鸡传染性支气管炎致弱疫苗株LDL‑T株及其应用的制作方法

本发明涉及鸡传染性支气管炎致弱疫苗株ldl-t株及其应用，属于鸡传染性支气管炎的防治领域。

背景技术：

鸡传染性支气管炎(avianinfectiousbronchitis，ib)是由鸡传染性支气管炎病毒(infectiousbronchitisvirus，ibv)引起的一种急性、高度接触传染性、病毒性呼吸道疾病，其引起的病理特征因病毒类型不同而有巨大差异，“呼吸病变型”主要表现为病鸡咳嗽、打喷嚏、气管啰音；“肾脏病变型”发病初期表现为“呼吸型”临床症状之外，发病后期表现为肾脏肿大、苍白，输尿管扩张、有大量尿酸盐沉积，外观呈现典型的“花斑肾”；“生殖系统病变型”除了初期表现“呼吸病变型”临床症状外，雏鸡感染后成年母鸡表现为输卵管等生殖系统产生病变，而成为“假母鸡”，给养禽业造成重大的经济损失。

鸡传染性支气管炎于1930年在美国北达科塔州首次发现。早期的研究表明，鸡传染性支气管炎病毒主要侵害雏鸡的呼吸道(呼吸型ib)，也危害育成鸡和产蛋鸡群，使之抵抗力降低、产蛋量及蛋的品质下降。1962年winterfield和hitchner在美国报道了致肾脏病变型ib的出现。1956年jungherr报到了1951年分离的康涅狄格株(connecticut，以下简称conn)和1941年分离的马萨诸塞株(massachusetts，以下简称mass)可引起类似的疾病，但不能交叉保护或交叉中和，从而证明ibv不只一个血清型。

中国在1953年就有呼吸型ib发生的报道，1972年邝荣禄在广东首次确诊ib在中国的存在。目前，ibv在中国大部分地区流行，而且在中国免疫鸡群和非免疫鸡群中有新基因型的肾致病型ibv在流行，根据近年来我国流行病学研究，表明我国主要lx4型、mass型、4/91型、ck/ch/ldl/97i型、twi型、lz05型等多种基因型的病毒株，因传染性支气管炎病毒血清型众多，且不同血清型之间无交叉反应性或交叉反应性小，因此，该病的防控异常困难。随着近年来不同国家和地区发现不同的变异株，出现越来越多的血清型，据不完全统计，目前已超过20种不同的血清型，因而鉴定病毒血清型没有完全的条件。但是研究显示，病毒结构蛋白尤其是病毒表面的纤突蛋白s1基因与病毒的抗原性密切相关，鉴于此目前国际上均采用病毒的基因型来反应病毒的血清类型。

免疫接种是防治该病的最有效手段。ib疫苗免疫模式往往是以活疫苗免疫幼龄鸡、种鸡或产蛋鸡，后期则用灭活苗进行加强免疫。从目前来看，世界上多数地区应用的疫苗为mass型疫苗，部分地区也允许使用其他一种或多种疫苗。由于大量研究表明特定血清型或基因型的疫苗能对同源的流行野毒株提供很好的保护，但往往也对其他不同的免疫保护型、不同血清型或者不同基因型毒株提供部分保护。按照疫苗应用原则，一个国家或地区只能应用已存在病毒类型的相应疫苗。然而各地区尤其是养禽业密集区域如中国流行ibv毒株复杂多样，研制和应用针对每一种变异株的疫苗显得并不实际，而且根据生物安全基本理论和ibv病毒特点，研制新的疫苗只能针对占据主导流行趋势的毒株，正如美国针对流行的ark型毒株研制的ark型疫苗，欧洲针对本地区广泛流行的4/91开发的4/91型疫苗。近年来，twi型毒株在我国成为主导流行毒株，并且造成明显的输卵管生殖道损伤，给蛋鸡养殖业造成重大的经济损失，针对我国该型毒株目前市场上的疫苗不能够有效预防该毒株的感染和流行，因而研究开发新的具有较好保护力的ib弱毒疫苗显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明主要所要解决的技术问题是克服现有疫苗株不能够有效防制twi型鸡传染性支气管炎病毒流行毒株的攻击，目前现有的ib疫苗防制效果不理想等缺陷，提供一株新的鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株，该弱毒疫苗株能够有效抵抗twi型传染性支气管炎病毒的攻击，可提供良好的免疫保护效力。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

本发明将twi型传染性支气管炎病毒野生强毒株ck/ch/ldl/140520毒株进行连续梯度低温冷适应传代致弱培养，最终筛选获得一株具有良好免疫保护效力的鸡传染性支气管炎冷适应弱毒或疫苗株(ldl-t株)，分类命名：传染性支气管炎病毒(infectiousbronchitisvirus)，其于2016年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是：cgmccno.12549，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明鸡传染性支气管炎冷适应弱毒疫苗株(ldl-t株)的形态学观察：ldl-t株病毒尿囊液经离心、磷钨酸负染后在电镱下可见到直径经为80-120nm的冠状毒，病毒粒子呈多形性，多数为圆形，有囊膜，表面有呈松散、均匀排列的冠状突起。

由于弱毒疫苗株ldl-t株是由twi型野生型毒株ck/ch/ldl/140520强毒株在鸡胚持续逐级降温培育驯化而获得的子代毒株，参照本发明说明书中实施例1中的方法，本领域普通技术人员将有可能应用从ldl-t株培育和分离子代亚克隆毒株，另外，公开的毒株进一步传代或利用不同条件培养获得毒株均完全在病毒学领域技术人员的普通技能之内，因此，以上ldl-t株及其子代毒均在本发明范围之内。

本发明提供的连续梯度冷适应弱毒疫苗株ldl-t全基因序列如seqidno:1所示。以类似本发明公开的方式，从冷适应弱毒疫苗株ldl-t及亲本毒分离或培育的类似克隆毒株也应在本发明的保护范围之内。本发明冷适应弱毒疫苗株与亲本野毒株进化关系紧密，本领域技术人员可通过培育或分离的子代亚克隆毒株基因与亲本毒ck/ch/ldl/140520株基因的对比，可发现本发明涉及弱毒疫苗毒株的基因在多处发生了突变(详见表18)。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种预防或治疗鸡传染性支气管炎的疫苗，由本发明冷适应弱毒疫苗株ldl-t株和冻干保护剂组成。

本发明所述的预防或治疗鸡传染性支气管炎疫苗可参考以下方法制备得到：(1)将本发明弱毒疫苗株培养增殖得到生产用毒种；将生产用毒种接种于鸡胚尿囊腔内，培养，收获病毒尿囊液；(2)经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒尿囊液与冻干保护剂混合配苗，即得。

其中，步骤(2)中将病毒液与冻干保护剂按照8：1的体积比进行配苗；所述的冻干保护剂优选主要由蔗糖和明胶(8％明胶、40％蔗糖保护剂)或者脱脂牛乳组成。

本发明鸡传染性支气管炎疫苗的使用方法：

(1)接种途径：滴鼻或点眼。

(2)接种剂量：1羽份。

本发明鸡传染性支气管炎疫苗免疫后20天产生免疫力，一次免疫持续期为不少于5个月。本发明弱毒株除了作为单苗使用外，还可用于制备联苗等。

免疫效力评价实验表明，本发明提供的ldl-t株(p75代毒)具有良好的免疫保护性，主动免疫保护率为80％以上，说明本发明毒株对tw-i型鸡传染性支气管炎具有良好的保护效力，可有效保护鸡抵抗传染性支气管炎病毒强毒的攻击。安全性试验结果表明，本发明鸡传染性支气管炎弱毒活疫苗(ldl-t株)对雏鸡和产蛋种鸡安全，无副反应，安全性好。

生物材料保藏

一株鸡传染性支气管炎冷适应弱毒或疫苗株ldl-t株，分类命名：传染性支气管炎病毒(infectiousbronchitisvirus)，于2016年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是cgmccno.12549，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1ck/ch/ldl/140520强毒和致弱毒致病性对比，

图a～c：原代毒攻毒后死亡鸡肾脏出现花斑肾、免疫组化可见显著病毒抗原，同时攻毒后形成母鸡输卵管液化；图d～f：ldl-t(ck/ch/ldl/140520p75代)攻毒后捕杀鸡肾脏未出现病变、免疫组化未见病毒抗原，同时攻毒后母鸡输卵管正常，并形成正常卵泡。

图2不同基因型的传染性支气管炎病毒株遗传关系图谱。

具体实施方式

实施例1鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株ldl-t株的培育及鉴定

1材料与方法

1.1病毒株ck/ch/ldl/140520的梯度冷适应传代致弱

为了保证传染性支气管炎病毒能够通过鸡胚连续传代过程中达到快速且稳定地致弱病毒，使用9-10日龄spf鸡胚对ibv强毒株ck/ch/ldl/140520株进行连续梯度降温冷适应传代培养，传代过程均通过鸡胚尿囊腔接种5枚鸡胚，每胚接种0.1ml的方式进行培养，致弱过程的培养条件为：首先从37℃开始传代20个代次，每代次孵育72h，72h后，将鸡胚取出置2-8℃，冷却18-24h后，观察鸡胚病变情况，无菌收集鸡胚尿囊液，进行下一次传代，传代至20代时降低孵育温度至35℃，在该温度下疫上述相同传代方式连续传代10个代次，此后再以31℃为孵育温度连续传代10个代次，最后再以29℃为孵育温度连续传代10个代次，期间每10代将种毒返回至37℃孵育，留作种子毒。传代至60代次后在37℃孵育条件下连续传代15代，即得本发明弱毒疫苗株ldl-t株(p75代毒)。

1.2病毒滴度测定

取ck/ch/ldl/140520传代过程中的p20、p40、p60和p75代次种子毒，分别依次作10倍系列稀释；选择4个稀释倍数(10⁴～10⁷或10⁵～10⁸)的病毒悬液分别接种5枚9～10日龄的spf鸡胚，每枚鸡胚接种100μl，将鸡胚置37℃温箱内孵育1周，每天照胚，记录1周内鸡胚的感染数和生存数，按reed-muench法计算eid50。

1.3无菌检验和支原体检验

分别将ck/ch/ldl/140520株传代过程中的p20、p40、p60和p75代次种子毒按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验和支原体检验。

1.4外源病毒检验

1.4.1血凝性检测

分别将ck/ch/ldl/140520株传代过程中的p20、p40、p60和p75代次种子毒进行血凝性病原的检测，其中包括禽腺病毒、新城疫病毒、h5和h9亚型禽流感病毒以及呼肠孤病毒等。

1.4.2用鸡胚进行外源病毒检测(病毒的特异性检验)

取病毒样品ck/ch/ldl/140520传代过程中的p20、p40、p60和p75代次种子毒，稀释成每剂量10^2.0eid50/0.1ml，与抗传染性支气管炎病毒特异性抗血清混合，进行中和，取9～10日龄spf鸡胚10枚，每枚鸡胚尿囊腔接种病毒样品悬液0.2ml，另取9～10日龄spf鸡胚10枚，每枚鸡胚尿绒毛尿囊膜接种病毒样品悬液0.2ml，同时设正常对照组，孵化7日，每日照胚，接种后24小时内的死亡鸡胚为非特异性死亡，弃去不计，每组存活至少8枚鸡胚，对所有接种24小时后存活的鸡胚进行检查，观察有无异常。对绒毛尿囊膜进行观察，检查有无异常。

1.4.3用细胞培养物进行外源病毒检测

取病毒样品10^2.0eid50/0.1ml，与抗传染性支气管炎病毒特异性抗血清混合，进行中和，取2个方瓶(100ml容量)的鸡胚成纤维细胞(cef)，接种中和后的病毒液0.2ml，在37℃下吸附1小时，观察5日，检查是否出现由接种物引起的cpe；用鸡红细胞进行血吸附试验，弃去培养液，并洗涤单层细胞，加入5％红细胞悬液，在4℃吸附60分钟，用缓冲液洗涤2次细胞后，在显微镜下观察，是否出现cpe和血吸附现象。

1.4.4cofal试验(禽白血病病毒检验)

取病毒样品，制备成每剂量5×10^5.5eid50/0.2ml，取2个方瓶(100ml容量)的鸡胚成纤维细胞(cef)，各接种病毒样品0.2ml，吸附30分钟，弃去培养液，加入细胞生长液，次日换成维持液。同时设立正常细胞和培养液作为对照。培养5～7日，按常规方法收获细胞，其中1/2作标记置-70℃检验用(p1)，其余细胞分在两个瓶中，培养7日后，按同样方法收获细胞，留样(p2)，如此继续传第3代，收获细胞(p3)，所有对照同样处理。将p1、p2、p3和所有对照冻融3次。同时设立阳性对照按照“中华人民共和国兽用生物制品质量标准”对每份样品进行cofal试验。

1.5ck/ch/ldl/140520株的致弱和免疫原性评价

80只4-5日龄的spf鸡随机分为8组(每组10只)，分别将8组鸡饲养于8个负压隔离器中，雏鸡自由采食及饮水。在4-5日龄时，1～4组雏鸡分别用鸡胚代次毒p20(10^4.6eid50)、p40(10^4.8eid50)、p60(10^4.5eid50)、和p75(10^4.5eid50)进行接种，每只滴鼻100μl；5～8组雏鸡分别作为p20、p40、p60和p75接种组的对照组，每只滴鼻100μl的pbs。自接种之日起，每日观察、记录接种鸡群的发病情况、死亡情况，对死亡鸡进行剖检，观察ibv靶器官、组织的病理变化。并于接种后20日，使用同源强毒ck/ch/ldl/140520进行攻击，每只滴鼻点眼100μl(病毒含量为10^6.0eid50)；攻毒后，每日观察、记录鸡群的发病情况、死亡情况，对死亡鸡进行剖检，观察ibv靶器官、组织的病理变化。

实验结果

2.1ck/ch/ldl/140520的传代致弱

随着对ck/ch/ldl/140520病毒传代次数的增加，其对鸡胚的适应性越来越强，鸡胚病变逐渐显著，接种病毒的鸡胚呈现明显发育障碍(侏儒胚)，蜷曲成球形，胚体出血，羊膜水肿增厚，紧贴胚体等典型的传染性支气管炎病毒感染的变化。每个代次的鸡胚尿囊液均不凝集鸡外周血红细胞，说明鸡胚尿囊液中不含能使鸡外周血红细胞凝集的禽的其它病毒，如正粘病毒、副粘病毒或腺病毒等。

2.2病毒滴度测定结果

ck/ch/ldl/140520毒株传代后高度适应鸡胚，p20代的滴度10^6.5eid50/0.1ml，传代后病毒滴度逐渐升高，p60和p75代为10^7.0eid50/0.1ml，并趋于稳定。

表1ck/ch/ldl/140520鸡胚冷适应梯度传代毒滴度测定结果

2.3无菌检验和支原体检验

鸡胚传代过程中的p20、p40、p60和p75经检验无细菌、霉菌和支原体污染。

2.4外源病毒检验

鸡胚传代过程中的p20、p40、p60和p75代次毒经检验无外源病毒的污染。

2.5ck/ch/ldl/140520不同代次毒的致弱评价

ck/ch/ldl/140520毒株在鸡胚上连续传代后对spf雏鸡的致病力在f60-p75之间减弱(见表2)。p20、p40代毒对spf雏鸡发病率均为60％以上，死亡率均在1/10至3/10。发病鸡表现为精神沉郁、缩脖、拱背、被毛粗乱、两翅下垂、张口呼吸等症状。病死鸡剖检可见两侧肾脏肿大，纹理清晰，外观呈现典型的“花斑肾”，有尿酸盐沉积。所有对照组鸡接种阴性尿囊液后状态良好，无发病或死亡。而p60发病率降低为1/10，没有死亡鸡。p75代毒对spf雏鸡发病率和死亡率则均为0％。剖检未见气管出血，肾脏肿大等特异性病理变化，与接种阴性尿囊液后的spf鸡一致。

选取p75(ldl-t株)作为疫苗研制的候选毒株。将p75(ldl-t株)毒株提交保藏，微生物保藏号是：其微生物保藏号是：cgmccno.12549；分类命名：传染性支气管炎病毒(infectiousbronchitisvirus)；保藏时间是2016年6月2日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

如图1所示：原代毒攻毒后死亡鸡肾脏出现花斑肾、免疫组化可见显著病毒抗原，同时攻毒后形成母鸡输卵管液化。ldl-t(ck/ch/ldl/140520p75代)攻毒后捕杀鸡肾脏未出现病变、免疫组化未见病毒抗原，同时攻毒后母鸡输卵管正常，并形成正常卵泡。

表2ck/ch/ldl/140520不同代次毒对spf雏鸡的致病力

实施例2梯度冷适应弱毒疫苗株ldl-t株的免疫效力及保护效果实验

1、实验方法

40只1日龄spf鸡随机分为2组(每组20只)，分别饲养于负压隔离器中，雏鸡自由采食及饮水。5日龄时，其中一组雏鸡使用ldl-t(p75，10³eid50)进行接种，每只滴鼻100μl；另一组雏鸡则作为对照组，每只滴鼻100μl正常尿囊液。自接种之日起，每日观察、记录接种鸡群的发病情况、死亡情况，并于免疫后20天同时将2组雏鸡用同源强毒ck/ch/ldl/140520p2(10⁶eid50/0.1ml)进行滴鼻点眼攻击，每只100μl；攻毒后5d，每只鸡分别采集咽拭子，分别分离病毒，评价免疫后对强毒排毒的免疫保护，同时每日观察、记录鸡群的发病和死亡情况。

2、实验结果

2.1ldl-t对雏鸡的临床保护效果

2个不同日龄的免疫组，在免疫后20天，采集鸡只血清样品，应用间接elisa试剂盒检测发现，接种过ldl-t的鸡只血清样品全部转为ibv抗体阳性，而对照组鸡血清样品均为阴性。使用同源强毒ck/ch/ldl/140520p2(10⁶eid50)对免疫组及对照组鸡攻击后观察5天，发现免疫组鸡状态良好，无发病症状；而对照组发病明显，表现为精神沉郁、拱背、被毛粗乱、两翅下垂、张口呼吸等症状，且在攻毒后约30％(3/10)鸡死亡。

表3ldl-t的免疫效力评价

2.2ldl-t对雏鸡气管排毒的保护效果

攻毒后5天每组随机采集10个咽拭子，经处理后接种9日龄spf鸡胚，孵育24-128小时，期间及时照胚，取出死亡鸡胚。128小时候取出除鸡胚观察鸡胚感染情况并结合rt-pcr方法判定免疫和非免疫鸡感染强毒后病毒分泌情况。结果免疫组10只中有1只咽拭子中检测出ibv，而对照组鸡咽拭子的检测结果均为阳性，表明本发明ldl-t免疫后能够对同源强毒产生良好的免疫保护反应。

表4对雏鸡气管和肾脏的保护效果

3结论

无论从临床观察还是对呼吸道的病毒分泌检测结果来看，本发明ldl-t免疫后能够对同源强毒产生良好的免疫保护反应。

实施例3twi型鸡传染性支气管炎弱毒疫苗的制备

取弱毒疫苗株(ldl-t株)，培养条件恢复至37℃，增殖生产用毒种，用灭菌pbs稀释10万倍，接种9日龄spf鸡胚尿囊腔，每胚接种0.1ml，接种后密封针孔，置37℃孵育。鸡胚接种24小时照胚，弃去死胚，将于37℃条件下孵育36-72小时的鸡胚气室向上，置于4℃冷却24小时。收获病毒尿囊液，将若干个鸡胚尿囊液混合为一组，置灭菌瓶中，在2-8℃保存，同时做无菌检验，同时测得病毒含量应≥10^6.0eid50/0.1ml。

经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒尿囊液混合后再与蔗糖明胶保护剂按8.5：1(病毒液：保护剂)配苗，冻干保护剂以40℃-50℃为宜(8％明胶、40％蔗糖保护剂，经115℃高压灭菌40分钟，放4℃保存，72小时内用完)。在添加过程中应不断摇动病毒液，充分混合均匀后，即为疫苗原液。将疫苗原液无菌定量分装，迅速冷冻真空干燥，加盖密封。

实验例4毒株制备疫苗(ldl-t株)的免疫效力验证

1实验材料

试验用疫苗：按照实施例3的方法分3个批次制备疫苗，批号分别为：201601、201602、201603。1000羽份/瓶。疫苗保存条件及有效期：-20℃保存，有效期为12个月。

用法与用量按瓶签标注羽份用生理盐水稀释，用滴管吸取疫苗，每只鸡滴鼻一滴(约0.03～0.05ml)。

2实验方法

将1～3组5日龄spf雏鸡分别接种3批次疫苗，每只滴鼻接种1个使用剂量(约0.03～0.05ml)。第4组5日龄spf鸡每只滴鼻一滴灭菌生理盐水。免疫后20日，4组鸡滴鼻方法攻击ck/ch/ldl/140520p2(10⁶eid50)株强毒，攻毒后5天每组随机采集10个咽拭子，同时持续观察各组鸡临床表现，记录发病和死亡情况。经处理后的咽拭子接种9日龄spf鸡胚，根据鸡胚感染情况并结合rt-pcr方法判定免疫和非免疫鸡感染强毒后病毒分泌情况。

3实验结果

各批疫苗免疫组免疫20日后，以强毒攻击，其中生理盐水对照组全部发病，均出现甩头、精神萎靡，羽毛松乱等传染性支气管炎临床症状，在观察期内有9/10发病，其中4/10死亡，解剖发现均有肾脏肿大，“花斑肾”特异病变。而疫苗免疫组均正常。通过检测攻强毒后5d采集的咽拭子，结果其中201602批次免疫组10只咽拭子中有1只阳性，其他两批次均未检测出ibv病毒，而对照组鸡咽拭子的检测结果均为阳性，表明ldl-t作为疫苗免疫鸡后能够对同源强毒产生良好的免疫保护反应。详细结果见表5。

表5鸡传染性支气管炎活疫苗主动免疫效力试验数据

4结论

结果表明，本发明毒株ldl-t株制备成活疫苗主动免疫保护率达到90％，说明本发明毒株对鸡传染性支气管炎具有良好的保护效力。

实验例5ldl-t株制备疫苗的安全性验证

1实验材料

试验用疫苗：按照实施例4所描述的3个批次疫苗201601、201602、201603批次，1000羽份/瓶。疫苗保存条件及有效期：-20℃保存，有效期为12个月。

用法与用量按瓶签标注羽份用生理盐水进行适当稀释，用滴管吸取疫苗，每只鸡滴鼻途径接种。

2实验方法

2.1单剂量接种试验

单剂量接种安全试验用5日龄雏鸡，每批疫苗使用10只，另设对照组鸡10只，试验组滴鼻接种疫苗1羽份，对照组滴鼻等量的生理盐水，观察20日；剖检，观察是否出现鸡传染性支气管炎特异病变如：部分发病鸡气管、鼻窦内有浆液性或卡他性分泌物，或肾脏出现肿胀，出现典型的“花斑肾”变化。

2.2单剂量重复接种试验

单剂量重复接种安全试验用5日龄雏鸡，每批疫苗使用10只，另设对照组鸡同单剂量接种试验对照鸡，试验组滴鼻接种疫苗1羽份，每只鸡于14天后重复滴鼻接种相同剂量的疫苗，观察20日；剖检，观察是否出现鸡传染性支气管炎特异病变。

2.3大剂量接种组试验

大剂量接种试验用5日龄spf雏鸡，每批疫苗使用10只，将疫苗稀释至10羽份/0.1ml的剂量，试验组滴鼻接种稀释好的疫苗0.1ml，同单剂量接种试验对照鸡，观察20日。剖检，观察是否出现鸡传染性支气管炎特异病变。

3实验结果

从spf雏鸡单剂量接种试验、单剂量重复接种试验、大剂量试验结果来看，本发明毒株制备的鸡传染性支气管炎活疫苗对5日龄的spf雏鸡安全可靠，生理活动正常，剖检无传染性支气管炎特异病变；证明了该疫苗对小日龄鸡也是安全可靠的，鸡的采食、饮水、日常活动不受影响。试验组和对照组试验数据无明显差异。试验数据详见表7、表8和表9。

表7鸡传染性支气管炎活疫苗雏鸡单剂量接种安全试验

表8鸡传染性支气管炎活疫苗雏鸡单剂量重复接种安全试验

表9鸡传染性支气管炎活疫苗雏鸡大剂量安全试验

4实验结论

4.1本发明毒株ldl-t株制备的鸡传染性支气管炎活疫苗对雏鸡是安全的。

实验例6ldl-t株制备的鸡传染性支气管炎活疫苗免疫持续期实验

1材料和方法

1.1疫苗按照实施例4所述的鸡传染性支气管炎活疫苗：批号为201601。

1.2试验用鸡5日龄spf雏鸡。

1.3攻击用强毒ck/ch/ldl/140520p2株强毒(10^6.0eid50/0.1ml)由哈尔滨兽医研究所分离、鉴定、保存和供应。

1.4实验动物分组5日龄spf雏鸡120只，随机分为12组，其中免疫组6组，对照组6组。

1.5免疫用疫苗免疫5日龄其中6组spf雏鸡60只，作为免疫组。免疫组免疫疫苗的剂量为一个羽份，对照组鸡滴鼻0.1ml生理盐水。

1.6不同时期免疫保护检测6组免疫鸡分别于免疫后第30、60、90、120、150和180天分别进行攻毒试验，在不同时间分别与一组对照鸡10只滴鼻方法攻击10^6.0eid50的ck/ch/ldl/140520p2株强毒，分别观察20日，记录发病情况，统计结果，同时于攻毒后5天每组采集咽拭子，经处理后的咽拭子接种9日龄spf鸡胚，根据鸡胚感染情况并结合rt-pcr方法判定免疫和非免疫鸡感染强毒后病毒分泌情况。评价疫苗免疫提供的免疫持续期。

2实验结果

2.1临床保护持续期如表13所示，201601批次疫苗以1羽份的剂量免疫雏鸡后疫苗免疫后30～180天临床发病率均维持在8/10以上，免疫后180天临床保护下降至8/10。

2.2攻毒后咽拭子病毒分泌保护率如表13所示，免疫后第30、60、90、120、150和180天通过攻毒发现，免疫组在免疫后30～180天攻毒保护率达到8/10以上，但是免疫后180天已经将保护值降低至8/10。

表13免疫持续期雏鸡攻毒保护结果(201601批次)

3实验结论鉴于本发明毒株制备的疫苗免疫后临床保护和呼吸道分泌病毒保护率均保持在8/10及以上，可见本发明毒株制备疫苗免疫持续期至少可达5个月。

实验例7本发明母本毒株twi型传染性支气管炎病毒的鉴定

2014年5月，在辽宁省大连市某养鸡场采集病料样本，通过接种spf鸡胚分离到一株疑似鸡传染性支气管炎病毒，通过对致spf鸡胚病变特征、病毒对鸡外周血红细胞凝集特性、病毒粒子形态学特征、对spf鸡致病性及死亡率、基因特征等方面的研究，结果发现分离的病毒为鸡传染性支气管炎病毒；可致鸡胚生长发育障碍(侏儒胚)、胚体严重卷曲；病毒尿囊液不凝集鸡的外周血红细胞；在电镜下呈典型的冠状病毒粒子的形态特征；将病毒通过滴鼻途径接种1、5、15日龄spf雏鸡，同时设未攻毒对照组，在攻毒后第3-14天，攻毒组出现萎靡、死亡临床症状，发病率100％，死亡率30-70％，死亡鸡呈现典型的“花斑肾”。攻毒后的康复母鸡持续养殖，在5月龄时剖杀发现母鸡中1/3-3/5出现典型的输卵管发育不全，输卵管水样化，成为“假母鸡”。以上结果表明鸡传染性支气管炎病毒ck/ch/ldl/140520是我国流行的一种既能造成肾脏严重损伤而致死的肾型传染性支气管炎病毒类型，而且能够导致存货母鸡产蛋性能的明显损伤，也成为一种重要的输卵管型传染性支气管炎病毒。

在此基础上，用rt-pcr方法对ck/ch/ldl/140520株全基因组进行了进行了克隆、测序和分析，该毒株基因全长约为27851bp，基因组组成为5′-utr-orf1-s-orf3-m-orf5-n-utr-3′，符合ibv基因组特征；并对筛选的代表不同类型毒株的免疫原基因s1基因进行亲缘关系对比(如表14-15)，同时绘制了系统发育进化树(如表16)，确证了该毒株为传染性支气管炎病毒，免疫原基因s1与其他毒株的核苷酸及氨基酸的同源性均在95％以下，而与台湾地区分离的twi型毒株同源性达到97.4％和98.5％。基于以上发现，筛选出代表不同基因型的传染性支气管炎病毒株进行遗传进化分析，结果表明我们分离的ck/ch/ldl/140520株传染性支气管炎病毒株为twi型毒株，是我国大陆流行的新的基因型毒株，而且近年来流行形势严峻，逐渐呈现出传染性支气管炎病毒主导流行毒株类型。

表14不同基因型的传染性支气管炎病毒株

“a”表示病毒分离的国家(省)

表15不同基因型的传染性支气管炎病毒株核酸和氨基酸亲缘关系

*病毒s基因的前端1632bp大小的核苷酸对比，始于aug翻译起始密码子

为了明确现有商品化疫苗对该类型毒株的防控效果以及该类型毒株在抗原性上与现有流行毒株的关系，将ck/ch/ldl/140520株与现有商品化疫苗毒株以及我国以往主要流行的毒株进行血清交叉中和试验，结果显示ck/ch/ldl/140520株(nrtwi)与ldt3有部分交叉反应之外，与其他类型的疫苗株和野毒株无交叉反应，说明该类型毒株与其他类型毒株在抗原性上差异明显(如表16)。

同时，利用我国现有商品化疫苗以及本实验室致弱的qx型弱毒株进行动物免疫试验，于免后20天攻击ck/ch/ldl/140520株强毒，同时在攻毒后采集咽拭子，在临床观察和病毒分泌检测两方面评价不同疫苗或弱毒株对twi型强毒株的免疫效力，结果表明现有的商品化疫苗以及致弱的qx型弱毒株均不能对twi型强毒株提供良好的交叉保护(如表17)。这便给免疫防控该类型毒株的感染提出了新的挑战，也提示针对该类型毒株研发新型疫苗毒株的必要性和紧迫性，本发明正是基于该研究基础，利用分离的ck/ch/ldl/140520株强毒通过实验室建立和优化的连续梯度冷适应致弱技术培育在75代即培育成针对twi型强毒株的弱毒疫苗株。

表16twi型毒株(ck/ch/ldl/140520)与其他类型毒株抗原交叉中和实验结果

“-”表示未测定；“a”表示血清中和滴度

表17不同类型疫苗对ck/ch/ldl/140520强毒攻击的免疫保护情况

表18ck/ch/ldl/140520强毒株(p1代)与通过梯度冷适应致弱后ldl-t株(p75代)的基因组核苷酸和氨基酸的对比

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>鸡传染性支气管炎致弱疫苗株ldl-t株及其应用

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>27851

<212>dna

<213>传染性支气管炎病毒（infectiousbronchitisvirus）

<400>1

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