复合微生物菌剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于环境微生物
技术领域：
，涉及一种用于城乡河道污水原位修复的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
：城市河道和湖泊是与人类生产和生活紧密相连的水环境，作为城市生态系统重要的组成部分，具有供应水源、改善环境、提供绿地、文化教育和娱乐休闲等功能，对城市的生态建设具有重要意义。但是随着城市化进程的不断加快，城市人口聚集，经济活动日趋频繁，工业废水和生活污水大量排放增，垃圾的随意丢弃，导致水体中有机物、氨氮、总磷和硫化氢等污染物持续增加，环境污染问题日益严重，严重制约城市的社会、经济与环境可持续发展，同时危及人民的身体健康。去除水体污染物传统的手段主要有物理和化学方法，虽然在河道及湖泊污染治理上具有一定效果，但也存在着问题。例如物理方法中的底泥疏浚能否对河道污染物具有长效的控制以及是否对底栖生境产生负面影响还存在争议。化学絮凝处理技术中的加入铁盐促进磷沉淀、加入石灰脱氮等方法，虽然见效快、效率高，但易造成二次污染。生物修复技术是近期快速发展起来的一项水体污染物修复的新技术，它利用特定生物特别是微生物对水体中污染物的吸收、转化或降解，达到减缓或最终消除水体污染、恢复水体生态功能的生物措施。微生物具因其培养周期短、生长繁殖迅速、适应能力强、转化效率高等特点，在治理河道污染水体的过程中发挥着重要作用。微生物修复河道污水的作用主要包括：1)微生物通过同化作用会转化部分有机污染物为自身物质，另一方面微生物会产生不同的生物酶能快速降解大分子有机物，实现对水体有机污染物的降解和去除。2)一些氨化细菌、硝化细菌及反硝化细菌可以降解水中的氨基氮和硝基氮，实现水体中氮素的生物地球化学循环过程，并最终使水体中过量的氮素以氮气的形式逸出水体。3)一些微生物通过特性的的代谢作用可以降低水体中磷素浓度，另一方面某些微生物能通过同化作用，将水体中的有效磷转化为菌体自身的有机磷，通过食物链的传递作用，去除水体中的磷。4)通过复合微生物的协同作用，降低水体巾氮、磷营养盐水平，通过营养竞争的方式抑制藻类的生长；同时通过改善水体理化环境，促进浮游动物种群的生长壮大，以浮游动物捕食藻类的方式控制藻类的生长。申请号为201410449850.X的发明专利公开了一种城市河水污染治理的复合微生物制剂及其制备方法，该方法通过将嗜酸芽孢杆菌制剂、热带假丝酵母菌剂和枯草芽抱杆菌菌剂混合制备成复合微生物菌剂，适于城市问道河水COD和氨氮含量超标、河水污浊、发臭等污染的修复与治理，其可快速修复水体生态环境，防止水体二次污染，并能很快恢复水体的自净化功能，消解河底污泥。申请号为201510949257.6的发明专利公开了一种用于河道治理的复合微生物制剂，复合微生物包括亚硝酸纯球菌、氧化硫杆菌、脱氮副球菌、芽抱杆菌、红螺旋菌、乳酸杆菌及酿酒酵母。该复合微生物菌剂投入污染水体中，能明显改善水体发黑发臭问题，降低水质氨氮与总磷含量。申请号为201310126043.X的发明专利公开了一种用于净化问道污水的微生物菌剂及其制备方法，其包括下述重量份的组分：纳豆芽抱杆菌20～40份、硝化细菌10～30份、白腐真菌5～15份、假单胞菌5～15份、光合细菌10～40份。该微生物菌剂具有适应性强，能快速形成优势菌群，补充水体土著菌。投入水中能降低污染河水的COD、NH3-N、总氮、TP等，且能除臭除色。并能产生高洁性生物酶，抑制有害菌的生长，加速分解残留饵料、动植物残体，具有显著的水质净化效果。可见，继续探索微生物菌剂用于河道治理的研究，有望缓解或彻底改善日益严重的水体环境污染问题。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种城乡河道污水原位修复的复合微生物菌剂，可以分解不同有机物、降解水中的氨基氮和硝基氮、降低水体中磷素浓度以及抑制藻类的生长。为解决上述技术问题，本发明提出以下技术方案：一种复合微生物菌剂，所述复合微生物菌剂包括假单胞菌制剂、不动杆菌制剂、解淀粉芽孢杆菌制剂、枯草芽胞杆制剂、地衣芽胞杆菌制剂、乳酸乳球菌制剂、类球红细菌制剂、碱湖迪茨氏菌制剂和沼泽红假单胞菌制剂。上述的复合微生物菌剂，优选的，假单胞菌为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13433的假单胞菌。上述的复合微生物菌剂，优选的，所述复合微生物菌剂中各组分的体积份为：假单胞菌制剂5～15份、不动杆菌制剂5～15份、解淀粉芽孢杆菌制剂5～15份、枯草芽孢杆菌制剂5～15份、地衣芽孢杆菌制剂5～15份、乳酸乳球菌制剂5～15份、类球红细菌制剂5～15份、碱湖迪茨氏菌制剂5～15份、沼泽红假单胞菌制剂5～15份。上述的复合微生物菌剂，优选的，所述复合微生物菌剂中，总菌落数≥6.0×1010cfu/mL。上述的复合微生物菌剂，优选的，不动杆菌为不动杆菌CGMCCNo.1.8587，解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.1.7463，枯草芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌CGMCCNo.1.2162，地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌CGMCCNo.1.6510，乳酸乳球菌为乳酸乳球菌CGMCCNo.1.3920，类球红细菌为类球红细菌CGMCCNo.1.2174，碱湖迪茨氏菌为碱湖迪茨氏菌CGMCCNo.1.6147，沼泽红假单胞菌为沼泽红假单胞菌CGMCCNo.1.2351。作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将假单胞菌接种于固体斜面培养基I中进行活化，制得活化假单胞菌；然后将活化假单胞菌接种于液体培养基I进行扩大培养；再接种于发酵培养基I中，经发酵培养制得菌体浓度不小于3.0×109cfu/mL的假单胞菌制剂；(2)将不动杆菌接种于固体斜面培养基II中进行活化，制得活化不动杆菌；然后将活化不动杆菌接种于液体培养基II进行扩大培养；再接种于发酵培养基II中，经发酵培养制得菌体浓度不小于5.0×107cfu/mL的不动杆菌制剂；(3)将解淀粉芽孢杆菌接种于固体斜面培养基III中进行活化，制得活化解淀粉芽孢杆菌；然后将活化解淀粉芽孢杆菌接种于液体培养基III进行扩大培养；再接种于发酵培养基III中，经发酵培养制得菌体浓度不小于8.0×109cfu/mL的解淀粉芽孢杆菌制剂；(4)将枯草芽胞杆菌接种于固体斜面培养基IV中进行活化，制得活化枯草芽胞杆菌；然后将活化枯草芽胞杆菌接种于液体培养基IV进行扩大培养；再接种于发酵培养基IV中，经发酵培养制得菌体浓度不小于6.0×109cfu/mL的枯草芽胞杆菌制剂；(5)将地衣芽胞杆菌接种于固体斜面培养基V中进行活化，制得活化地衣芽胞杆菌；然后将活化地衣芽胞杆菌接种于液体培养基V进行扩大培养；再接种于发酵培养基V中，经发酵培养制得菌体浓度不小于8.0×108cfu/mL的地衣芽胞杆菌制剂；(6)将乳酸乳球菌接种于固体斜面培养基VI中进行活化，制得活化乳酸乳球菌；然后将活化乳酸乳球菌接种于液体培养基VI进行扩大培养；再接种于发酵培养基VI中，经发酵培养制得菌体浓度不小于7.0×105cfu/mL的乳酸乳球菌制剂；(7)将类球红细菌接种于固体斜面培养基VII中进行活化，制得活化类球红细菌；然后将活化类球红细菌接种于液体培养基VII进行扩大培养；再接种于发酵培养基VII中，经发酵培养制得菌体浓度不小于8.0×107cfu/mL的类球红细菌制剂；(8)将碱湖迪茨氏菌接种于固体斜面培养基IIX中进行活化，制得活化碱湖迪茨氏菌；然后将活化碱湖迪茨氏菌接种于液体培养基IIX进行扩大培养；再接种于发酵培养基IIX中，经发酵培养制得菌体浓度不小于6.0×107cfu/mL的碱湖迪茨氏菌制剂；(9)将沼泽红假单胞菌接种于固体斜面培养基IX中进行活化，制得活化沼泽红假单胞菌；然后将活化沼泽红假单胞菌接种于液体培养基IX进行扩大培养；再接种于发酵培养基IX中，经发酵培养制得菌体浓度不小于4.0×107cfu/mL的沼泽红假单胞菌制剂；(10)将步骤(1)制得的假单胞菌制剂、步骤(2)制得的不动杆菌制剂、步骤(3)制得的解淀粉芽孢杆菌制剂、步骤(4)制得的枯草芽胞杆菌制剂、步骤(5)制得的地衣芽胞杆菌制剂、步骤(6)制得的乳酸乳球菌制剂、步骤(7)制得的类球红细菌制剂、步骤(8)制得的碱湖迪茨氏菌制剂和步骤(9)制得的沼泽红假单胞菌制剂按照比例混合后，得到复合微生物菌剂。上述的复合微生物菌剂的制备方法，优选的，所述固体培养基I中，含蛋白胨1g/100mL，酵母粉1.5g/100mL，葡萄糖2g/100mL，磷酸氢二钾0.1g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值6～8；所述固体培养基II中，含蛋白胨1.5g/100mL，葡萄糖1g/100mL，氯化钠0.5g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值6.5～7.5；所述固体培养基III中，含胰蛋白胨1g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，氯化钠1g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值6～8；所述固体培养基IV中，含胰蛋白胨1g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，氯化钠1g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值6～8；所述固体培养基V中，含蛋白胨1g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，氯化钠1g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值6～8；所述固体培养基VI中，含牛肉膏0.5g/100mL，蛋白胨0.5g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，番茄汁5g/100mL，葡萄糖1.0g/100mL，碳酸氢钙1.0g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值4～6.5；所述固体培养基VII中，含牛肉膏0.5g/100mL，蛋白胨0.5g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值6.5～7.5；所述固体培养基IIX中，含葡萄糖1g/100mL，乙酸钠0.2g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，氯化铵0.25g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值6.5～7.5；所述固体培养基IX中，含葡萄糖1g/100mL，乙酸钠0.2g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，维生素H0.01g/100mL，硫酸镁0.02g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值6.5～7.5。上述的复合微生物菌剂的制备方法，优选的，所述液体培养基I中，含葡萄糖1.5g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，蛋白胨1g/100mL，磷酸二氢钾0.05g/100mL，硫酸镁0.04g/100mL；所述液体培养基II中，含葡萄糖1.5g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，蛋白胨1g/100mL，氯化钠0.5g/100mL；液体培养基III中，含葡萄糖2.5g/100mL，酵母膏0.2g/100mL，磷酸二氢钾0.02g/100mL；所述液体培养基IV中，含葡萄糖2.5g/100mL，酵母膏0.2g/100mL，磷酸二氢钾0.02g/100mL；所述液体培养基V中，含甘油2.0g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，玉米浆1.5g/100mL，磷酸二氢钾0.02g/100mL；所述液体培养基VI中，含葡萄糖2.0g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，玉米浆1.5g/100mL，磷酸二氢钾0.02g/100mL，碳酸氢钙1.0g/100mL；所述液体培养基VII中，含葡萄糖2.0g/100mL，玉米浆1.5g/100mL，硫酸铵1.0g/100mL，谷氨酸钠0.2g/100mL，磷酸二氢钾0.02g/100mL；所述液体培养基IIX中，含葡萄糖1g/100mL，乙酸钠0.5g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，氯化铵0.5g/100mL，硝酸钾0.2g/100mL，硫酸镁0.02g/100mL，磷酸氢二钾0.05g/100mL；所述液体培养基IX中，含葡萄糖1.0g/100mL，乙酸钠1.0g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，氯化铵0.5g/100mL，硫酸镁0.05g/100mL，磷酸氢二钾0.02g/100mL。上述的复合微生物菌剂的制备方法，优选的，所述发酵培养基I中，含葡萄糖0.5～5g/100mL，酵母膏0.5～4g/100mL，黄豆粉1.0～6g/100mL，磷酸二氢钾0.01～0.1g/100mL，硫酸镁0.01～0.1g/100mL；所述发酵培养基II中，含葡萄糖0.5～5g/100mL，酵母膏0.3～3g/100mL，(NH4)2SO40.1～2.0g/100mL，柠檬酸钠0.1～1g/100mL，硫酸镁0.01～0.5g/100mL；所述发酵培养基III中，含糖蜜0.5～5.0g/100mL，红糖0.3～3.0g/100mL，酵母膏0.2～2.0/100mL，玉米浆0.5～5.0/100mL，磷酸二氢钾0.01～0.05g/100mL，硫酸镁0.005～0.05g/100mL；所述发酵培养基IV中，含糖蜜0.5～5.0g/100mL，红糖0.5～5.0g/100mL，黄豆粉0.5～3.0g/100mL，玉米浆1.0～5.0g/100mL，磷酸二氢钾0.01～0.1g/100mL；所述发酵培养基V中，含甘油1.0～5.0g/100mL，糖蜜1.0～5.0/100mL，玉米浆1.0～5.0g/100mL，黄豆粉0.5～3.0g/100mL，磷酸二氢钾0.01～0.1g/100mL，硫酸镁0.01～0.1g/100mL；所述发酵培养基VI中，含葡萄糖1.0～5.0g/100mL，酵母膏1.0～5.0g/100mL，玉米浆1.0～5.0/100mL，磷酸二氢钾0.01～0.1g/100mL，碳酸氢钙0.5～2.0g/100mL，柠檬酸0.2～2.0g/100mL；所述发酵培养基中，含葡萄糖1.0～5.0g/100mL，玉米浆1.0～5.0g/100mL，硫酸铵1.0～5.0g/100mL，谷氨酸钠0.1～1.5g/100mL，磷酸二氢钾0.01～0.1g/100mL；所述发酵培养基IIX中，含葡萄糖1.0～5.0g/100mL，乙酸钠0.5～2.0g/100mL，酵母膏1.0～5.0g/100mL，氯化铵0.5～2.0g/100mL，硝酸钾0.05～0.5g/100mL，硫酸镁0.01～0.1g/100mL，磷酸氢二钾0.01～0.1g/100mL，酒石酸钾钠0.1～1.0g/100mL；所述发酵培养基IX中，含葡萄糖0.2～2.0g/100mL，乙酸钠0.2～2.0g/100mL，酵母膏0.2～2.0g/100mL，氯化铵0.2～2.0g/100mL，硫酸镁0.01～0.1g/100mL，磷酸氢二钾0.01～0.1g/100mL。优选的，所述步骤(1)中，所述活化条件为：30～38℃，活化培养48～72h；所述扩大培养条件为：在旋转式摇床180rpm转速下，30℃培养48h；所述发酵培养条件为：在旋转式摇床100～200rpm转速下，30～38℃培养48～96h。优选的，所述步骤(2)中，所述活化条件为：30～38℃，活化培养48～72h；所述扩大培养条件为：在旋转式摇床180rpm转速下，30℃培养48h；所述发酵培养条件为：在旋转式摇床100～160rpm转速下，30～38℃培养49～120h。优选的，所述步骤(3)中，所述活化条件为：32～38℃，活化培养48～72h；所述扩大培养条件为：在旋转式摇床160rpm转速下，30℃培养48h；所述发酵培养条件为：在旋转式摇床100～200rpm转速下，30～38℃培养48～120h。优选的，所述步骤(4)中，所述活化条件为：32～38℃，活化培养48～72h；所述扩大培养条件为：在旋转式摇床150rpm转速下，37℃培养48h；所述发酵培养条件为：在旋转式摇床100～200rpm转速下，32～38℃培养48～120h。优选的，所述步骤(5)中，所述活化条件为：32～38℃，活化培养48～72h；所述扩大培养条件为：在旋转式摇床150rpm转速下，37℃培养48h；所述发酵培养条件为：在旋转式摇床100～200rpm转速下，30～38℃培养48～120h。优选的，所述步骤(6)中，所述活化条件为：32～38℃，活化培养48～72h；所述扩大培养条件为：在旋转式摇床150rpm转速下，35℃培养72h；所述发酵培养条件为：在旋转式摇床30～100rpm转速下，28～38℃培养72～200h。优选的，所述步骤(7)中，所述活化条件为：32～38℃，活化培养48～72h；所述扩大培养条件为：在旋转式摇床150rpm转速下，32℃培养72h；所述发酵培养条件为：在旋转式摇床100～200rpm转速下，28～38h℃培养72～200h。优选的，所述步骤(8)中，所述活化条件为：32～38℃，活化培养72～96h；所述扩大培养条件为：在旋转式摇床150rpm转速下，32℃培养72h；所述发酵培养条件为：在旋转式摇床50～100rpm转速下，30～38℃培养72～160h。优选的，所述步骤(9)中，所述活化条件为：32～38℃，活化培养72～96h；所述扩大培养条件为：在旋转式摇床50rpm转速下，32℃培养96h；所述发酵培养条件为：在旋转式摇床50～100rpm转速下，32～38℃培养100～200h。作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的复合微生物菌剂或上述的复合微生物菌剂的制备方法所制备的复合微生物菌剂在城乡河道污水原位修复中的应用。优选的，所述应用包括分解有机物、降解水中的氨基氮和硝基氮、降低水体中磷素浓度和/或抑制藻类的生长。与现有技术相比，本发明的优点在于：1、本发明的复合微生物菌剂，可以同时分解不同有机物、降解水中的氨基氮和硝基氮、降低水体中磷素浓度以及抑制藻类的生长。利用本发明的复合微生物菌剂进行城乡河道污水原位修复，具有高效、快速、无二次污染、操作简单等特点，有利于大规模推广应用。2、本发明的复合微生物菌剂包含的假单胞菌CGMCCNo.13433，是申请人经过筛选得到的一种高效的异养硝化-好氧反硝化菌株，且兼具高效的苯酚降解性能。异养硝化性能测定结果表明，该菌株对于氨氮具有很高的去除率，且中间产物硝酸盐和亚硝酸盐积累量极少；好氧反硝化性能测定结果表明，该菌株在有氧条件下能够将硝态氮和亚硝态氮很好的去除，且中间产物累积量极少，无二次污染。同时，菌株扩大培养后应用于SBR(序批式活性污泥法)工艺，对生活污水中氨氮、总氮和COD均有较高的去除率，在生活污水以及其他各种污染水体治理中具有很高的应用价值。苯酚降解性能研究结果表明，苯酚浓度为0-100mg/L区间，去除率可以达到95％以上，100-200mg/L区间，一步去除率也可以达到80％左右，因此，该菌株在工农业及地下水的氨氮超标兼苯酚污染的水处理或治理中有非常好的应用前景。生物材料保藏信息本发明的假单胞菌(Pseudomonassp.)，已于2016年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的名称是：蒙氏假单胞菌PS02，分类命名为PseudomonasmonteiliiPS02，保藏编号为：CGMCCNo.13433。具体实施方式以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。实施例1：假单胞菌CGMCCNo.13433的筛选及性能测定、培养和保存(1)假单胞菌CGMCCNo.13433的筛选及性能测定该假单胞菌CGMCCNo.13433是从上海污水处理池中活性污泥中分离选育而得的一种高效的异养硝化-好氧反硝化细菌，经中国微生物菌种保藏中心鉴定为假单胞菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。具体筛选过程如下：活性污泥取至上海污水处理池中污水处理池，从该活性污泥中取5mL泥水混合液至45mL灭菌的异养硝化培养基中。异养硝化培养基的配方为：(NH4)2SO40.945g/L，柠檬酸钠6.536g/L，MgSO4·7H2O1g/L，NaCl0.12g/L，MnSO4·H2O0.01g/L，FeSO4·7H2O0.02g/L，KH2PO40.2g/L，Na2HPO40.3g/L，pH7.0～7.5。然后置于30℃，200rpm的气浴摇床富集培养12h。将富集液进行梯度稀释后，均匀涂布于异养硝化固体培养基(琼脂20g/L，其余成分同异养硝化培养基)。在30℃恒温培养箱中培养1d后，挑取形态大小不同的单克隆，划线纯化后编号保藏，经初筛共得到10余株菌株。将以上初筛菌株接种到溴百里酚蓝(BTB)分离培养基。BTB培养基的配方为：KNO31g/L，琥珀酸钠8.5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，CaCl20.15g/L，FeSO4·7H2O0.05g/L，KH2PO40.25g/L，Na2HPO40.3g/L，1％BTB1mL，琼脂20g/L，pH7.0～7.5。1gBTB溶于100ml无水乙醇即得1％BTB乙醇溶液。在30℃恒温培养箱中培养1d后，挑取周围培养基出现蓝色晕圈的菌株至BTB培养基，划线纯化并编号保藏。从平板挑取菌落至富集培养基，富集培养基的配方为：葡萄糖6g/L，酵母粉12g/L，MgSO4·7H2O2.5g/L，CaCl20.5g/L，KH2PO42.5g/L，pH7.0。30℃气浴摇床200rpm培养12h，取1％(体积比)菌液离心洗涤，接种至硝化培养基。硝化培养基的配方为：(NH4)2SO40.945g/L，柠檬酸钠16.34g/L，MgSO4·7H2O1g/L，KH2PO40.2g/L，Na2HPO40.3g/L。30℃，200rpm摇瓶培养，定期取样测定氨氮(NH4+-N)、硝酸盐(NO3--N)和亚硝酸盐(NO2--N)的浓度，通过分析总氮(TN)的去除率来判断菌株的异养硝化性能。图1为假单胞菌CGMCCNo.13433对氨氮的去除效果图，由图1可以看出，假单胞菌CGMCCNo.13433具备很好的脱氮性能，24h时对总氮去除率达到98.7％，并且作为中间产物的硝态氮和亚硝态氮极少积累，累积量在0.02mg/L左右。挑取硝化性能好的菌落至富集培养基，30℃气浴摇床200rpm培养12h，取1％(体积比)菌液离心洗涤，接种至反硝化培养基。反硝化培养基配方为：KNO30.722g/L，柠檬酸钠6.128g/L，MgSO4·7H2O1g/L，KH2PO40.25g/L，Na2HPO40.3g/L。30℃，200rpm摇瓶培养，定期取样测定氨氮(NH4+-N)、硝酸盐(NO3--N)和亚硝酸盐(NO2--N)的浓度，通过分析总氮(TN)的去除率来判断菌株的好氧反硝化性能。图2为假单胞菌CGMCCNo.13433对硝酸盐的去除效果图，由图2可以看出，假单胞菌CGMCCNo.13433具有良好的脱氮性能，在以硝酸盐为唯一氮源时，其脱氮率达到99.7％。(2)培养采用的培养基为：葡萄糖1.5g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，蛋白胨1g/100mL，磷酸二氢钾0.05g/100mL，硫酸镁0.04g/100mL。将假单胞菌CGMCCNo.13433接种于上述培养基中，在旋转式摇床150rpm转速下，32℃培养24h，即得适于接种的种子。(3)保存在步骤(2)中培养好的假单胞菌种子中加入经过高温灭菌的甘油，甘油在种子液中的浓度为30％(V/V)，放在-80℃冰箱保存。实施例2城乡河道污水原位修复的复合微生物菌剂的制备(1)取假单胞菌CGMCCNo.13433种子，接种于固体培养基I中，经活化培养，活化条件为：37℃，活化培养48h，制得活化假单胞菌CGMCCNo.13433；然后将活化假单胞菌CGMCCNo.13433接种于液体培养基I进行扩大培养，扩大培养条件为：在旋转式摇床180rpm转速下，30℃培养48h；将扩大培养的假单胞菌种子按发酵液体积的10％接种于发酵培养基I中，在旋转式摇床150rpm转速下，32℃培养96h后，制得假单胞菌制剂，假单胞菌菌体浓度为4.0×109cfu/mL。其中，固体培养基I中，含蛋白胨1g/100mL，酵母粉1.5g/100mL，葡萄糖2g/100mL，磷酸氢二钾0.1g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值6～8；液体培养基I中，含葡萄糖1.5g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，蛋白胨1g/100mL，磷酸二氢钾0.05g/100mL，硫酸镁0.04g/100mL；发酵培养基I中，含葡萄糖2g/100mL，酵母膏1.5g/100mL，黄豆粉2/100mL，磷酸二氢钾0.02g/100mL，硫酸镁0.01g/100mL。(2)取不动杆菌CGMCCNo.1.8587，接种于固体培养基中，经活化培养，活化条件为：37℃，活化培养60h，制得活化不动杆菌；然后将活化不动杆菌接种于液体培养基II进行扩大培养；扩大培养条件为：在旋转式摇床180rpm转速下，30℃培养48h；将扩大培养的不动杆菌种子按发酵液体积的10％接种于发酵培养基II中，在旋转式摇床160rpm转速下，32℃培养96h后，制得不动杆菌制剂，不动杆菌菌体浓度为8.0×107cfu/mL。其中，固体培养基II中，含蛋白胨1.5g/100mL，葡萄糖1g/100mL，氯化钠0.5g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值6.5～7.5；液体培养基II中，含葡萄糖1.5g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，蛋白胨1g/100mL，氯化钠0.5g/100mL；发酵培养基II中，含葡萄糖3g/100mL，酵母膏1.5g/100mL，(NH4)2SO40.5g/100mL，柠檬酸钠0.2g/100mL，硫酸镁0.02g/100mL。(3)取解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.1.7463，接种于固体培养基中，经活化培养，活化条件为：37℃，活化培养48h，制得活化解淀粉芽孢杆菌；然后将活化解淀粉芽孢杆菌接种于液体培养基III进行扩大培养；扩大培养条件为：在旋转式摇床160rpm转速下，30℃培养48h；将扩大培养的解淀粉芽孢杆菌种子按发酵液体积的10％接种于发酵培养基III中，在旋转式摇床160rpm转速下，30℃培养72h后，制得解淀粉芽孢杆菌制剂，解淀粉芽孢杆菌体浓度为9.0×109cfu/mL。其中，固体培养基III中，含胰蛋白胨1g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，氯化钠1g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值6～8；液体培养基III中，含葡萄糖2.5g/100mL，酵母膏0.2g/100mL，磷酸二氢钾0.02g/100mL；发酵培养基III中，糖蜜1.5g/100mL、红糖1.0g/100mL、酵母膏1.5/100mL、玉米浆1.5/100mL、磷酸二氢钾0.02g/100mL，硫酸镁0.01g/100mL。(4)取枯草芽胞杆菌CGMCCNo.1.2162，接种于固体培养基中，经活化培养，活化条件为：37℃，活化培养60h，制得活化枯草芽胞杆菌；然后将活化枯草芽胞杆菌接种于液体培养基IV进行扩大培养；扩大培养条件为：在旋转式摇床150rpm转速下，37℃培养48h；将扩大培养的枯草芽胞杆菌种子按发酵液体积的5％接种于发酵培养基IV中，在旋转式摇床180rpm转速下，37℃培养72h后，制得枯草芽胞杆菌制剂，枯草芽胞杆菌体浓度为8.0×109cfu/mL。其中，固体培养基IV中，含胰蛋白胨1g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，氯化钠1g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值6～8；液体培养基IV中，含葡萄糖2.5g/100mL，酵母膏0.2g/100mL，磷酸二氢钾0.02g/100mL；发酵培养基IV中，含糖蜜2.0g/100mL、红糖1.5g/100mL、黄豆粉2.0g/100mL、玉米浆1.5g/100mL、磷酸二氢钾0.02g/100mL。(5)取地衣芽胞杆菌CGMCCNo.1.6510，接种于固体培养基中，经活化培养，活化条件为：35℃，活化培养48h；制得活化地衣芽胞杆菌；然后将活化地衣芽胞杆菌接种于液体培养基V进行扩大培养；扩大培养条件为：在旋转式摇床150rpm转速下，37℃培养48h；将扩大培养的地衣芽胞杆菌种子按发酵液体积的10％接种于发酵培养基V中，在旋转式摇床160rpm转速下，32℃培养96h后，制得地衣芽胞杆菌制剂，地衣芽胞杆菌菌体浓度为1.0×109cfu/mL。其中，固体培养基V中，含蛋白胨1g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，氯化钠1g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值6～8；液体培养基V中，含甘油2.0g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，玉米浆1.5g/100mL，磷酸二氢钾0.02g/100mL；发酵培养基V中，含甘油2.0g/100mL、糖蜜1.5/100mL、玉米浆3.0g/100mL、黄豆粉1.5g/100mL、磷酸二氢钾0.03g/100mL、硫酸镁0.02g/100mL。(6)取乳酸乳球菌CGMCCNo.1.3920，接种于固体培养基中，经活化培养，活化条件为：37℃，活化培养72h，制得活化乳酸乳球菌；然后将活化乳酸乳球菌接种于液体培养基VI进行扩大培养；扩大培养条件为：在旋转式摇床150rpm转速下，35℃培养72h；将扩大培养的乳酸乳球菌种子按发酵液体积的10％接种于发酵培养基VI中，在旋转式摇床50rpm转速下，32℃培养150h后，制得乳酸乳球菌制剂，乳酸乳球菌菌体浓度为8.0×105cfu/mL。其中，固体培养基VI中，含牛肉膏0.5g/100mL，蛋白胨0.5g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，番茄汁5g/100mL，葡萄糖1.0g/100mL，碳酸氢钙1.0g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值4～6.5；液体培养基VI中，含葡萄糖2.0g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，玉米浆1.5g/100mL，磷酸二氢钾0.02g/100mL，碳酸氢钙1.0g/100mL；发酵培养基VI中，含葡萄糖2.5g/100mL、酵母膏2.0g/100mL、玉米浆3.0/100mL、磷酸二氢钾0.02g/100mL，碳酸氢钙1.0g/100mL、柠檬酸0.5g/100mL。(7)取类球红细菌CGMCCNo.1.2174，接种于固体培养基中，经活化培养，活化条件为：35℃，活化培养72h；制得活化类球红细菌；然后将活化类球红细菌接种于液体培养基VII进行扩大培养；扩大培养条件为：在旋转式摇床150rpm转速下，32℃培养72h；将扩大培养的类球红细菌种子按发酵液体积的10％接种于发酵培养基VII中，在旋转式摇床150rpm转速下，32℃培养96h后，制得类球红细菌制剂，类球红细菌菌体浓度为9.0×107cfu/mL。其中，固体培养基VII中，含牛肉膏0.5g/100mL，蛋白胨0.5g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值6.5～7.5；液体培养基VII中，含葡萄糖2.0g/100mL，玉米浆1.5g/100mL，硫酸铵1.0g/100mL，谷氨酸钠0.2g/100mL，磷酸二氢钾0.02g/100mL；发酵培养基VII中，含葡萄糖3.0g/100mL、玉米浆2.0g/100mL、硫酸铵1.5gg/100mL、谷氨酸钠1.5g/100mL、磷酸二氢钾0.02g/100mL。(8)取碱湖迪茨氏菌CGMCCNo.1.6147，接种于固体培养基中，经活化培养，活化条件为：32℃，活化培养96h，制得活化碱湖迪茨氏菌；然后将活化碱湖迪茨氏菌接种于液体培养基IIX进行扩大培养；扩大培养条件为：在旋转式摇床150rpm转速下，32℃培养72h；将扩大培养的碱湖迪茨氏菌种子按发酵液体积的15％接种于发酵培养基IIX中，在旋转式摇床50rpm转速下，30℃培养120h后，制得碱湖迪茨氏菌制剂，碱湖迪茨氏菌菌体浓度为7.0×107cfu/mL。其中，固体培养基IIX中，含葡萄糖1g/100mL，乙酸钠0.2g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，氯化铵0.25g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值6.5～7.5；液体培养基IIX中，含葡萄糖1g/100mL，乙酸钠0.5g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，氯化铵0.5g/100mL，硝酸钾0.2g/100mL，硫酸镁0.02g/100mL，磷酸氢二钾0.05g/100mL；所述的发酵培养基IIX组分如下：葡萄糖2.0g/100mL、乙酸钠1.5g/100mL、酵母膏1.0g/100mL、氯化铵1.5g/100mL、硝酸钾0.2g/100mL、硫酸镁0.03g/100mL、磷酸氢二钾0.02g/100mL、酒石酸钾钠0.2g/100mL。(9)取沼泽红假单胞菌CGMCCNo.1.2351，接种于固体培养基IX中，经活化培养，活化条件为：32℃，活化培养96h，制得活化沼泽红假单胞菌；然后将活化沼泽红假单胞菌接种于液体培养基IX进行扩大培养，扩大培养条件为：在旋转式摇床50rpm转速下，32℃培养96h；将扩大培养的沼泽红假单胞菌种子按发酵液体积的15％接种于发酵培养基IX中，在旋转式摇床50rpm转速下，32℃培养160h后，制得沼泽红假单胞菌制剂，沼泽红假单胞菌菌体浓度为5.0×107cfu/mL。其中，固体培养基IX中，含葡萄糖1g/100mL，乙酸钠0.2g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，维生素H0.01g/100mL，硫酸镁0.02g/100mL，琼脂2g/100mL，pH值6.5～7.5；液体培养基IX中，含葡萄糖1.0g/100mL，乙酸钠1.0g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，氯化铵0.5g/100mL，硫酸镁0.05g/100mL，磷酸氢二钾0.02g/100mL；发酵培养基IX中，含葡萄糖1.5g/100mL、乙酸钠1.0g/100mL、酵母膏1.5g/100mL、氯化铵0.5g/100mL、硫酸镁0.05g/100mL、磷酸氢二钾0.02g/100mL。(10)将步骤(1)制得的假单胞菌制剂15份、步骤(2)制得的不动杆菌制剂10份、步骤(3)制得的解淀粉芽孢杆菌制剂8份、步骤(4)制得的枯草芽胞杆菌制剂12份、步骤(5)制得的地衣芽胞杆菌制剂8份、步骤(6)制得的乳酸乳球菌制剂15份、步骤(7)制得的类球红细菌制剂12份、步骤(8)制得的碱湖迪茨氏菌制剂10份和步骤(9)制得的沼泽红假单胞菌制剂10份混合，制得复合微生物菌剂，含活菌数约等于7.5×1010cfu/mL。实施例3复合微生物菌剂在城乡河道污水原位修复的应用上海郊区某河道，河水呈黑色，散发浓烈臭味，COD、氨氮和总磷超标。从该河道取2L水样，加入液体复合微生物菌剂2mL，每三天加菌剂一次，连续投料三周天后，测定结果表明，水体COD由投放微生物前的265mg/L下降至15.3mg/L；氨氮含量由修复前的16.8mg/L下降至0.69mg/L；总氮由31.53mg/L下降至0.97；总磷由2.82mg/L下降至0.23，修复后的水体达到了中华人民共和国地表水环境质量标准V类水质标准。表现了明显的水体修复效果(见表1)表1复合微生物菌剂对河道污水的修复效果COD(mg/L)NH3-N(mg/L)总氮(mg/L)总磷(mg/L)河道污水处理前26516.831.532.82加微生物菌剂处理后15.30.690.970.23去除率94.22％95.89％96.23％91.84％以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3