一种鞘氨醇单胞菌WG生产威兰胶的发酵工艺的制作方法

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种高产的威兰胶发酵工艺。

背景技术：

威兰胶(welan gum)是一种由微生物合成的多糖类高分子聚合物，主链结构由四糖重复单元(D-葡萄糖-D-葡糖醛酸-D-葡萄糖-L-鼠李糖)组成，侧链由L-甘露糖基或L-鼠李糖基组成。

威兰胶具有良好的稳定性、悬浮性、乳化性、增稠性和独特的剪切稀化性能，因此，可作为增稠剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、润滑剂、成膜剂和粘合剂应用于工农业的各个方面，尤其是在制药、食品、化工、石墨、混凝土和生物采油方面具有较好的应用前景。

目前，威兰胶主要是通过微生物发酵法生产，美国kelco公司现是全球最大的威兰胶生产和供应商，国内对威兰胶的研究尚处于起步阶段，南京工业大学、南昌大学、江南大学和河北鑫合化工有限公司从事这方面的研究。有研究者通过菌株诱变育种及发酵条件优化在一定程度上提高了威兰胶的发酵水平，但是，目前报道的利用鞘氨醇单胞菌生产威兰胶的最高产量仅仅达到33g/L，这就限制了威兰胶的工业化生产。因此，高产稳产的威兰胶生产工艺仍是目前亟待解决的问题。

中国专利201410485635.5公开了一株生产威兰胶的菌株，即鞘氨醇单胞菌WG(Sphingomonas sp.WG，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2013161)，该菌株经过三阶段发酵调控策略，在20L发酵罐水平威兰胶产量可以达到33g/L。但是，由于对该菌株所需要的最优培养条件及营养条件了解较少，限制了威兰胶发酵产量的进一步提高。

技术实现要素：

本发明提供一种鞘氨醇单胞菌WG生产威兰胶的发酵工艺，该工艺通过优化培养基组成与培养条件，进而提高威兰胶产量。

本发明主要应用鞘氨醇单胞菌WG(Sphingomonas sp.WG，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2013161)，通过单因素、Plackett-Burman(PB)设计、中心组合设计及响应面分析等方法优化该菌株发酵培养基组成及培养条件，以期实现威兰胶产量的大幅提高，为威兰胶的大规模工业化生产奠定基础。

本发明所采用的技术方案是，一种鞘氨醇单胞菌WG生产威兰胶的发酵工艺，所述发酵工艺包括如下步骤：

1)菌种培养：首先，配制种子培养基：葡萄糖10g，酵母粉1g，蛋白胨5g，磷酸二氢 钾2g，硫酸镁0.1g，去离子水定容至1L。然后，接种鞘氨醇单胞菌WG(Sphingomonas sp.WG，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2013161)至种子培养基中，28℃、150rpm培养16h，获得液体发酵菌种；

2)配制发酵培养基：葡萄糖72.4g、酵母粉3.58g、K₂HPO₄ 3g、MgSO₄ 0.1g、ZnSO₄0.1g，1M NaOH调节pH至7，去离子水定容至1L。量取上述发酵培养基50mL至250mL三角瓶中，115℃灭菌30min；

3)发酵：接种2.5mL(5％，v/v)的液体发酵菌种至上述培养基中，32.5℃、摇床转速为200rpm、发酵72h完成发酵过程。

1.作为优选，所述的一种鞘氨醇单胞菌WG生产威兰胶的发酵工艺，其特征是，所述的发酵条件为：装液量50mL(250mL三角瓶)，接种量2.5mL(5％，v/v)，培养基初始pH为7，培养温度为32.5℃，摇床转速为200rpm，发酵周期为72h。

2.作为优选，所述的一种鞘氨醇单胞菌WG生产威兰胶的发酵工艺，其特征是，发酵培养基中最佳碳源和最佳氮源分别为葡萄糖和酵母粉。

3.作为优选，所述的一种鞘氨醇单胞菌WG生产威兰胶的发酵工艺，其特征是，发酵培养基组成为葡萄糖72.4g、酵母粉3.58g、K₂HPO₄ 3g、MgSO₄ 0.1g、ZnSO₄ 0.1g，1M NaOH调节pH至7，去离子水定容至1L。

本发明的优点和有益效果：

本发明从发酵工程的角度出发，提供一种生产工艺简单、便于推广的威兰胶发酵优化工艺，实现威兰胶产量的大幅提高，降低其生产成本，为实现威兰胶的工业化大规模生产提供依据。

附图说明

图1，发酵条件对威兰胶产量的影响。(A)接种量的影响，(B)装液量的影响，(C)pH的影响，(D)温度的影响，(E)转速的影响；

图2，不同碳源(A)及葡萄糖浓度(B)对威兰胶产量的影响；

图3，不同氮源(A)及酵母粉浓度(B)对威兰胶产量的影响；

图4，无机盐对威兰胶产量的影响。(A)磷酸二氢钾的影响；(B)磷酸氢二钾的影响；(C)硫酸镁的影响；(D)硫酸锌的影响；(E)硫酸钙的影响。

具体实施方式

实施例1

初始发酵培养基组成(g/L)：葡萄糖40，酵母粉2，磷酸氢二钾4，磷酸二氢钾2，硫酸镁0.1，去离子水定容。

初始的培养条件如下：接种量为5％(v/v)，装液量为50mL(250mL三角瓶)，培养基pH为自然pH，培养温度为28℃，摇床转速为150rpm，发酵周期为72h。

实施例2

通过单因素实验设计，对可能影响威兰胶产量的培养条件(如接种量、装液量、培养基初始pH、温度、转速)进行了优化。具体设定为：接种量1％、3％、5％、6％、7％、8％、10％(v/v)；250mL三角瓶中装液量为25、50、75、100、125、150mL，培养温度为25、27.5、30、32.5、35℃，培养基初始pH为2-10，摇床转速为125、150、175、200、225rpm。培养基为初始发酵培养基。

检测不同发酵条件下的威兰胶产量，结果分别如图1所示，可以得出如下结论：1.随着接种量的增加，威兰胶产量呈现先上升后下降的趋势，最优接种量为5％。2.当装液量为50mL时最有利于威兰胶的生产。3.培养基初始pH对威兰胶产量影响较大，当pH为7时最有利于威兰胶生产。4.同传统的威兰胶发酵温度(28℃或30℃)不同，当温度为32.5℃时威兰胶产量达到最高值。5.较大的转速有利于威兰胶的合成，当转速达到200rpm时威兰胶的产量最高。基于以上结果，优化后的培养条件为：装液量50mL(250mL三角瓶)，接种量2.5mL(5％，v/v)，培养基初始pH为7，培养温度为32.5℃，摇床转速为200rpm。

实施例3

在初始发酵培养基中，分别以4％(w/v)的不同糖类物质替代葡萄糖成为碳源：果糖、甘露醇、L-山梨糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、葡萄糖、D-半乳糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、棉籽糖、葡聚糖(T5)、可溶性淀粉和纤维素。所选定的糖类替代葡萄糖作为单一碳源，培养条件为最优发酵条件，发酵72h后测定发酵液中威兰胶的产量。

不同碳源所对应的威兰胶产量见图2。从图中可以看到，当碳源为葡萄糖时威兰胶产量最高，故采用单因素设计对葡萄糖的浓度进行优化，选取的葡萄糖浓度为10-80g/L，葡萄糖浓度为60g/L时产量最高。

实施例4

在初始发酵培养基中，分别加入0.2％(w/v)的不同氮源替代酵母粉成为氮源，包括碳酸氢铵、硝酸铵、氨水、氯化铵、乙酸铵、尿素、鱼粉和胰蛋白胨，培养条件为最优发酵条件，发酵72h后测定发酵液中威兰胶的产量。

不同单一氮源对应的威兰胶产量见图3。从图中可以看到，当以酵母粉为单一氮源时威兰胶的产量最高，故采用单因素设计对酵母粉的浓度进行了优化，选取的酵母粉浓度为0.1-1％，发现当酵母粉浓度在0.2-0.4％范围内时，威兰胶的产量较高，其中，当浓度为0.3％时威兰胶产量最高。

实施例5

首先对培养基中磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的浓度进行优化，选取的浓度为0-0.5％，由图4可以发现，随着磷酸二氢钾浓度的升高，威兰胶的产量呈现下降趋势，这说明磷酸二氢钾对威兰胶的生产起到了负作用，因此，在后续实验中，培养基中均未加入磷酸二氢钾。随着磷酸氢二钾浓度的增加，威兰胶的产量呈现出先升高后降低的趋势，当磷酸氢二钾浓度为0.3％时，威兰胶的产量最高。

随后，采用单因素设计对硫酸锌、硫酸钙和硫酸镁的浓度进行了优化，选取的浓度为0-0.05％，培养条件为最优发酵条件，发酵72h后测定发酵液中威兰胶的产量。由图4可以发现，硫酸镁、硫酸锌和硫酸钙的最优浓度分别为0.01％、0.01％和0.02％。

实施例6

在单因素实验基础上，选取葡萄糖、酵母粉、磷酸氢二钾、硫酸锌、硫酸钙和硫酸镁等6个因素进行Plackett-Burman设计实验(N＝12)，筛选出众多实验因素中对威兰胶产量有显著影响的因素。该实验以威兰胶产量为响应值，根据单因素实验筛选出的各因素的较优浓度，设计每个因素的两个水平(表1)，另外设置两个虚拟变量用于估计误差，实验设计及结果如表2所示。

表1 Plackett-Burman Design实验变量水平取值

对PB实验结果进行回归分析(表3)，p值小于0.0500的因素对发酵水平有显著影响，p值大于0.1000的因素对发酵水平无显著影响，p值越小说明该因素对发酵水平影响越显著。因此，根据回归分析结果，对威兰胶产量有显著影响的因素是葡萄糖和酵母粉。另外其他因素的对威兰胶的合成影响较小，将不予进一步考虑，由于CaSO₄对于该菌的发酵效果影响较小(Effect值仅0.004)，所以培养基中可不添加CaSO₄。本模型的R-S_q＝95.2％，R-S_q(调整)＝89.4％，说明该评价效应较好，模型与实际情况较为拟合。

表2 Plackett-Burman设计及实验结果

表3 PB实验设计回归分析结果

实施例7

为进一步确定葡萄糖和酵母粉的最优浓度，根据中心组合设计原理，设计了2因素5水平的响应面分析(RSA)实验。该实验共有13个实验点，可分为两类：一是析因点，自变量取值在X₁、X₂所构成的三维顶点，共有8个析因点；二是零点，为区域的中心点，零点实验重复5次，用以估计实验误差。以葡萄糖和酵母粉两个因素为自变量，以威兰胶产量为响应值，同时用Design-Expert软件对实验数据进行多元回归分析，得到响应面分析实验设计及结果如表4和5所示。经回归拟合后，各实验因素对响应值的影响可用下列回归方程表示:Y＝39.952+4.96726X₁+5.26516X₂+1.905X₁X₂–14.58350X₁²-13.38350X₂²，其中，Y是响应值，即威兰胶产量，X₁，X₂分别表示葡萄糖和酵母粉。模型的p值小于0.0001，而失拟值为0.105，说明所拟合的回归方程合适，对实验拟合情况良好。

回归方程各项的方差分析结果表明，方程一次项X₁，X₂和二次项X₁²，X₂²的影响是非常显著的，但是二者交互系数X₁X₂的p值为0.1548，说明葡萄糖-酵母粉的交互作用对威兰胶产量影响不显著。从回归方程的方差分析结果表明，相关系数R²为0.9862，表明威兰胶产量98.62％的变异分布在方程的2个因子中，其总变异中仅有1.38％不能被该模型检验。调整方差值Adj-R²为0.9763，再次确认了所建立模型适用于威兰胶产量高低的理论预测。

表4中心组合设计及响应面分析结果

表5中心组合实验设计和响应面分析回归分析结果

^a SS，sum of squares；

^b DF，degree of freedom；

^c MS，mean square

通过对该方程进行回归分析结果表明，最优葡萄糖浓度为72.4g/L，最优酵母粉浓度为3.58g/L。综合之前单因素优化的结果，最优培养基组成(g/L)为：葡萄糖72.4、酵母粉3.58、K₂HPO₄ 3、MgSO₄ 0.1、ZnSO₄ 0.1，预测威兰胶产量可以达到40.96g/L。

实施例8

为进一步验证培养基优化结果，用实验所确定的最佳培养条件和培养基组成进行发酵。结果表明，发酵72h结束后威兰胶的产量为40.47g/L，这一值与预测值40.96g/L误差范围小于5％，证明用响应面法优化鞘氨醇单胞菌WG发酵培养基组成是可行的，优化后的威兰胶产量较优化前(15.98g/L)提高了153％，处于国际领先水平。