本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猪源唾液乳杆菌活菌制剂及应用。
背景技术：
益生菌又称益生素，是由Parker于1947年首先提出来的，现在一般是指投入后通过改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂及其代谢产物。
益生菌的作用机理：1、维持肠道微生态平衡：益生菌通过移植致病菌菌群的生长繁殖、保护有益菌群的平衡，有效防止畜禽疾病的发生，同时促进畜禽的消化吸收并降低料肉比；2、生物拮抗作用：益生菌定植于宿主肠道内，形成致密的膜菌群，形成生物屏障，阻止病原菌对肠道的粘附；3、生物夺氧：正常动物肠道以厌氧环境为主，益生菌的定植可以消耗肠道内的大量氧气，进而维持厌氧环境，使得病原菌因缺氧而抑制其生长繁殖；4、增强机体免疫力：益生菌能够刺激动物产生干扰素、细胞分裂素，活化免疫细胞，提高免疫球蛋白浓度和巨噬细胞活性，从而增强机体抗病性能；5、促进机体消化：益生菌产生的水解酶、发酵酶和呼吸酶，有利于降解饲料中蛋白质、脂肪和复杂碳水化合物，从而提高饲料利用率；6、抑制有毒物质的产生：益生菌可产生H2O2和天然抗生素类物质，减少肠道内氨及胺等有毒物质，抑制产氨腐败菌的生长，吸收肠道内毒素，防止腹泻，解少疾病；7、净化环境，改善畜产品品质：益生菌的作用使肠内及血液中氨和胺的含量下降，减少了随粪便排出体外的致病菌和氨等有害气体，减少对环境的污染。
活菌制剂菌种的选择需具备几点要求：1、菌种无病原性、无毒性；2、具有较强的抵抗消化道抑制因素的能力，对不良环境的耐受性较强；3、生长繁殖速度快；4、具有较强的吸附能力，能够分泌多种抑菌物质和各种消化酶类；5、对外界环境的适应性和抵抗性较强。目前用于微生物制剂的的微生物主要包括乳酸菌、双歧杆菌、粪链球菌、芽孢杆菌、酵母菌、放线菌、光合细菌等几大类。
乳酸菌是应用最早、最广泛的益生菌，它是指一类可发酵利用碳水化合物产生大量乳酸的细菌的总称，乳酸菌的代谢产物主要有有机酸、过氧化氢、细菌素等抑菌物质，可杀灭或阻止病原微生物在体内的定植，抑制致病菌的生长，在调节宿主肠道微生态平衡方面发挥着重要作用。
表1我国批准的可用于食品的乳杆菌名单
唾液乳杆菌属于乳杆菌科，乳杆菌属，广泛的存在于人和动物的肠道，近年来，唾液乳杆菌作为益生菌广泛用于人和动物益生菌制剂的生产，是我国卫生部2010年65号公告批准使用的食品生产加工的菌种之一。唾液乳杆菌具有一定的吸附作用，能够很好的在肠道表面定植进而发挥其免疫作用，有研究发现唾液乳杆菌表现出免疫调节，抗炎和抗感染的特性，同时，乳杆菌或其细胞成分能够改善动物的免疫功能，增强机体的免疫力。定植在肠道的乳杆菌生长代谢过程中可通过分泌的抗生素、细菌素等物质抑制其它细菌的生长，并与病原菌竞争生长空间进而发挥其拮抗作用。
虽然目前国内外对乳杆菌的研究报道很多，但通过动物实验进而将其应用于实际生产并用于饲料添加的报道还很少。
技术实现要素：
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种猪源唾液乳杆菌活菌制剂及应用，使用本菌剂可降低猪的腹泻率，提高猪的生长速度，降低料肉比，减少猪喂养过程中的抗生素使用量，符合绿色饲料添加剂的要求。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种猪源唾液乳杆菌活菌制剂，生产工艺包括以下步骤：
(1)将斜面保藏菌种接种于液体摇瓶培养基中，震荡至对数期；
(2)将上述培养好的菌种按5％接种量接入5L发酵罐，在培养基内培养至对数生长期，培养基的配方为：蛋白胨0.8-1.2％、酵母提取液0.4-0.8％、牛肉膏1-1.5％、葡萄糖1.3-2％、乙酸钠0.1-0.6％、柠檬酸钠0.15-0.25％、吐温80 0.05-0.15％、MgSO4·7H2O 0.05-0.06％、MnSO4·4H2O 0.001-0.005％、K2HPO4 0.1-03％和CaCO3 0.5-1.5％，调整pH值为5.5，控制培养温度为37℃，全流程培养时间为55-65小时，发酵结束后菌体数量可达到5亿个/ml以上；
(3)培养结束后，向发酵罐中的菌液加入助悬剂，制成活菌制剂。
优选地，所述步骤(1)中的菌种是从猪的粪便中分离筛选得到的。
优选地，所述步骤(1)中菌种的分离筛选包括以下步骤：从猪的直肠粪便中分离具有益生作用的乳酸菌菌株；体外培养；发酵；分析了分离菌株对猪肠道微生态环境的影响；筛选得到所述菌种。
优选地，所述步骤(2)中培养基的配方为：蛋白胨1％、酵母提取液0.6％、牛肉膏1.2％、葡萄糖1.6％、乙酸钠0.5％、柠檬酸钠0.215％、吐温80 0.1％、MgSO4·7H2O 0.058％、MnSO4·4H2O 0.005％，K2HPO40.2％和CaCO3 1％。
优选地，所述全流程培养时间为60小时，发酵结束后菌体数量达到5亿个/ml以上。
优选地，所述的猪源唾液乳杆菌活菌制剂在生猪养殖中的应用：本菌剂可降低猪的腹泻率，提高猪的生长速度，降低料肉比，减少猪喂养过程中的抗生素使用量，符合绿色饲料添加剂的要求。
(三)有益效果
本发明提供了一种猪源唾液乳杆菌活菌制剂及应用，具有以下优点：
1、本发明具有生产成本低、使用方便，使用效果好的优点，适用于个体养殖和规模化猪场的大面积推广使用。
2、本发明可有效降低猪腹泻率的发生，腹泻率降低60％以上，既降低了对环境的污染，又可减少猪生长过程中的抗生素使用，降低了养猪成本，保障了猪肉品质。
3、本发明还可提高猪的生长速度，降低了料肉比，提高了生产效益，由于本发明所用菌株分离自猪的肠道，菌体更容易定植于猪的肠道内，且所用菌株属于益生菌，对猪无任何副作用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
菌株的分离和鉴定：
以无菌方法取猪直肠内粪便，准确称取1g新鲜猪粪便，置于9mL生理盐水中，震荡15min进行混匀，进行10倍梯度稀释。每个稀释度吸取100μL样品加入RCM半固体培养基，培养48h，待培养基中长出菌落后尽可能多的挑选不同菌落形态的菌株进行纯化，对纯化后的菌株进行镜检确定其菌体形态，同时对其生物学特性进行测定。
对纯化后的菌株进行液体试管接种，提取其基因组DNA，以基因组DNA为模板通过PCR进行16S扩增，16SrDNA扩增使用细菌通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和1492R：5′-CGGYTACCTTGTTACGACTT-3′(引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成)，扩增片段长度为1.5kb左右。
挑取单菌落于10μl TE缓冲液中97℃高温破碎细胞壁，PCR反应体系：总体积25μl，包括2×PCR Master Mix12.5μl；浓度为10μmol/L的27F和1492R引物各1μl；DNA模板1μl；dd H2O 9.5μl。
PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃高温变性45s，53℃低温退火45s，72℃适温延伸90s，循环次数为33，最后72℃保温10min。PCR反应需要设置以超纯水代替模板DNA的阴性对照。
反应完成后经1％琼脂糖凝胶电泳进行验证，测序完成后进行序列比对，确定菌株的分类地位。其中，ZFB12菌株生长速度快，同时对低酸有很强的耐受性，能够保证菌体顺利通过胃的酸性环境进入肠道进行定植，且其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有很好的抑制，该菌经鉴定为Lactobacillus salivarius，主要生物学特性为G+，菌体短杆状，兼性厌氧，不耐高温。
实施例2
菌株优化实验:
(2.1)pH对唾液乳杆菌ZFB12的影响
ZFB12在MRS培养基中培养到对数期后期，取菌液在pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的生理盐水中，每隔30min测定其活菌数，结果表明，上述pH对菌株存活率无较大影响，当将pH降至1.0时，菌体数量有所下降，因此，ZFB12可以耐受pH值为2.0的酸性环境，当pH进一步降低时，菌株对其耐受性下降。
(2.2)唾液乳杆菌ZFB12的耐热性
ZFB12在MRS培养基中培养到对数期后期，将菌体接种到已预热至50℃、70℃、90℃的生理盐水中，每隔1min测定其中的活菌数，结果表明，ZFB12经50℃处理2min后存活率为93.7％，70℃处理2min后活菌数为41.2％,90℃处理2min后存活率为8.6％。
(2.3)唾液乳杆菌ZFB12的抑菌效果
采用牛津杯法，将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌加入培养基后进行混匀，倒平板，将发酵液接入牛津杯内，结果显示，ZFB12对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果显著。
(2.4)唾液乳杆菌ZFB12的毒力实验
将唾液乳杆菌ZFB12菌液配制成密度为1×106CFU/ml，分别以每只每天1.0ml、10.0ml菌液饲喂10日龄的健康乳猪，连续服用5天，观察所有试验猪活动状态、食欲、排便，以及10天内乳猪有否任何毒性作用及死亡现象。
结果：唾液乳杆菌ZFB12菌液饲喂10日龄的健康乳猪，连续服用5天，观察10天，可见乳猪活动状态良好，体温、食欲正常，排出正常粪便，未观察到对乳猪有毒性作用及死亡，说明该菌剂是安全的。
实施例3
实际应用实验：
(3.1)唾液乳杆菌ZFB12饮剂的动物实验
选取30日龄的仔猪进行实验，将其分成四组，每组三个重复，每个重复6头仔猪，保证仔猪的体重及身体状况基本相同，以不加发酵液的水作为对照，将发酵液加入喂养的水中，乳酸菌终浓度分别达到104、105和106CFU/ml，喂水前断水2h，连续喂养半个月。
(3.2)唾液乳杆菌ZFB12饮剂的应用剂量实验
经过半个月实验发现，与对照相比，添加乳酸菌的实验组仔猪腹泻率均出现下降，三个实验组相比，乳酸菌终浓度为105CFU/ml时，仔猪腹泻率最低，因此，选取乳酸菌终浓度为105CFU/ml作为最佳口服剂量。
(3.3)唾液乳杆菌ZFB12饮剂动物实验结果与对照相比结果，如表2和表3所示：
表2唾液乳杆菌饮剂对断奶仔猪体重的影响
表3腹泻情况观察结果
综上，本发明实施例具有如下有益效果：可有效降低猪腹泻的发生，有效促进仔猪生长，提高料肉比。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。