一种猕猴桃溃疡病抗性鉴定和评价方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体是一种通过离体枝条接菌的方法对猕猴桃的溃疡病抗性进行鉴定和对其抗性等级进行评价的方法。

背景技术：

猕猴桃细菌性溃疡病是威胁猕猴桃生产的毁灭性病害，是由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(pseudomonassyringaepv.actinidae)侵染引起的细菌病害。猕猴桃细菌性溃疡病自1980年在美国加利福尼亚州和日本神州静冈被发现，现已成为一种世界性的病害。细菌性溃疡病的发生具有适生范围广、发生迅猛、致病性强、根除难度大等特点，已被列为我国森林植物检疫性病害，是目前猕猴桃生产中面临的重大问题。近年来，随着猕猴桃栽培面积的不断增加，溃疡病快速蔓延，严重威胁世界猕猴桃的安全生产。猕猴桃溃疡病发生后，不仅降低猕猴桃的产量，而且影响其果实品质。

猕猴桃溃疡病是一种顽固性病害，因其能侵染到植物组织内部，一般农药很难起到作用，目前国际上还没有特别有效的防治方法，因此培育和筛选抗性猕猴桃品种成了抵御溃疡病病害的最佳途径。但目前已知的猕猴桃溃疡病抗性种质十分有限，主要原因之一在于长期以来缺乏有效的猕猴桃溃疡病抗性鉴定和评价方法，以往的方法大多是根据其田间感病状态确定的，但由于猕猴桃抗病性田间观察受病原菌的传播情况及年度间气候、地理环境等的影响较大，抗病品种的田间鉴定往往需要漫长的观察周期，而盆栽幼苗人工接菌有很容易造成病原菌的扩散，且猕猴桃溃疡病在苗期发病规律与成株不完全一致，容易造成较大误差。部分科研人员借鉴其它果树的离体接菌抗性鉴定方法发展了猕猴桃离体叶片和枝条的体外接种鉴定技术，在某些猕猴桃品种的鉴定上有一定的效果，但其只能进行一定程度上的抗性鉴别，无法对猕猴桃溃疡病抗性做出较准确和辨识度更高的抗性等级划分，误差较大。猕猴桃溃疡病离体鉴定受到温度、湿度等的外界因素影响较大，而且由于溃疡病菌本身特殊的寄生特性，在其它植物上应用的离体鉴定方法不一定适合猕猴桃，导致鉴定结果差强人意，与大田自然状况下实际表现的抗性也不尽相同。猕猴桃溃疡病鉴定和评价体系的不成熟导致目前关于猕猴桃品种的抗性鉴定和评价的报道相对较少，大部分品种的溃疡病抗性等级不明，给生产上猕猴桃品种选择和合理规划造成困扰，限制了优良抗性品种的发掘和利用。同样，野生猕猴桃资源中也存在着对溃疡病高抗的优异种质，但大部分猕猴桃种的溃疡病抗性也不明确，限制了优异抗性野生猕猴桃资源的开发利用。针对此现象，本发明提供了一种可以较准确的进行猕猴桃种质溃疡病抗性鉴定和等级评价的离体枝条接菌鉴定方法，经实践证明该方法切实有效，可重复性高，鉴定结果与大田自然状态下猕猴桃的溃疡病发病情况有较高的一致性。

技术实现要素：

本发明针对目前猕猴桃溃疡病抗性鉴定和评价方法的缺点和不足，通过对影响病原菌致病力的内外因子的控制，创新培养和鉴定方式，提供了一种新的对猕猴桃溃疡病抗性及其抗性等级进行鉴定和评价的离体枝条接菌鉴定方法。该方法简单、直观，结果可靠。

本发明一种猕猴桃溃疡病抗性鉴定和评价方法，包括如下步骤：

（1）样品采集：于1月份采集落叶后处于休眠期的猕猴桃一年生枝条，取枝条中间部分约30cm长，每个品种或种类取5个枝条；每次鉴定均以高感品种“红阳”猕猴桃为对照；

（2）病原菌培养：从保存的固体培养基平板上挑取单克隆，加入50ml液体lb培养基，25℃，220rpm，震荡培养48h，使用无菌水将病原菌悬浮液稀释到1×10⁹cfu/ml；

（3）样品接菌：样品取回实验室后，使用自来水将枝条冲洗干净，晾干，然后使用75%酒精对枝条表面进行快速消毒，时间20s。无菌水冲洗干净后，晾干，使用消毒后的5mm打孔器在枝条中部位置打孔，打孔深度深入木质部，用枪头吸取10μl菌液注入孔内，放置15min使菌液完全渗入枝条伤口内；

（4）枝条培养：取一消毒后的40cm长芽苗盘，在上层沥水盘内铺两张无菌滤纸，在底层托盘内加入无菌水，加水高度至与上层沥水盘底部齐平（不要没过滤纸），使滤纸可以吸取水分保持湿度；将接菌后的枝条伤口朝上，摆放于滤纸上，每个枝条的摆放方向一致，当芽苗盘摆满一层后，上面覆盖另外两张无菌滤纸，并喷无菌水使其浸透为止；最后将要培养的芽苗盘至于无菌气候室内，控制温度10℃以下，每3天检查一次，如果发现滤纸部分变干则及时喷淋无菌水保湿；

（5）抗性鉴定：枝条接菌培养20天后，每隔5天取3个红阳枝条（对照），用无菌美工刀削去枝条皮层，观察病原菌侵染程度，如果发现“红阳”褐变程度即将扩展到整个枝条（30cm），则对其它种类进行削皮鉴定其枝条褐变程度；

（6）等级评价：根据枝条褐变程度（枝条褐变长度），将猕猴桃对溃疡病的抗性划分为“高抗”、“抗”、“中抗/中感”、“感”、“高感”五个等级，具体如下表所示；

本发明一种猕猴桃溃疡病抗性鉴定和评价方法的特点在于：

（1）确定了最佳取样时间为冬季落叶后的休眠期（1月份）；

（2）枝条接菌后培养使用芽苗盘，上层滤纸可以充分吸收下层托盘的水分，并通过及时对枝条直接喷水的方式保持较高的湿度（100%湿度）；

（3）使用了较低的接菌处理温度（10℃以下），此温度有利于细菌的增殖和发病，而猕猴桃枝条仍处于休眠状态；

（4）抗性鉴定使用枝条剥皮的方式，通过观察枝条褐变程度（褐变长度）来确定其抗性等级，简单直观；

（5）确定了更科学的可操作性强的抗性等级划分方法，适用于猕猴桃属各个种的溃疡病抗性鉴定和评价。

本发明通过确定合理的猕猴桃离体枝条取样时间，创新离体枝条接菌培养方式，保证接菌处理后的离体枝条培养在较低的温度和较高的湿度下进行，抗性鉴定使用枝条剥皮的方式，通过枝条褐变程度来对猕猴桃的溃疡病抗性进行鉴定和评价，鉴定方法简单直观，鉴定结果与猕猴桃自然状态下的溃疡病抗性表现基本一致。该方法将大大促进对现有猕猴桃品种和其它野生种质资源的溃疡病抗性的认识，使生产者可以根据需要选择抗性强的品种种植，也有利于优异野生抗性资源的进一步开发利用和促进整个猕猴桃产业的健康可持续发展。

附图说明

图1为猕猴桃对溃疡病的抗性—“高抗”等级枝条褐变程度示意图；

图2为猕猴桃对溃疡病的抗性—“抗”等级枝条褐变程度示意图；

图3为猕猴桃对溃疡病的抗性—“中抗/中感”等级枝条褐变程度示意图；

图4为猕猴桃对溃疡病的抗性—“感”等级枝条褐变程度示意图；

图5为猕猴桃对溃疡病的抗性—“高感”等级枝条褐变程度示意图；

图6为接菌后感病猕猴桃品种的离体枝条褐变过程曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。

实施例1

采用本发明通过离体枝条接菌及枝条剥皮方法对溃疡病抗性进行鉴定和评价，包括以下步骤：

1、实验材料：红阳、华特、金魁、桂翡、哑特、徐香、海沃德、实美和秋香；溃疡病菌为分离于广西的一个强致病3型psa菌株。

2、采用本发明通过离体枝条接菌及枝条剥皮方法对溃疡病抗性进行鉴定和评价，包括以下步骤：

（1）样品采集：于1月份采集落叶后的上述猕猴桃1年生枝条，取枝条中间部分约30cm长，每个品种取5个枝条；以高感品种“红阳”猕猴桃为对照（20个枝条）；

（2）病原菌培养：从保存的固体培养基平板上挑取单克隆，加入50ml液体lb培养基，25℃，220rpm，震荡培养48h，4000rpm离心获得细菌沉淀后，使用无菌水将病原菌悬浮液稀释到1×10⁹cfu/ml；

（3）样品接菌：样品取回实验室后，使用自来水将枝条冲洗干净，晾干，然后使用75%酒精对枝条表面进行快速消毒，时间20s，再用无菌水漂洗干净后，晾干，使用消毒后的5mm打孔器在枝条中部位置打孔，打孔深度深入木质部，用枪头吸取10μl菌液注入孔内，放置15min使菌液完全渗入枝条伤口内；

（4）枝条培养：取一消毒后的40cm长芽苗盘，在上层沥水盘内铺两张无菌滤纸，在底层托盘内加入无菌水，加水高度至与上层沥水盘底部齐平，不要没过滤纸，使滤纸可以吸取水分保持湿度；将接菌后的枝条伤口朝上，摆放于滤纸上，每个枝条的摆放方向一致，当芽苗盘摆满一层后，上面覆盖另外两张无菌滤纸，并喷无菌水使其浸透为止；最后将要培养的芽苗盘至于无菌气候室内，控制温度10℃以下，每3天检查一次，如果发现滤纸部分变干则及时喷淋无菌水保湿；

（5）抗性鉴定：枝条接菌培养20天后，每隔5天取3个红阳枝条（对照），用无菌美工刀削去枝条皮层，观察病原菌侵染程度；35天后发现“红阳”褐变程度即将扩展到整个枝条（30cm），此时对其它所有种类进行削皮鉴定，根据枝条褐变程度（枝条褐变长度），将猕猴桃对溃疡病的抗性划分为“高抗”、“抗”、“中抗/中感”、“感”、“高感”五个等级。

实施例2

使用普通托盘培养，90%湿度，光照20℃；黑暗15℃；交替12h。每隔7d全部观察记录1次病害发生情况，计算病情指数，35天后对各品种进行抗病性鉴定和评价。按以下标准进行抗性评价。其余同实施例1。

实施例3

于6月份采取不同猕猴桃材料健康一年生枝条，取枝条中部30cm，枝条接种前先用70%酒精表面消毒，使用8mm打孔器对枝条中部位置打孔，每份材料取15根枝条，用一次性注射器注射猕猴桃溃疡菌悬浮液100μl，3次重复。接种菌液浓度为3×10⁸cfu/ml，接种后置于20℃恒温保湿下，24h后逐日调查感病率，至20d，统计感病枝条数，并计算感病率。接种鉴定参照任欣正(1994)的方法(植物病原细菌的分类和鉴定。北京：中国农业出版社)。其余同实施例1。

参照图1-5，表3显示使用3种鉴定方法的鉴定效果和区别，可以看出，实施例2和实施例3对猕猴桃高抗和高感种质材料的鉴定较为准确，与本方法鉴定结果较为一致，符合大田抗性表现，但在抗、中感/中抗和感病种质的鉴别上和大田实际抗性表现存在较大误差。而本方法与田间鉴定结果有较高的一致性，说明本方法在猕猴桃溃疡病抗性鉴定和评价上更准确。在金魁的鉴定上，使用实施例2和实施例3的方法确定其等级为抗，在品种推广初期很多研究者也认为其对溃疡病高抗或免疫，但近几年随着种植面积和种植区域的扩大，特别是在北方较冷地区种植的金魁猕猴桃也发生了一定程度上的溃疡病（20-40%发病率），给种植者造成了很大困扰。分析其原因可能是其抗性表现主要体现在其生理耐受性上，金魁猕猴桃为六倍体，具有较强的生长势，增强了其生理抗性，在适宜的生长条件下一定程度上抑制了溃疡病的发生，但在一些较极端的环境下如冻害后其生理耐受性降低，则容易发病。本方法鉴定其抗性为中，与田间鉴定结果相符，说明本方法鉴定结果与猕猴桃在较极端环境下的抗性表现有较高的一致性。另外，本方法中哑特和秋香的鉴定结果与田间鉴定结果存在一定差异可能也是因为它们的田间鉴定未经过较极端环境的考验。总体来说，本方法鉴定结果直观、准确，更能体现猕猴桃自身的系统性抗性，在生产和科研上具有更强的指导作用，鉴定结果更科学有效。

表3两种溃疡病鉴定方法对9份猕猴桃种质的抗性鉴定结果及其区别

众所周知，猕猴桃溃疡病病原菌对环境因子的改变非常敏感，有时即使较低范围的波动也会造成其侵染能力的改变。我们在试验过程中发现，枝条接菌后100%的湿度效果明显好于常用的90%和95%的湿度；低温也是影响其侵染能力的一个重要参数，10℃以下的培养温度明显好于15℃，而当温度上升至20℃后，其侵染能力显著降低；离体枝条的采集时间也至关重要，通过比较发现处于休眠期的枝条最适于接菌鉴定，而使用生长期的枝条则容易造成较大误差；另外，枝条接菌后的培养时间要适当延长，因为溃疡病菌在枝条组织内有一个较长的潜伏和增殖期，只有当其增殖量达到一定程度后才打破宿主的防御，使其产生感病症状，对于感病材料，整个离体枝条褐变过程基本呈一种指数曲线形式，如图6所示。