一株黑臭水氨氮降解菌AW0H4及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，涉及一株黑臭水氨氮降解菌aw0h4及其应用。

背景技术：

近些年来，城市河道与开放水域水体黑臭问题已严重影响人们正常的经济社会生活。其引发的一系列生态环境问题，不仅会对人体健康、居住环境构成威胁，也严重损坏城市形象。2015年，国务院发布的《水污染防治行动计划》（简称“水十条”）对黑臭水体问题提出明确要求，到2020年，我国地级及以上城市建成区黑臭水体均控制在10%以内；到2030年，城市建成区黑臭水体总体得到消除。由此可见，解决和治理城市水体黑臭问题迫在眉睫。

截止目前，黑臭水体的形成机制与污染特点已初步明确，但治理技术仍在不断发展更新中。黑臭水体除氮方法，近些年来国内外主要采用物理、化学和生物方法。在应用物理和化学方法解决黑臭水体脱氮的实践中通常治标不治本，并且费用较高，同时引发了其它生态环境问题，无法实现长期治理目标。

微生物脱氮方法可以从根本上去除黑臭水体中氨氮，是国外近年来研发投入最大、发展最快的技术。微生物处理方法核心在于研发高效菌，通过微生物的代谢活动，对水体中的各种形态的氨氮进行转移、转化和降解，从而改善河流水质。由于国外在黑臭水体治理方面的研究时间较早，我国在相关研究领域相对滞后，所以需要加强黑臭水体中高效氨氮降解菌的筛选及研究工作。

技术实现要素：

发明的目的是提供一株黑臭水氨氮降解菌aw0h4及其应用。

为了实现本发明目的，一株黑臭水氨氮降解菌aw0h4是由发明人从黑臭水中分离出来，经鉴定该菌株属于假单胞杆菌属，命名为pseudomonassp.aw0h4，于2017年1月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmccno.13544。

菌株pseudomonassp.aw0h4的形态特征包括其为杆状，无芽孢，菌体大小为（0.5-0.6）μm×(1.5-1.7)μm，菌落成圆形，边缘整齐光滑，在lb培养基上呈淡黄色。它是革兰氏阴性好氧菌，它的分子生物学鉴定结果为：利用测序基因序列通过ncbi数据库进行16srdna序列进行对比，与假单胞杆菌亲缘关系最近，达99%。

对本发明菌株pseudomonassp.aw0h4进行氨氮降解实验，将该菌株按体积分数2%接入某重度黑臭水中，放入摇床培养，每天测定黑臭水中nh3-n、cod、tp浓度值。实验结果显示，10d氨氮浓度已低于黑臭水体限值8mg/l，黑臭水水质和外观得到明显改善，同时菌株也对黑臭水中cod和总磷等指标均具有一定降解作用。

本发明有益效果是筛出的pseudomonassp.aw0h4菌具备有效去除重度黑臭水体中氨氮的能力，为黑臭水体生物修复工程提供一种环保、安全的长效办法。

附图说明

图1为细菌pseudomonassp.aw0h4对氨氮培养液溶液中氨氮降解效果图。

图2为细菌pseudomonassp.aw0h4对重度黑臭水中氨氮降解效果图。

具体实施方式

实施例1

一株黑臭水氨氮降解菌aw0h4的分离与鉴定：

本实施方式一株黑臭水氨氮降解菌aw0h4已于2017年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13544，该菌株属于假单胞杆菌属，命名为pseudomonassp.aw0h4。

本实施方式中一株黑臭水氨氮降解菌aw0h4，它使用常规分离、纯化、筛选方法获得，具体方法如下：

取天津某坑塘黑臭水2l，静置1h，取中上层黑臭水用于实验，按体积分数为5%加入向已灭菌的lb培养基中，于28℃培养24h，取5ml培养液接种于新的富集培养基中，如此反复5代。取富集5代后的培养液，按照10^-3-10^-8不同比例稀释，100μl不同梯度菌液涂布于氨氮分离培养基上，挑取单菌落，于28℃培养24h，观察菌的生长情况，选取生长快、菌落大、数量多的菌落采用三线法进行纯化，将纯化后的单菌落冷冻保藏备用。

菌株分离纯化过程中所用的培养基包括lb培养基：胰蛋白胨10.00g，酵母提取物5.00g，nacl10.00g。分离培养基：葡萄糖5.00g，（nh4）2so40.50g,nacl2.00g,feso4·7h2o0.40g，k2hpo41.00g，mgso4·7h2o0.50g，蒸馏水1l，ph7.2-7.4。

对所得菌株进行分子生物学鉴定，菌种鉴定技术路线包括基因组dna提取16s菌保守序列pcr扩增→3730测序。基因组dna提取主要采用液氮法破碎细胞，sds-ctab法提取菌种基因组。16s菌保守序列pcr扩增步骤中所采用的引物为27f：agagtttgatcmtggctcag，1492r:tacggytaccttgttacgactt；反应体系：h2o17.8ul，buffer3ul，dntp2ul，primer13ul，primer23ul，dna模板1ul，酶0.2ul，总体积30ul；反应条件：95℃预变性5min，35cycle的95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，72℃延伸10min，12℃forever保温。电泳pcr产物鉴定之后，上机测序。借助ncbi数据库将本菌株的16srdna基因序列进行blast比对，比对结果显示，本菌pseudomonassp.aw0h4与pseudomonassp.cj-s-r2a3亲缘关系最近，达99%。

实施例2

一株黑臭水氨氮降解菌aw0h4对氨氮培养液的降解：

配制氨氮培养液:葡萄糖5.00g，（nh4）2so40.40g，nacl2.00g，feso4·7h2o0.40g，k2hpo41.00g，mgso4·7h2o0.50g，蒸馏水1.0l，ph7.2-7.4。在无菌环境下，按照1%的体积分数接入pseudomonassp.aw0h4菌液，设置培养箱温度为28℃、120r/min。分别在0h、6h、12h、24h、48h、72h测定氨氮浓度。实验结果显示，初始氨氮浓度为84.85mg/l，48h氨氮降解率高达85%。重度黑臭水体中氨氮浓度在15mg/l以上，根据实验效果显示，该菌株具备快速处理重度黑臭水中氨氮的能力同时也会具有一定利用cod和磷的能力。

实施例3

一株黑臭水氨氮降解菌aw0h4对黑臭原水中氨氮的降解：

天津某坑塘黑臭水中，nh3-n、cod、tp分别为52.10mg/l、91.83mg/l、11.75mg/l，属于重度黑臭水体。取此黑臭水1l，静置1h，取中上层黑臭水100ml于500ml摇瓶中，向摇瓶中接入2ml菌液，设置培养箱温度为28℃、120r/min。分别在0h、0.5d、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d测定氨氮浓度值。实验结果显示，10d氨氮降解率为90.67%，氨氮浓度已低于黑臭水体限值8mg/l此外其对黑臭水中cod、tp等指标的降解也具有一定作用。

核苷酸序列表

<110>奥为（天津）环保科技有限公司

博元生态修复（北京）有限公司

南开大学

<120>一株黑臭水氨氮降解菌aw0h4及其应用

<130>2017

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1215

<212>dna

<213>假单胞杆菌（pseudomonassp.）

<400>1

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