一种植物乳杆菌及其在制备预防便秘的食品中的应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，涉及一种植物乳杆菌及其在制备食品中的应用。

背景技术：

牦牛酸乳是青藏高原藏族地区的一种自然发酵乳制品，含有丰富的营养成分，具有抗氧化、降低胆固醇、调节免疫力的作用。由于特殊的自然发酵条件，包括发酵原料乳、发酵温度、发酵时间、发酵器皿，特别是特殊的发酵微生物组成，造成牦牛酸乳具有特殊风味及品质。

当每周排便次数低于3次的时候会被视为处于便秘状态，当次数低于1次视为严重的便秘状态，是一种威胁人体健康，特别是对结肠健康具有较大影响的复杂症状。便秘通常不被视为疾病，大多数情况可以通过日常饮食和习惯的调节预防便秘。

技术实现要素：

本发明的目的在于对牦牛酸乳中的微生物进行分离鉴定，并对其活性和应用进行研究。

经研究，本发明提供如下技术方案：

1.植物乳杆菌YS1(Lactobacillus plantarum YS1)，保藏编号为CCTCC NO：M2016747。

2.植物乳杆菌YS1在制备预防便秘的食品中的应用。

本发明对青海玉树藏族自治州的牦牛酸乳中的微生物进行了分离鉴定，将其中一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)命名为YS1，于2016年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M2016747。

活性炭诱导便秘模型小鼠研究结果显示，植物乳杆菌YS1的抗胃酸和胆盐能力强于保加利亚乳杆菌，能够抑制便秘造成的小鼠体重下降，粪便重量、颗粒数和含水量下降，同时可以提高活性炭在小肠中的推进率，减少排出首粒黑便的时间，还能使便秘小鼠的血清胃动素(MTL)、胃泌素(Gas)、内皮素(ET)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、P物质(SP)和血管活性肠肽(VIP)血清水平提高，生长抑素(SS)水平下降。RT-PCR实验结果进一步显示，植物乳杆菌YS1可以上调便秘小鼠小肠组织中c-Kit、SCF、GDNF mRNA表达，下调TRPV1、NOS mRNA表达。高浓度的植物乳杆菌YS1显示出更好的作用，且显著优于同浓度的保加利亚乳杆菌。这些实验结果证明，植物乳杆菌YS1可以有效的抑制便秘，能够用于制备预防便秘的食品。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种植物乳杆菌YS1，其可以有效的抑制便秘，且效果显著优于常用的保加利亚乳杆菌，能够用于制备预防便秘的食品，不仅扩大了植物乳杆菌YS1的应用范围，提高了其应用价值，而且给便秘的预防带来了新的希望。

附图说明

图1为植物乳杆菌YS1的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为λDNA/HindⅢMarker，1为植物乳杆菌YS1的基因组DNA。

图2为植物乳杆菌YS1的16S rDNA基因片段PCR扩增结果，其中M为DNA Marker，C为阴性对照，1为植物乳杆菌YS1的16S rDNA基因片段PCR扩增产物。

图3为植物乳杆菌YS1对活性炭诱导便秘小鼠体重的影响。

图4为植物乳杆菌YS1对活性炭诱导便秘小鼠首粒黑便排出时间的影响。

图5为植物乳杆菌YS1对活性炭诱导便秘小鼠小肠组织中c-Kit和SCF mRNA表达的影响。

图6为植物乳杆菌YS1对活性炭诱导便秘小鼠小肠组织中TRPV1、GDNF和NOS mRNA表达的影响。

图3至图6中，LB表示保加利亚乳杆菌，LP-YS1表示植物乳杆菌YS1。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、植物乳杆菌YS1的分离和鉴定

一、乳酸菌的分离纯化

采自青海玉树藏族自治州牧民家庭的自然发酵牦牛酸乳样品10份，每份样品用无菌玻棒充分搅匀后，吸取50mL放入无菌离心管中，置于食品采样箱内带回实验室，4℃冰箱保存。

每份牦牛酸乳样品取1mL，用灭菌生理盐水作10倍梯度稀释至10^-7。取10^-5、10^-6、10^-7三个稀释度各1mL稀释液分别于装有15mL MRS培养基(含质量比为5％的CaCO₃)的平皿中，混匀，置30℃恒温箱培养72±3h。每个稀释度作三个平行。菌落形成后，观察其形态特征，挑取有溶钙圈的不同菌落分别接种于脱脂乳培养基中，置30℃培养24～48h，待菌株生长良好后，划线接种于MRS琼脂培养基，置30℃培养48h；重复以上步骤至少三次，直至得到纯菌落。

二、乳酸杆菌的鉴定

将纯菌株在MRS固体培养基上划线，置30℃培养48h，用10倍放大镜观察菌落大小、形状等表观特征，进行革兰氏染色，挑取形态典型的菌株进行过氧化氢酶试验。将革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阴性的球菌菌株和杆菌菌株，暂定为乳酸菌。

将乳酸杆菌菌株分别进行生长温度试验(10℃、45℃、60℃，30min)、pH值梯度试验、运动性试验、接触酶试验、氧化酶试验、硫化氢试验、明胶液化实验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、葡萄糖产气试验、联苯胺试验、石蕊牛乳试验、精氨酸产氨试验、酪素分解试验以及各种糖醇发酵试验等。

结果从10份牦牛酸乳样品中共分离纯化出20株乳酸杆菌，均为革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性。通过形态学观察和生理生化试验，将这20株菌株初步鉴定为7种乳酸杆菌，依次编号为L_b1～L_b7，其中，编号为L_b4的乳酸杆菌初步鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(表1)。

表1编号为L_b4的乳酸杆菌的形态学特征和生理生化试验结果

注：+，阳性；－，阴性；+w，弱阳性。

三、植物乳杆菌的鉴定

取编号为L_b4的乳酸杆菌液体培养的菌悬液，离心弃上清，收集菌体，按照细菌基因组DNA提取试剂盒(北京索莱宝科技公司)所述方法提取基因组DNA，进行琼脂糖凝胶电泳(凝胶质量比浓度0.8％，电压80V，电泳80min)，用GelRed核酸染料染色后，在凝胶成像系统中观察(图1)。将提取的基因组DNA稀释200倍，用紫外分光光度计进行浓度纯度测定。采用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID No.1)和1492R：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID No.2)对16S rDNA基因片段进行PCR扩增(图2)，扩增产物由生工生物工程(上海)有限公司和北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序，并将测序结果(SEQ ID No.3)与Genbank中相关序列进行比对。结果显示，编号为L_b4的乳酸杆菌的16S rDNA基因片段序列与Lactobacillus plantarum strain NBRC 15891的相似性达到99％。

因此，编号为L_b4的乳酸杆菌鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，将其命名为YS1，并于2016年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M2016747。

实施例2、植物乳杆菌YS1对活性炭诱导小鼠便秘的预防作用

通过给小鼠灌胃活性炭使胃肠道粘膜表面被活性炭附着，导致消化道中含水量下降，消化液减少，引发胃肠运动减慢形成便秘。在对乳酸菌便秘预防效果的前期研究中，发明人证实首粒黑便排便时间、MTL、Gas、ET、SS、AChE、SP、VIP的水平等都可作为评价乳酸菌便秘预防作用的指标；通过进一步的分子生物学实验检测结肠组织中相关mRNA表达能更确切的证实乳酸菌的生理功效。

本实施例使用的主要材料、仪器与实验动物如下：植物乳杆菌YS1(保藏号：CCTCC NO：M2016747)，保加利亚乳杆菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心)；MTL、Gas、ET、SS、AChE、SP和VIP(北京普尔伟业生物科技有限公司)；Trizol试剂、OligodT₁₈、RNase、dNTP、MLV逆转录酶(美国Invitrogen公司)；ROX reference Dye和SYBR Premix Ex Taq II(日本TAKARA公司)；RT-PCR引物(北京天根生化科技有限公司)。D550数码相机(日本佳能公司)；SevenEasy pH计(瑞士梅特勒-托利多公司)；iMark酶标仪、T100梯度PCR仪(美国伯乐公司)。七周龄雌性昆明小鼠购自重庆医科大学实验动物中心(许可证号：SYXK(渝)2012-0001)，饲养于控温控湿环境中(温度25±2℃，相对湿度50±5％)，每12h调节光/暗周期，提供小鼠标准饲料和饮水。

一、植物乳杆菌YS1抗胃酸能力和胆盐耐受力检测

乳酸菌要发挥益生菌作用，需要在胃和肠道的强酸性条件下，到达目的地(通常是大肠)定植并发挥其生理功效。因此，为了研究乳酸菌的潜在益生菌作用，建立体外虚拟模型，检测乳酸菌的抗胃酸能力和胆盐耐受力是重要的检测手段。

将NaCl和胃蛋白酶溶于蒸馏水中并用1mol/L的HCl调整pH为3.0，达到NaCl的质量比为0.2％，胃蛋白酶的质量比为0.35％，真空过滤去除细菌，作为人工胃液备用。将植物乳杆菌YS1活化后进行培养，取培养液5mL，3000r/min离心10min，收集菌体，用5mL生理盐水重悬后，与人工胃液按体积比1∶9混匀，37℃培养3h，测定0h和3h时的植物乳杆菌YS1活菌数，按公式计算植物乳杆菌YS1在pH 3.0人工胃液中的生存率(％)＝3h活菌数(CFU/mL)/0h活菌数(CFU/mL)×100。

将植物乳杆菌YS1按2％的接种量接种于含有质量比为0.0、0.3％、0.5％、1.0％的牛胆盐的MRS-THIO培养基，37℃培养24h，以未接种植物乳杆菌YS1的空白培养基为对照，在600nm处测定吸光度值，按公式计算植物乳杆菌YS1在胆盐中的生存率(％)＝含胆盐培养基OD₆₀₀/空白培养基OD₆₀₀×100。

结果如表2所示，植物乳杆菌YS1在pH 3.0人工胃液中和不同浓度胆盐中的生存率均高于保加利亚乳杆菌，且植物乳杆菌YS1在pH 3.0人工胃液中的生存率是保加利亚乳杆菌的约2.5倍，而在不同浓度胆盐中的生存率是保加利亚乳杆菌的约10倍，说明植物乳杆菌YS1具有比保加利亚乳杆菌更强的抗胃酸能力和胆盐耐受力。

表2植物乳杆菌YS1抗胃酸能力和胆盐耐受力检测

二、植物乳杆菌YS1对活性炭诱导小鼠便秘的预防作用

选取体重约25g的昆明小鼠100只，平均分为5组，分别是正常组、便秘对照组、保加利亚乳杆菌处理组、植物乳杆菌YS1低浓度处理组和高浓度处理组。适应饲养1周后，正常组和便秘对照组小鼠正常自由摄入饮食和饮水2周；在这2周中除了正常自由摄入饮食和饮水外，保加利亚乳杆菌处理组小鼠每日每只灌胃2mL的1.0×10⁹CFU/mL的保加利亚乳杆菌，植物乳杆菌YS1低浓度处理组和高浓度处理组小鼠每日每只分别灌胃2mL的1×10⁸CFU/mL的植物乳杆菌YS1和1×10⁹CFU/mL的植物乳杆菌YS1。2周后除正常组小鼠外，其他4组小鼠每日灌胃2mL的活性炭水(温度为4℃，按质量比将10％的活性炭加入含10％阿拉伯树胶的水溶液中制成悬液)，同时乳酸菌处理各组继续灌胃乳酸菌，持续3天。实验过程中每日上午定时测定所有小鼠的体重、膳食摄入量、饮水量、粪便重量和粪便湿度。

1、植物乳杆菌YS1对小鼠体重和粪便的影响

实验过程中每日上午定时测定所有小鼠的体重、膳食摄入量、饮水量、粪便重量和粪便湿度。

体重变化是小鼠发生便秘的重要指标。由图3可以看出，前2周中各组小鼠的体重都呈现出正常的增长状态，各组之间没有明显差异；活性炭诱导便秘后，没有经过活性炭处理的正常组小鼠体重继续增长，其余各组小鼠体重均出现下降，其中便秘对照组小鼠的体重下降最多，植物乳杆菌YS1高浓度处理组小鼠的体重最接近正常组，显著高于同浓度的保加利亚乳杆菌处理组，说明植物乳杆菌YS1能够抑制便秘造成的小鼠体重下降，且效果优于保加利亚乳杆菌。

排便状态可以最明显的体现便秘的程度，便秘状态中粪便重量、颗粒数和含水量均是重要的粪便状态指标，这些指数下降表现出便秘程度的加重。如表3所示，第1-14天各组小鼠的粪便重量、颗粒数和含水量没有显著差异；活性炭诱导便秘后，第15-17天正常组小鼠的粪便重量、颗粒数和含水量最高，便秘对照组最低，保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌YS1都可以显著缓解便秘造成的粪便重量、颗粒数和含水量下降(P＜0.05)，但植物乳杆菌YS1高浓度处理组小鼠的粪便重量、颗粒数和含水量最接近正常组，显著高于同浓度的保加利亚乳杆菌处理组，说明植物乳杆菌YS1能够抑制便秘造成的小鼠粪便重量、颗粒数和含水量下降，且效果优于保加利亚乳杆菌。

表3植物乳杆菌YS1对小鼠粪便的影响

注：字母不同表示组间差异显著(P＜0.05)。

2、植物乳杆菌YS1对活性炭推进率和首粒黑便排出时间的影响

第17天灌胃活性炭水后对包括正常组在内所有小鼠实施断食24h，但仍给予小鼠自由摄入饮水，24h后所有小鼠每只灌胃0.2mL的活性炭水；30min后每组一半小鼠(10只)实施断颈处死，取小鼠血浆备用，同时取小肠观察活性炭在小鼠小肠中的推进率，推进率(％)＝活性炭推进长度/小肠总长度×100；每组剩余10只小鼠继续观察其排出首粒黑便的时间。

便秘造成肠道蠕动频率降低，粪便停留在肠道的时间增加，造成有害细菌以粪便为食物连续繁殖，从而威胁肠道健康，加重便秘。活性炭诱导小鼠便秘后小肠中活性炭推进长度和活性炭推进率可以作为评价小肠活动和便秘程度的指标。由表4可以看出，活性炭诱导便秘后，保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌YS1都可以增进活性炭在小鼠小肠中的推进长度，但植物乳杆菌YS1高浓度处理组的活性炭推进率最高，显著高于植物乳杆菌YS1低浓度处理组和同浓度的保加利亚乳杆菌处理组(P＜0.05)，说明植物乳杆菌YS1可以提高活性炭在小鼠小肠中的推进率，且效果优于保加利亚乳杆菌。

表4植物乳杆菌YS1对便秘小鼠胃肠道推进的影响

注：字母不同表示组间差异显著(P＜0.05)。

便秘造成肠道运动减慢，粪便在肠道中滞留时间增加，使首粒黑便排出时间加长，越短的首粒黑便排出时间意味着肠道运动越正常。由图4可以看出，正常组的首粒黑便排出时间最短(88±7min)，便秘对照组的首粒黑便排出时间最长(231±33min)，植物乳杆菌YS1高浓度处理组的首粒黑便排出时间(132±16min)显著短于植物乳杆菌YS1低浓度处理组(163±22min)和同浓度的保加利亚乳杆菌处理组(175±27min)(P＜0.05)，说明植物乳杆菌YS1可以减少便秘小鼠的首粒黑便排出时间，具有良好的便秘缓解作用，且效果优于保加利亚乳杆菌。

3、植物乳杆菌YS1对小鼠血清MTL、Gas、ET、SS、AChE、SP和VIP水平的影响

取收集的小鼠血浆，4500rmp离心15min，分离血清，按试剂盒操作测定小鼠血清的MTL、Gas、ET、SS、AChE、SP和VIP水平。MTL可以刺激胃蛋白酶的产生和促进肠道运动；Gas能促进胃肠分泌和胃肠运动，促进幽门松弛，起到缓解便秘的作用；ET在血管张力稳定性和维持基本心血管系统中起重要作用；SS可以刺激肠道运动；AChE可以条件肌肉收缩和粘液分泌，可以使肌肉放松从而推进粪便排出；SP是一种有助于肠道蠕动的物质；保持VIP在肠壁中的正常含量也是稳定肠道功能的重要手段。

由表5可以看出，正常组小鼠血清的MTL、Gas、ET、AChE、SP和VIP水平最高，SS水平最低；便秘对照组小鼠呈现出相反的趋势；保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌YS1都可以使上述物质的血清水平接近正常组水平，但植物乳杆菌YS1的作用更显著，说明植物乳杆菌YS1可以使便秘小鼠的血清MTL、Gas、ET、SS、AChE、SP和VIP水平尽量保持正常，从而缓解便秘。

表5植物乳杆菌YS1对小鼠血清MTL、Gas、ET、SS、AChE、SP和VIP水平的影响

注：字母不同表示组间差异显著(P＜0.05)。

4、植物乳杆菌YS1对小鼠小肠组织mRNA表达的影响

取小鼠的小肠组织，粉碎后用RNAzol提取结肠组织总RNA，稀释至1μg/μL；取2μL稀释后的总RNA提取液，依次加入1μL的oligodT18、RNase、dNTP、MLV酶和10μL的5×buffer，37℃120min、99℃4min、4℃3min合成cDNA；然后采用表2所述引物，RT-PCR扩增c-Kit、SCF、TRPV1、GDNF和NOS的mRNA表达，以持家基因GAPDH作为内参照；最后用含质量比为1％的溴化乙锭的琼脂电泳检查PCR扩增产物。

表6RT-PCR引物序列

便秘患者肠道内的ICC(Cajal间质细胞)较少，c-Kit是ICC的特异性标志物，是ICC增殖的关键。SCF浓度对ICC的生殖非常重要，SCF不存在的环境下ICC不能进行生长。文献报道，便秘小鼠结肠组织中的ICC含量较少，结肠组织中的c-Kit表达水平也下降。植物乳杆菌YS1对小鼠小肠组织c-Kit和SCF mRNA表达的影响见图5，便秘对照组小鼠小肠中c-Kit和SCF mRNA表达下降，植物乳杆菌YS1可以显著上调小鼠小肠中的c-Kit和SCF mRNA表达，且高浓度时作用更加明显。

TRPV1已经被证实与排便有密切关系，激活TRPV1可以触发神经递质的释放，从而导致小肠运动障碍。TRPV1表达增加是肠损伤的一个显著现象，由于肠胃紊乱造成肠道损伤，使便秘患者有更高的TRPV1表达。GDNF可以调节神经节细胞的功能，从而有助于修复受损的肠道，可防止便秘。NOS对调节胃肠运动起重要作用。NO的增加能造成更严重的结肠动力障碍，控制NOS可以降低NO的含量，是控制便秘的可行途径。植物乳杆菌YS1对小鼠小肠组织中TRPV1、GDNF和NOS mRNA表达的影响见图6，正常组小鼠具有最高的GDNF mRNA表达和最低的TRPV1、NOS mRNA表达，而便秘对照组小鼠的GDNF mRNA表达最低、TRPV1和NOS mRNA表达最高，相对于便秘对照组，保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌YS1都可以上调GDNF mRNA表达和下调TRPV1、NOS mRNA表达，但植物乳杆菌YS1的作用明显优于保加利亚乳杆菌。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110> 重庆第二师范学院；谭芳

<120> 一种植物乳杆菌及其在制备预防便秘的食品中的应用

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物27F

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agagtttgat cctggctcag 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物1492R

<400> 2

ggctaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1472

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌YS1（Lactobacillus plantarum YS1）

<220>

<223> 16S rDNA基因片段

<400> 3

gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gaactctgga ttgattggtg 60

cttgcatcat gatttacatt tgagtgagtg gcgaactggt gagtaacacg tgggaaacct 120

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<223> RT-PCR扩增c-Kit mRNA表达的上游引物

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<223> RT-PCR扩增c-Kit mRNA表达的下游引物

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<213> 人工序列

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<223> RT-PCR扩增SCF mRNA表达的上游引物

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<213> 人工序列

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<223> RT-PCR扩增SCF mRNA表达的下游引物

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<213> 人工序列

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<223> RT-PCR扩增TRPV1 mRNA表达的上游引物

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agcgagttca aagacccaga 20

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<212> DNA

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<223> RT-PCR扩增TRPV1 mRNA表达的下游引物

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ttctccacca agagggtcac 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> RT-PCR扩增GDNF mRNA表达的上游引物

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ttttattcaa gccaccatc 19

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<223> RT-PCR扩增GDNF mRNA表达的下游引物

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agcccaaacc caagtca 17

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<212> DNA

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<223> RT-PCR扩增NOS mRNA表达的上游引物

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ccacatctgg caggatgaga a 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> RT-PCR扩增NOS mRNA表达的下游引物

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aggcacagaa ctgagggtac a 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> RT-PCR扩增GAPDH mRNA表达的上游引物

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cggagtcaac ggatttggtc 20

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<213> 人工序列

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<223> RT-PCR扩增GAPDH mRNA表达的下游引物

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agccttctcc atggtcgtga 20