本发明属于兽医生物学技术领域，涉及一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法。
技术背景
猪支原体肺炎又称猪喘气病，是由猪肺炎支原体引起的一种慢性呼吸道传染病。临床上以咳嗽、气喘和肺部典型的“虾肉”样病变为特征，发病率高，死亡率低。猪肺炎支原体可以通过抑制先天性和后天性肺脏免疫导致多杀性巴氏杆菌等上呼吸道共生菌在肺脏增殖并促使疾病发生，它还可以与猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒混合感染，加重疾病的发生。尽管猪肺炎支原体并非引起肺脏疾病的唯一病原，但是它作为能引起肺脏疾病病原体的增强子而著称，因此成为造成经济损失的一个主要原因。
猪支原体肺炎等疾病有效的预防和控制方法是为猪只提供优良的生活环境，如保证圈舍内的空气清新、通风条件良好、环境温度适宜及猪只的数量适宜，猪场实施科学严谨的管理措施，如控制猪的进出流动、仔猪早期断奶等。但是这些有效控制方法在国内猪场很难做到。目前猪场常使用的方法是药物治疗和疫苗防控。
不管是猪肺炎支原体灭活疫苗还是弱毒活疫苗，无细胞培养都需要培养基。猪肺炎支原体由于基因组小，基因数量有限，从而导致生物合成途径缺乏，需要从生长环境中获取糖、氨基酸、嘌呤、嘧啶和膜成分，这就要求猪肺炎支原体培养基中含有这些成分。从猪肺炎支原体分离、鉴定至今，已有不同配方的培养基，从最早的煮沸猪肺组织灭活细胞培养基、猪肺埋块无细胞培养基，到后来的Friis培养基、江苏农科院的KM2培养基、兽医生物制品制造及检验规程中的猪肺炎支原体培养基，都可以培养出猪肺炎支原体，但是培养的滴度难以超过109CCU，血清用量也都比较高。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种营养丰富、培养滴度高、生产成本低且适合猪肺炎支原体(兔化弱毒株)快速生长的高效培养基。本发明提供的培养基可使猪肺炎支原体(兔化弱毒株)的菌液滴度达到109-1010CCU，培养时间仅需40～48h，且所需猪血清浓度不超过10％，最优组合猪血清仅需8％。培养时间大大缩短可以减少陈旧菌、老龄菌的产生，从而减少陈旧菌、老龄菌代谢产生的有害物质，并且减少生产耗能；培养基中猪血清的用量大大降低，一方面有利于减少由猪血清带来的过敏应激反应，另一方面有利于生产成本的大幅降低。
本发明的另一目的是提供猪肺炎支原体(兔化弱毒株)高效培养基的制备方法。
本发明的技术方案
1.一种猪肺炎支原体培养基，由基础培养基包括20×Hank′s 25～35ml、酵母提取物1～5g、乳蛋白水解物0.5～3g、牛心提取物5～12g、去离子水770～870ml，辅助培养基包括5％精氨酸溶液1～5ml、5％半胱氨酸溶液1～5ml、5％辅酶Ι1～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml和灭活的健康猪血清80～200ml组成。
2.本发明所述的一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于它能培养猪肺炎支原体兔化弱毒株，并且培养的CCU滴度可以达到109～1010，所需猪血清浓度不超过10％。
3.本发明所述的一种高效猪肺炎支原体培养基，其特征在于20×Hank′s液包括：
20×Hank′s1：NaCl 12～16g、MgSO4·7H2O 0.1g～0.5g、KCl 0.4～1.0g、MgCl2·6H2O 0.1～0.5g、CaCl2 0.2～0.5g、去离子水100ml；
20×Hank′s2：Na2HPO4·12H2O 0.1～0.4g、KH2PO4 0.1～0.35g、葡萄糖1～5g、1％酚红溶液2～4ml、去离子水96～98ml。
4.本发明所述的一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于制备步骤如下：
(1)基础培养基的配制：按配比量取20×Hank′s 1 25～35ml、20×Hank′s 2 25～35ml，称取酵母提取物1～5g、乳蛋白水解物0.5～3g、牛心提取物5～12g、去离子水770～870ml，搅拌均匀，10M NaOH调pH至7.2～7.4，115℃高压灭菌20min；
(2)辅助培养基的配制：按配比量取过滤除菌的5％精氨酸溶液1～5ml、5％半胱氨酸溶液1～5ml、5％辅酶Ι1～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml、56℃灭活的猪血清80～200ml。
5.本发明所述的一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于它还包括高效猪肺炎支原体固体培养基，配制方法是在上述基础培养中加入0.8～1.5％琼脂糖。
本发明具体实施方式
1.培养基的组分
一种猪肺炎支原体(兔化弱毒株)高效培养基，其特征在于由基础培养基和辅助培养基组成。其中：
基础培养基的主要成分包括20×Hank′s 25～35ml、酵母提取物1～5g、乳蛋白水解物0.5～3g、牛心提取物5～12g、去离子水770～870ml；
辅助培养基的主要成分包括5％精氨酸溶液1～5ml、5％半胱氨酸溶液1～5ml、5％辅酶Ι1～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml和灭活的健康猪血清80～200ml。
2.培养基的制备方法
一种猪肺炎支原体(兔化弱毒株)高效培养基，其特征在于制备方法包括以下步骤：
(1)20×Hank′s液的制备：20×Hank′s液包括20×Hank′s1和20×Hank′s2。
1)20×Hank′s1：按配比称取NaCl 12～16g、MgSO4·7H2O 0.1～0.5g、KCl 0.4～1.0g、MgCl2·6H2O0.1～0.5g、CaCl2 0.2～0.5g，去离子水100ml，配制时CaCl2单独溶解，其余各成分逐一溶解，最后混合；
2)20×Hank′s2：按配比称取Na2HPO4·12H2O 0.1～0.4g、KH2PO4 0.1～0.35g、葡萄糖1～5g、去离子水96～98ml，逐一溶解后加入1％酚红溶液2-4ml。
(2)基础培养基的制备：
按配比量取20×Hank′s 1 25～35ml、20×Hank′s 2 25～35ml于770～870ml去离子水中，按配比逐一称取酵母提取物1-5g、乳蛋白水解物0.5-3g、牛心提取物5～12g，搅拌均匀，10M NaOH调pH至7.2～7.4，115℃高压灭菌20min，4℃保存备用。
(3)辅助培养基的制备：
1)5％精氨酸溶液：称取L-精氨酸5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
2)5％半胱氨酸溶液：称取L-半胱氨酸5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
3)5％辅酶Ι：称取辅酶Ι5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
(4)高效液体培养基的制备：使用前，向基础培养基中加入过滤除菌的5％精氨酸溶液1～5ml、5％半胱氨酸溶液1～5ml、5％辅酶Ι1～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml、56℃灭活的健康猪血清80～200ml，基础培养基定容至1000ml。
(5)高效固体培养基的制备：按配比向未高压灭菌的基础培养基中称取琼脂糖8～15g，115℃高压灭菌20min，待培养基冷凉至50～60℃时，按配比量取过滤除菌的5％精氨酸溶液1～5ml、5％半胱氨酸溶液1～5ml、5％辅酶Ι1～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml、56℃灭活的健康猪血清80～200ml，总体积为1000ml。铺平板，4℃保存备用。
本发明涉及生物材料资源信息
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)兔化弱毒株，购自中国兽医药品监察所。该菌株为疫苗生产菌株(参见宁宜宝主编，兽用疫苗学，中国农业出版社，2008年，p442)。
本发明的积极意义
本发明涉及一种高效的猪肺炎支原体培养基及其制备方法。本发明所述的高效猪肺炎支原体培养基由基础培养基和辅助培养基组成，其中：基础培养基主要成分有Hank′s液、乳蛋白水解物、酵母提取物、牛心提取物，可以通过高压蒸汽灭菌方式除菌，大大地减少了过滤除菌带来的污染风险；辅助培养基由猪血清、精氨酸、半胱氨酸、酚红溶液、青霉素等组成，猪血清通过钴照射除菌，其余成分过滤除菌后与灭活的猪血清混合。本发明培养基培养猪肺炎支原体兔化弱毒株的滴度达到109～1010CCU，培养时间最低可至40h，大大减少了陈旧菌、老龄菌的产生，并且猪血清用量可以低至8％，减少了猪血清带来的过敏应激反应，降低了企业生产成本。
实施例
为了使本发明更易理解，下面结合具体实施例证加以说明。
实施例1
——本发明培养基的制备
1.20×Hank′s液的制备：
1)20×Hank′s1：称取NaCl 16g、MgSO4·7H2O 0.5g、KCl 1.0g、MgCl··6H2O 0.5g，各成分逐一溶解于去离子水90ml，称取CaCl2 0.5g溶解于10ml去离子水，二者混匀；
2)20×Hank′s2：称取Na2HPO4·12H2O 0.4g、KH2PO4 0.35g、葡萄糖5g，逐一溶解于去离子水98ml，并加入1％酚红溶液2ml。
2.基础培养基的制备：
量取20×Hank′s 1 35ml、20×Hank′s 2 35ml于722ml去离子水中，称取酵母提取物2g、乳蛋白水解物0.5g、牛心提取物6g，逐一搅拌溶解，10M NaOH调pH至7.4，115℃高压灭菌20min。
3.辅助培养基的制备：
1)5％精氨酸溶液：称取L-精氨酸5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
2)5％半胱氨酸溶液：称取L-半胱氨酸5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
3)5％辅酶Ι：称取辅酶Ι5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
4.高效液体培养基的制备：
向上述基础培养基中加入0.22μm滤器过滤除菌的5％精氨酸溶液1ml、5％半胱氨酸溶液1ml、5％辅酶Ι1ml、10万/ml青霉素5ml、56℃灭活的健康猪血清200ml。
实施例2
——本发明培养基的制备
(1)20×Hank′s液的制备：
1)20×Hank′s1：称取NaCl 12g、MgSO4·7H2O 0.1g、KCl 0.4g、MgCl2·6H2O 0.1g，各成分逐一溶解于去离子水90ml，称取CaCl2 0.2g溶解于10ml去离子水，二者混匀；
2)20×Hank′s2：称取Na2HPO4·12H2O 0.1g、KH2PO4 0.10g、葡萄糖5g，逐一溶解于去离子水96ml，并加入1％酚红溶液4ml。
(2)基础培养基的制备：
量取20×Hank′s 1 25ml、20×Hank′s 2 25ml于825ml去离子水中，称取酵母提取物5g、乳蛋白水解物3g、牛心提取物12g，逐一搅拌溶解，10M NaOH调pH至7.2，115℃高压灭菌20min。
(3)辅助培养基的制备：
1)5％精氨酸溶液：称取L-精氨酸5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
2)5％半胱氨酸溶液：称取L-半胱氨酸5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
3)5％辅酶Ι：称取辅酶Ι5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
(4)高效液体培养基的制备：
向上述基础培养基中加入过滤除菌的5％精氨酸溶液5ml、5％半胱氨酸溶液5ml、5％辅酶Ι5ml、10万/ml青霉素10ml、56℃灭活的健康猪血清100ml。
实施例3
——本发明培养基的制备
(1)20×Hank′s液的制备：
1)20×Hank′s1：称取NaCl 15g、MgSO4·7H2O 0.2g、KCl 0.6g、MgCl2·6H2O 0.3g，各成分逐一溶解于去离子水90ml，称取CaCl2 0.3g溶解于10ml去离子水，二者混匀；
2)20×Hank′s2：称取Na2HPO4·12H2O 0.2g、KH2PO4 0.20g、葡萄糖2g，逐一溶解于去离子水97ml，并加入1％酚红溶液3ml。
(2)基础培养基的制备：
量取20×Hank′s 1 30ml、20×Hank′s 2 30ml于780ml去离子水中，称取酵母提取物3g、乳蛋白水解物2g、牛心提取物8g，逐一搅拌溶解，10M NaOH调pH至7.3，115℃高压灭菌20min。
(3)辅助培养基的制备：
1)5％精氨酸溶液：称取L-精氨酸5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
2)5％半胱氨酸溶液：称取L-半胱氨酸5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
3)5％辅酶Ι：称取辅酶Ι5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，–20℃保存备用。
(4)高效液体培养基的制备：
向上述基础培养基中加入0.22μm滤器过滤除菌的5％精氨酸溶液2ml、5％半胱氨酸溶液2ml、5％辅酶Ι2ml、10万/ml青霉素5ml、56℃灭活的健康猪血清150ml。
实施例4
——本发明培养基与现有培养基培养猪肺炎支原体(兔化弱毒株)的比较
1.菌株及培养条件
猪肺炎支原体兔化弱毒株购自中国兽医药品监察所，经本发明的培养基培养几十代后菌液CCU滴度稳定在109～1010。该菌株接种于上述3种具体实施的培养基和现有的商品化培养基(青岛日水生物技术有限公司的猪肺炎支原体培养基(批号20150624)、卡迈舒生物科技有限公司的猪肺炎支原体培养基(批号20150223)、招远拓普生物工程有限公司的KM2猪肺炎支原体肉汤培养基(批号20150610)及Goodwind等复合培养基(参见甘肃农业大学.兽医微生物学实验指导.北京:农业出版社,1980.)、石河子大学KM2培养基(参见李石,李劼,周霞.猪肺炎支原体生长培养基的筛选.黑龙江畜牧兽医,2014(18):61-63)、改良Freys氏培养基和支原体培养基(参见中华人民共和国兽用生物制品规程2000年版.北京:化学工业出版社,2001)，种子复壮后以5％比例接种，37℃震荡培养，当培养基颜色变黄，pH值降至6.5以下时，取出培养菌液。
2.活菌滴度CCU(颜色改变单位)测定
每个培养菌液取13支无菌试管，每支试管装0.9ml不同配方的培养基，向第1管中加入0.1ml待测菌液，涡旋机上混匀后，更换吸头，吸取0.1ml到第2支试管，如此依次进行10倍系列稀释，直至第12管，第13管设为对照，仅添加培养基，不添加猪肺炎支原体菌液，每个培养菌液做3个重复。将所有试管放在37℃恒温培养箱中培养，每日观察试管菌液变色情况并作记录。观察时间为2周，最后发生颜色改变的试管稀释度即为该菌液的CCU。
3.猪肺炎支原体生长情况及CCU测定结果
猪肺炎支原体(兔化弱毒株)在不同配方培养基中的生长情况及培养时间见下表1。
表1猪肺炎支原体(兔化弱毒株)在不同配方培养基中的生长情况
猪肺炎支原体(兔化弱毒株)在支原体培养基、青岛日水猪肺炎支原体培养基、卡迈舒猪肺炎支原体培养基中不能生长，接种后培养10天均未观察到颜色变化；在改良Frey氏培养基中培养4天变色，CCU滴度仅为103，继续传代1次，7天变色，CCU为101，再继续传代则不再变色；在拓普KM2培养基中也是培养4天变色，但CCU滴度仅为101，继续传代不再变色；在Goodwin等复合培养基中连续传代3次后也不再变色，而且随着传代次数的增加CCU在逐渐降低(数据未列出)。而猪肺炎支原体(兔化弱毒株)在上述本发明培养基中培养2天即变色，CCU滴度都在109以上。
本发明的培养基非常适合猪肺炎支原体(兔化弱毒株)的生长，5％的接种比例传代，一般培养40～48h培养基pH从7.6降至6.5左右，最优组合下猪血清用量仅为8％，培养的菌液CCU为1010。而一般的猪肺炎支原体培养基并不适合猪肺炎支原体兔化弱毒株的生长。
实施例5
——本发明培养基与已申请专利猪肺炎支原体培养基的比较见表2。
表2本发明培养基与已申请专利猪肺炎支原体培养基的比较