物的荧光反射情况，有效提升本发明的检测精确度。

本发明通过修正算法，将采集的数据进行光滑且不失真的表达，减少数据采集过程中受到的干扰。

本发明的检测方法工序合理，方案详尽，切实可行，能够有效提升检测效率以及检测精度。

附图说明

图1-1为本发明第一实施例的荧光扩增曲线原始数据曲线；

图1-2为本发明第一实施例的修正荧光扩增曲线；

图2-1为本发明第二实施例的荧光扩增曲线原始数据曲线；

图2-2为本发明第二实施例的修正荧光扩增曲线；

图3-1为本发明第三实施例的荧光扩增曲线原始数据曲线；

图3-2为本发明第三施例的修正荧光扩增曲线；

图4为本发明的荧光阈值与修正荧光扩增曲线的交点示意图。

附图说明：

图1-1、1-2、2-1、2-2、3-1、3-2、4横坐标表示循环次数，纵坐标表示荧光强度信号；图4中虚线表示以荧光阈值为纵坐标画的直线，实线表示修正荧光扩增曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。

一种荧光定量检测方法，包括以下步骤：

第一步，通过机械结构的固定，保证摄像机器的位置与光纤组件导光的位置不会偏移，在此条件下，定位光纤组件的位置。进行定位的方法：采用特殊稳定的管腔件待测物，对放入管腔件的待测物，将光导入摄像机器后，由软件计算去除过明及过暗的像素点，保留正常的像素点，并且一一记录这些像素点的位置。对第一个孔位进行照射，摄像机器拍照后，得到一张图片，软件将该图片的每一个像素的值均数字化，参照设定的标准(50-200)，将所有不满足的像素全部剔除，并计算剩余像素点的位置的直径，直径单位为像素，并参照设定的标准，如果剔除后剩下的像素点位置，直径为小于等于设定像素值，软件记录所有像素点的位置，并保留做为第1孔位的光纤位置。

定位完成后，对摄像机器和光纤组件的位置进行一一对应。进行对应的方法：当管腔件中的待测物，产生荧光时，会通过光纤束将光传输给摄像机器，摄像机器捕获光后，对捕获的光所在的像素位置进行比较，如果是在之前定位的位置之外，则认为是干扰光，予以剔除。若在之前孔定位的位置范围内，则保留光的数据，并且根据定位的位置，一一计算孔位。以孔位1为例，当接收光完成后，对比光的像素位置，保留定位的孔位1的位置，将所有的在孔位1的位置的光的值全部读出来，并且去除本底噪音，将所有的在孔位1的位置的像素的值全部相加，并除以孔位1所在的像素的个数，即得到孔位1的荧光的数值。将该数值发送给数据显示端，数据显示端显示后，实验人员能够清晰的感觉到每次实验的荧光的变化。

校正因为安装等不确定因素，造成的光纤导光率的不一致。进行校正的方法：用一高亮度的且稳定的荧光试剂对每个孔位进行一一照射，设定孔位数为96，得到荧光值a1--a96，同理，用中亮度照射，得到b1--b96，再用低亮度照射，得到c1--c96，最后用水最为本底，得到d1--d96。将a、b、c的值分别对应减去d的值，得到e1--e96、f1--f96、g1--g96。将e、f、g的值分别平均，得到e平、f平、f平。用e1--e96的值分别除以e平，得到x1--x96，f的值除以f平，得到y1--y96，g的值除以g平，得到z1--z96，之后将每个孔位的x、y、z三个数字加权平均，得到最终的伸张系数：系数1--系数96。最后的荧光值h=(拍照得到的荧光值i-(本底值-1))*系数+(1-1/系数)。

第二步，根据待测物的需要，设定试管件环境的温度。利用高精度测温探头对装有待测物的试管件进行测温，获取温度值传输给控制分析模块。控制分析模块根据温控算法控制制冷片制冷，调节试管件的温度，将装有待测物的试管件控制在设定温度。所述温控算法为out=kc*(spn—pvn)+kc*ts/ti*(spn—pvn)+mx+kc*td/ts*(spn—pvn—spn-1+pvn-1)

其中out是最终的输出，

kc是回路增益，即比例系数，

spn是在采样时间n时设定点的温度值，

spn--1是在采样时间n--1时设定点的温度值，

pvn是在采样时间n时过程变量的温度值，

pvn--1是在采样时间n--1时过程变量的温度值，

mx是在采样时刻n--1时的积分项的数值，

td是回路的微分周期，也称为微分时间或速率，

ts是回路采样时间，

ti是回路的积分周期，也称为积分时间或复位，

kc的值为常数，需要边测试边调整，

mx的值为常数，需要边测试边调整，

td的值为常数，需要边测试边调整，

ti的值为常数，需要边测试边调整。

经过实验得到：kc=1.65~1.85。mx=0.50~0.63。td=1.24~1.36。ti=0.80~0.94。

利用高精度测温探头对试管件进行测量校准，调整温控算法所涉及到的系数。当试管件达到预设温度，控制分析模块控制制冷片制冷量，使试管件保持恒温。

现有技术的温控效果：

升温速率:

a)平均升温速率：从50℃~90℃，≥1.5℃/s；

b)最大升温速率：从50℃~90℃，≥2.5℃/s。

降温速率：

a）平均降温速率：从50℃~90℃，≥1.5℃/s；

b）最大降温速率：从50℃~90℃，≥2.0℃/s。

控温精度：≤0.5℃；

温度准确度：测定值与设置温度差值绝对值应≤0.5℃。

模块温度均匀性：

温度差值应在±1℃范围内。

通过本发明的温控算法后，使温控大大领先于现有技术，具体参数如下：

升温速率:

a)平均升温速率：从50℃~90℃，≥2.5℃/s；

b)最大升温速率：从50℃~90℃，≥4℃/s。

降温速率：

a）平均降温速率：从50℃~90℃，≥2.1℃/s；

b）最大降温速率：从50℃~90℃，≥5℃/s。

控温精度：

≤0.3℃；

温度准确度：

测定值与设置温度差值绝对值应≤0.4℃。

模块温度均匀性：温度差值应在±0.2℃范围内。

第三步，进行检测：激发光源模块进行发光，光线透过激发滤光片并通过激发光纤照射到待测物上，待测物产生荧光，所述荧光通过接收光纤并透过接收滤光片射出，摄像机器捕获光后，传输给控制分析模块的处理器进行数据分析。

第四步，采集数据，随着pcr反应的进行，pcr反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

第五步，修正荧光扩增曲线，通过修正算法公式将需要绘图的点光滑且不失真的表达。

所述的修正算法公式：

y1=x1。

y2=(x1+x2+x3)/3;

y3=(x1+x2+x3+x4+x5)/5;

y(n-2)=(x(n-2)+x(n-1)+xn+x(n+1)+x(n+2))/5;

y(n-1)=(x(n-2)+x(n-1)+xn)/3;

yn=yn;

xn为第n次循环实际采集的荧光强度信号，n=1,2,3,4…

yn为第n次循环修正后的荧光强度信号，n=1,2,3,4…

通过上述算法公式，将需要绘图的点光滑且不失真的表达，减少数据采集过程中受到干扰。修正效果如图1-1、1-2、2-1、2-2、3-1、3-2所示。

第六步，设定荧光阈值为threshold，荧光域值（threshold）是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是pcr反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。

求取荧光阈值与修正荧光扩增曲线的交点，如图4所示。

根据修正荧光扩增曲线以及荧光阈值做图，获得与两者交点的横坐标值gn相邻的两个整数横坐标：即gn在g1~g2之间，由于g1、g2表示具体某次循环数，通过采集的数据，获得g1对应的荧光亮度信号值p1，获得g2对应的荧光亮度信号值p2，进而带入ct计算公式进行计算，求出ct值。所述ct计算公式如下：

ct=g1+height/delta_p。

其中：height=threshold-p1，delta_p=p2-p1。

第七步，根据ct值，完成样品的检测。根据ct值，求出样品的起始拷贝数。建立ct值与起始模板的对应关系公式，每个模板的ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下。ct=-1/lg(1+ex)*lgx0+lgn/lg(1+ex)。其中n为扩增反应的循环次数，x0为初始模板量，ex为扩增效率，n为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。起始拷贝数越多，ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代ct值。因此，只要获得未知样品的ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。