一种氧化硫硫杆菌及其在去除重金属中的应用的制作方法

本发明属于生物处理领域，具体涉及一种能够去除重金属的微生物及应用领域。

背景技术：

在各类废物例如城市污泥中，常常含有大量的有机物和植物所需的营养元素，具有极高的农用价值。但是污泥中通常会含有大量的重金属，而重金属十分难以被生物降解，同时还很容易通过食物链被生物富集，食用由此类污泥浇灌的蔬菜，将会严重威胁到人们的身体健康。

由此，我们通常需要对重金属进行处理，使其能够更安全有效的被利用。在实际的处理过程中，使用物理化学方法，普遍存在着耗时长、成本高，易于产生二次污染的问题，因此，越来越多的人倾向于使用生物的方法来对重金属进行处理，生物浸沥的方法也日渐受到青睐。所以筛选出一种可以高效去除重金属的微生物具有极高潜在价值。

技术实现要素：

发明的目的：主要针对于废物中含有大量的重金属，无法被直接利用，并且目前的去除方法存在着效率低、成本高的问题，而提供的一种能够直接去除重金属的微生物及其应用方法。

技术方案：

一种用以去除重金属的微生物，其分类命名为Acidithiobacillus thiooxidans ZJ-1，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No:12387，保藏日期为2016年4月21日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明所述的菌株ZJ-1，其16s RNA的核苷酸序列如表1所示。

本发明所述的Acidithiobacillus thiooxidans ZJ-1的筛选方法：

1.称取10g酸洗污泥样品，放入装有100ml(121℃、30min湿法灭菌过的)纯液体培养基(SM培养基)的锥形瓶中，再向其中加入适量的硫粉(硫粉作为嗜酸性氧化硫硫杆菌的营养物质和酸性硫酸根的来源)；

2.待瓶中浊液pH值降至2.0左右时,静置后吸取上层清液10mL，接种到盛有100mL已湿法灭菌SM培养基的250mL锥形瓶中，并且加入10g硫粉，置于恒温摇床中培养(30℃、150rpm)；

3.培养8d-10d，待培养基变成浑浊的乳白色(pH值约为2)。从中吸取10mL接种到新鲜的SM培养基中；

4.按步骤2、3重复操作，富集培养几次之后，使得嗜酸性氧化硫硫杆菌成为其中的优势菌群；

5.对富集好的培养基进行稀释涂布于固体SM培养基；

6.每个浓度重复涂布三块平板，并且在培养皿上做好相应的记录。

7.将涂布好的培养皿在室温下放置2h后，放置在30℃培养箱中倒置培养，培养15d后，发现固体培养基上得到了较为纯净的菌群，平板上的菌群呈圆形凸起状(直径1mm左右)；

8.用接菌环在平板上取菌，再放入液体培养基中进行富集培养，10d后得到目标菌株浓度较高的纯净的菌液；

9.在此基础上对该嗜酸性氧化硫硫杆菌进行生理生化、形态学及16SrDNA进行分析鉴定。

具体，以上所述的SM培养基配方如下：

SM培养基(液)：分别称取硫酸铵0.4g,硫酸二氢钾3.0g,七水和硫酸镁0.5g,二水和氯化钙0.25g,加入蒸馏水1000ml,硫按10g/L的量加入。在28℃、180r/m的条件下放置3-4d后得到。

SM培养基(固)：A液：称取硫酸铵2.0g,硫酸二氢钾0.25g,七水和硫酸镁0.25g，氯化钾0.1g，四水和硝酸钙0.01g,加入蒸馏水50ml后将pH调节至3；B液：五水和硫代硫酸钠22.1g，加入蒸馏水100ml；C液：琼脂30g,加入蒸馏水400ml。将A、B、C三液分别121℃、30min湿法灭菌后，冷却至60℃，三者混合，然后迅速倒平板。

菌株ZJ-1在去除重金属中的应用。

1、菌株ZJ-1的活化和扩大培养：从SM固体培养基上挑取单菌落，接种于20mL液体SM培养基中，于30℃、120r/min摇床培养4天左右，观察到浑浊。将培养的种子液按1％的接种量接种于新鲜的100mL培养基中，于30℃、120r/min摇床培养5天左右，可以观察到明显的浑浊。

2、菌株ZJ-1的驯化：将上述活化和扩大培养得到的菌液按照10％的接种量接种于100mL的固体废物浆液中，并向其中投加0.3％的硫和0.04％的硫酸铵，30℃、200r/min摇床培养，并检测其中pH变化。

3、菌株ZJ-1对各类重金属的去除作用：将驯化完成的菌液，按20％的量添加入固废浆液中，以纯固废作为空白对照组，分别监测实验组和空白组中重金属离子的浓度，以判定固废中重金属是否以离子的形式析出。

有益效果：投资少、运行费用低，无二次污染；处理效率高；工作条件要求低。

附图说明

表1是嗜酸性氧化硫硫杆菌ZJ-1 16sRNA的核苷酸序列表

图1是ZJ-1的进化树

图2是菌株培养的表观图

图3是经过革兰氏染色之后的菌株形态

图4是在ZJ-1作用下Cu离子的去除率

图5是在ZJ-1作用下Zn离子的去除率

图6是在ZJ-1作用下Cd的析出去除率

图7是在ZJ-1作用下Pb的析出去除率

具体实施方式

下面结合附图说明和具体实施例对本发明的技术方案做进一步描述，但不应视为对本发明保护范围的限制。下述的实施例中所使用的实验方法无特殊说明均为常规方法。下述的实施例中所使用的实验试剂耗材等无特殊说明均可从商业用途购买。

实施例1

嗜酸性氧化硫硫杆菌Acidithiobacillus thiooxidans ZJ-1的筛选方法；

称取10g酸洗污泥样品，放入装有100ml(121℃、30min湿法灭菌过的)纯液体培养基(SM培养基)的锥形瓶中，再向其中加入硫粉，待瓶中浊液pH值降至2.0左右时,静置后吸取上层清液10mL，接种到盛有100mL已湿法灭菌SM培养基的250mL锥形瓶中，并且加入10g硫粉，置于恒温摇床中培养(30℃、150rpm)；培养8d-10d，待培养基变成浑浊的乳白色(pH值约为2)。从中吸取10mL接种到新鲜的SM培养基中，重复富集培养3-4之后，使得嗜酸性氧化硫硫杆菌成为其中的优势菌群；对富集好的培养基进行稀释涂布于固体SM培养基；将涂布好的培养皿在室温下放置2h后，放置在30℃培养箱中倒置培养，培养15d后，发现固体培养基上得到了较为纯净的菌群，平板上的菌群呈圆形凸起状(直径1mm左右)；用接菌环在平板上取菌，再放入液体培养基中进行富集培养，10d后得到目标菌株浓度较高的纯净的菌液。如图2、图3。

实施例2

去除受污染土壤中的重金属；

取待测样品加水制成混合浆液，测定其中的各类重金属浓度。在每个250mL锥形瓶中加入120mL浆液，并向其中投加少量硫和硫酸铵，将驯化完成的菌液，按20％的量添加入固废浆液中，以加灭活菌液的固废浆液作为空白对照组，分别监测实验组和空白组中重金属离子的浓度，用析出浓度占浆液中重金属浓度的比例作为去除率。如图4－7所示。

表1 嗜酸性氧化硫硫杆菌ZJ-1 16s RNA序列表：

AGGAATCTGTCTTTGAGTGGGGGACAACCCAGGGAAACTTGGGCTAATACCGCATAAGCCCTGAGGGGGAAAGCGGGGGATCTTCGGACCTCGCGCTGGAAGAGGAGCCTACGTCTGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCGGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTTCGCAATGGGGGCAACCCTGACGAAGCAATGCCGCGTGAATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTTCTTTCGTGGAGGACGAAAAGGTGGGTGCTAATATCGCCTGCTGTTGACGTGAATCCAAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATCACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTGCATTAGGTCTGTCGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAATGGCGGTGGAAACCGGTGTACTAGAGTATGGGAGAGGGTGGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAACATCAGTGGCGAAGGCGGCCACCTGGCCCAATACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGAATACTAGATGTTTGGTGCCAAGCGTACTGAGTGTCGTAGCTAACGCGATAAGTATTCCGCCTGGGAAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTCTGGAATCCTGCAGAGATGCGGGAGTGCCCTTCGGGGAATCAGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCTTTATGTCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCGTACAGAGGGAAGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCAGACCCCAGAAAGCGCGTCGTAGTTCGGATTGCAGTCTGCAACTCGACTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC。

SEQUENCE LISTING

<110> Nanjing Tech University

<120> 一株氧化硫硫杆菌及其在去除重金属中的应用

<130> 20170427

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1281

<212> DNA

<213> Acidithiobacillus thiooxidans ZJ-1

<400> 1

aggaatctgt ctttgagtgg gggacaaccc agggaaactt gggctaatac cgcataagcc 60

ctgaggggga aagcggggga tcttcggacc tcgcgctgga agaggagcct acgtctgatt 120

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