本发明涉及一种细菌lysobactersoli6262发酵液及其应用，属微生物生物农药技术领域。
背景技术：
植物线虫引起的病害已成为农业生产中的第二大类病害,每年给全世界造成的经济损失达1570亿美元(abadetal.,2008)。其防治以化学农药为主，随着长期使用各种化学农药所带来的环境污染问题的日趋严重，部分化学杀线虫剂被禁用，因此利用线虫天敌对线虫进行生物防治越来越受到重视。微生物是线虫天敌中的主要类群，其活性次生代谢产物是发现生物农药和新药的基础。其中细菌由于种类繁多，成为寻找杀线虫活性次生代谢产物的重要来源之一。
本发明使用的细菌菌株为lysobactersoli6262，该菌的发酵液具有毒杀线虫活性。经国内外文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种细菌lysobactersoli6262发酵液及其应用。
本发明是这样实现的：
1.本发明使用的细菌菌株lysobactersoli6262已于2017年1月09日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号：cgmccno.13555。
2.细菌lysobactersoli6262发酵液的制备
培养基：nb培养基为常规培养基。培养基的组成和配制方法如下:
nb培养基：称取蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g和nacl5.0g，用去离子水溶解并定容至1l，调节ph到7.2，121℃灭菌20分钟。
在装有100mlnb液体培养基的三角瓶中接种100μllysobactersoli6262，25℃-38℃恒温摇床内培养3天-6天。发酵液用高速离心机在10000rpm下离心5min分离菌液和菌体，吸取上清液放在-4℃的冰箱中备用，得到本发明使用的活性发酵液。
3.秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)和南方根结线虫(meloidogyneincognita)的培养
燕麦培养基用于秀丽隐杆线虫(c.elegans)培养；燕麦片10.0g，水10ml浸润燕麦片，120℃高温灭菌20min。接种线虫放置于28℃的培养箱中培养7天或10天后，置于4℃冰箱中保存备用。使用时用无菌水制成线虫悬液备用(每毫升1000条左右)。
番茄根系用于南方根结线虫(m.incognita)的制备。取发病番茄根系，放入水中浸泡3次，每次至少10小时。浸泡液经2000rpm离心2min，弃去上清液，加入494g/l蔗糖，混匀后2000rpm离心2min，将上清液用800目的分离筛清洗，收集分离筛上的幼虫和虫卵。洗液再用100、200和500目的分离筛反复漂洗，收集500目分离筛上的收集物-大部分为虫卵；500目分离筛上的滤过液再经800目的分离筛清洗，收集分离筛上的虫体-2龄幼虫。所分离的虫和虫卵储于4℃的冰箱中备。
4.实验方法
液体浸泡法：取4.5ml测试样品溶液、500μl约含有500条线虫的悬液于直径为6cm的培养皿中，轻轻混匀后将培养皿室温放置。在解剖镜下随机选择10个视野定时(1小时、2小时、8小时、24小时、48小时)进行观察，计数病虫数(以线虫不动作为标准)和总线虫数。每个测试样品设三个重复，并以未接种菌株的nb培养基为对照，得到测试样品对线虫的致死率，以致死率高低评定样品对线虫的毒力。
本发明的细菌lysobactersoli6262发酵液在制备毒杀南方根结线虫(m.incognita)和秀丽隐杆线虫(c.elegans)生物制剂中应用。
本发明的有益效果在于：高效低毒、不污染环境，发酵原液在8小时对秀丽隐杆线虫(c.elegans)的致死率达到100％、在48小时对南方根结线虫(m.incognita)的致死率达到90％以上。能够用于制备毒杀南方根结线虫(m.incognita)和秀丽隐杆线虫(c.elegans)的生物制剂。
具体实施方式：
下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。实施例中的细菌lysobactersoli6262发酵液的制备步骤及毒杀南方根结线虫(m.incognita)和秀丽隐杆线虫(c.elegans)的实验方法同发明内容部分的描述。
实施例一：
将活化后的细菌lysobactersoli6262100μl接种于液体nb培养基中(250ml三角瓶装100ml培养基)，于25℃，180rpm条件下培养3天。将培养液10000rpm离心5分钟后，取上清作为测试样品。结果见表1。
表1细菌lysobactersoli6262发酵液对c.elegans线虫的毒杀结果(％)
结果表明：细菌lysobactersoli6262发酵液对秀丽隐杆线虫(c.elegans)有极强的毒杀作用，发酵原液在8小时对秀丽隐杆线虫(c.elegans)的致死率达到100％。
实施例二：
本实施例与实施例一使用相同的试验用药剂、实验方法基本一致，仅将供试线虫替换为南方根结线虫。
将活化后的细菌lysobactersoli6262100μl接种于液体nb培养基中(250ml三角瓶装100ml培养基)，于30℃，180rpm条件下培养5天。将培养液10000rpm离心5分钟后，取上清作为测试样品。结果见表2。
表2细菌lysobactersoli6262发酵液对南方根结线虫(m.incognita)的毒杀结果(％)
结果表明：细菌lysobactersoli6262于30℃，180rpm条件下培养5天的发酵液对南方根结线虫(m.incognita)有强的毒杀作用，发酵原液在48小时对南方根结线虫(m.incognita)的致死率达到90％以上。
实施例三：
本实施例与实施例一使用相同的试验用药剂、实验方法基本一致，仅将供试线虫替换为南方根结线虫。
将活化后的细菌lysobactersoli6262100μl接种于液体nb培养基中(250ml三角瓶装100ml培养基)，于38℃，180rpm条件下培养6天。将培养液10000rpm离心5分钟后，取上清作为测试样品。结果见表3。
表3细菌lysobactersoli6262发酵液对南方根结线虫(m.incognita)的毒杀结果(％)
结果表明：细菌lysobactersoli6262于38℃，180rpm条件下培养6天的发酵液对南方根结线虫(m.incognita)有强的毒杀作用，发酵原液在48小时对南方根结线虫(m.incognita)的致死率达到90％以上。