一种黄三素链霉菌和菌剂及其应用的制作方法

本发明涉及植物病害生物防治领域，特别涉及一种黄三素链霉菌和菌剂及其应用。

背景技术：

白绢病是由齐整小核菌(sclerotiumrolfsii)引起的一种常见的植物土传真菌病害，主要发生于作物茎基部，在土壤较湿润时，发病植株及周围土壤表面会形成白色菌丝层，进而发育成外形似油菜籽的菌核。在发病后期，茎基部腐烂导致水分和营养运输受阻，使作物干枯死亡。齐整小核菌的寄主超过500种，对农业生产危害极大。齐整小核菌能产生菌核，提高了病原菌对农药及其他防治措施的抗性，增加了白绢病的防治难度。由于化学农药在农产品及环境中的残留限制了其大量使用，而轮作及土壤消毒等方法对菌核消除效果不佳，探索新的防治途径是目前亟待解决的问题。生物防治能避免化学农药导致的食品及环境风险等问题，已引起广泛关注。

目前对白绢病的生物防治主要集中于木霉及细菌，利用放线菌抑制齐整小核菌(sclerotiumrolfsii)的报道较少，尚无放线菌次级代谢产物及活菌制剂对齐整小核菌菌核形成与土壤中菌核萌发抑制的报道。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于通过提供一种黄三素链霉菌和菌剂及其应用，有效抑制齐整小核菌，防治白绢病及其类似植物病害。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

(一)一种黄三素链霉菌，具体为黄三素链霉菌(streptomycesflavotricini)25，于2016年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编730072，保藏号为cctccno：m2016121。

对所述黄三素链霉菌(streptomycesflavotricini)25进行测序，其16srdna序列如seqidno.1所示。

(二)一种黄三素链霉菌菌剂，其特征在于，其有效成分为黄三素链霉菌(streptomycesflavotricini)25活菌孢子和/或黄三素链霉菌(streptomycesflavotricini)25的次级代谢产物。

优选地，所述菌剂为粉状菌剂，活菌数为3.3×10¹¹cfu/g。

(四)黄三素链霉菌在防治植物病害中的应用。

(五)黄三素链霉菌在防治白绢病中的应用。

(六)黄三素链霉菌菌剂在防治植物病害中的应用。

(七)黄三素链霉菌菌剂在防治白绢病中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

黄三素链霉菌可合成几丁质酶、葡聚糖酶及纤维素酶，可同时产生抗齐整小核菌的活性物质。这些真菌细胞壁水解酶能溶解齐整小核菌细胞壁，同时产生对病原菌丝的酶溶抗菌作用及活性物质拮抗作用。黄三素链霉菌的粉状活菌制剂施入未灭菌土壤可显著促进土壤中齐整小核菌菌核腐烂，并显著降低未腐烂菌核的萌发活性，从源头上减少病原数量，减轻白绢病及类似的植物病害。

附图说明

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

图1为黄三素链霉菌25的菌落特征图；

图2为黄三素链霉菌25的系统进化树；

图3为放线菌无细胞发酵滤液对齐整小核菌菌核形成的抑制作用效果图，其中：a显示齐整小核菌在对照组ck培养基上菌核形成数量；b为黄三素链霉菌无细胞发酵滤液稀释5倍时齐整小核菌菌核数量及对菌核形成的抑制作用效果图；c为黄三素链霉菌无细胞发酵滤液稀释25倍时的齐整小核菌菌核数量及对菌核形成的抑制作用效果图，d为黄三素链霉菌无细胞发酵滤液稀释50倍时齐整小核菌菌核数量及对菌核形成的抑制作用效果图；

图4为放线菌无细胞发酵滤液加入pda培养基对菌核萌发的影响效果图，其中，a为在对照组ck培养基上菌核萌发及菌丝生长状况图，b为加入黄三素链霉菌无细胞发酵滤液的pda培养基上对菌核萌发的抑制效果图；

图5为黄三素链霉菌无细胞发酵滤液对病原菌丝的酶溶致畸作用效果图，其中，a为对照组ck发酵滤液处理对病原菌丝的影响，b为黄三素链霉菌无细胞发酵液处理对病原菌丝的酶溶致畸作用效果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

本发明提供一种拮抗白绢病的黄三素链霉菌(streptomycesflavotricini)25，该菌分离自陕西省岚皋县魔芋白绢病株根区土壤，其菌落特征如图1所示。

对黄三素链霉菌(streptomycesflavotricini)25进行16srdna序列分析，其系统进化树如图2所示，其核苷酸序列如下：

ctgcagtgtctgggattgccattcttggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgcccttcactctgggacaagcccatggaaacggggtctaataccggatacgactgcggaaggcatcttctgcggtggaaagctccggcggtgaaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtggggtaatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcacgtcggatgtgaaagcccgaggcttaacctcgggtctgcattcgatacgggctagctagagtgtggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgggccattactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgttgggaactaggtgttggcgacattccacgtcgtcggtgccgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatataccggaaagcattagagatagtgccccccttgtggtcggtatacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcctgtgttgccagcatgcccttcggggtgatggggactcacaggagaccgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtcttgggctgcacacgtgctacaatggccggtacaatgagctgcgataccgtgaggtggagcgaatctcaaaaagccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgctcgtcacgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcccaacccttgtgagggagcggtcgaagctctactctgc

本实施例所用试验材料及其制备方法如下：

本实施例的供试病原菌为齐整小核菌(sclerotiumrolfsii)，分离自陕西省南郑县大田中被白绢病侵染的附子，由西北农林科技大学资源环境学院微生物资源研究室分离鉴定。

本实施例的黄三素链霉菌(streptomycesflavotricini)25为西北农林科技大学资源环境学院微生物资源研究室筛选鉴定保藏。

本实施例的土壤采自有白绢病发生的附子大田耕层，风干，粉碎过2mm筛，用于放线菌活菌制剂对土壤中菌核萌发抑制测定。

黄三素链霉菌制剂的制备：将黄三素链霉菌进行固态发酵制备孢子粉，所得菌剂的活菌数为3.3×10¹¹cfu/g，其有效成分为黄三素链霉菌25活菌孢以及黄三素链霉菌25的次级代谢产物。

齐整小核菌菌体粉的制备：用竹签分别挑取适量pda斜面活化好的齐整小核菌菌丝，接种到装有200ml察氏液体培养基的500ml摇瓶中，25℃，160r·min^-1摇床振荡培养5d。双层纱布过滤收集菌丝体，用去离子水多次冲洗至无残留培养液，40℃烘干，用研钵磨至细粉状，过0.25mm筛，即得。

靶标菌病原菌菌饼的制备：挑取在皿内培养3天的齐整小核菌(sclerotiumrolfsii)菌丝加入装有3ml无菌水及细石英砂的试管中，用无菌玻璃棒研磨制成菌丝片段悬液，吸取0.05ml于pda培养基上，用刮铲涂匀。28℃培养4天后，用无菌打孔器制成直径7mm圆形菌饼。

菌核的制备：挑取pda斜面上生长的齐整小核菌菌丝至pda平板上，28℃培养3周，将菌核从平板上刮下，用灭菌吸水纸吸干水分备用。

以淀粉为碳源的黄三素链霉菌无细胞发酵滤液的制备：向培养至长出孢子的放线菌黄三素链霉菌斜面加无菌水3ml，用灭菌竹签将孢子刮下，搅匀制成孢子悬液；用无菌吸管将孢子悬液全部转入已灭菌装有100ml高氏1号液体培养基的250ml三角瓶中，用4层棉布封口，重复3瓶，28℃、160r/min摇床培养8d后用滤纸过滤、0.22μm灭菌微孔滤膜过滤除菌，即可获得以淀粉为碳源的黄三素链霉菌无细胞发酵滤液。

以齐整小核菌菌体为碳源的黄三素链霉菌诱导酶液及其无细胞发酵滤液的制备：以齐整小核菌菌体粉代替高氏1号液体培养基中的淀粉，齐整小核菌菌体粉的用量为10g/l，121℃灭菌30min，黄三素链霉菌的接种方法同上。28℃、160r/min摇床培养5d时静置，用无菌吸管取20ml上清液用于供试放线菌产生的真菌细胞壁水解酶活性测定，剩余培养液继续培养至第8d，10000r/min离心5min，上清液用0.22μm灭菌微孔滤膜过滤除菌，即可获得以病原菌菌体为碳源的无细胞发酵滤液。上述高氏1号液体培养基中加入的齐整小核菌菌体粉用做黄三素链霉菌生长的碳源及合成真菌细胞壁水解酶的诱导物，加入该诱导物后获得的无细胞发酵滤液即为黄三素链霉菌产生的含有真菌细胞壁水解酶的粗酶液。

实施例1

黄三素链霉菌(streptomycesflavotricini)25对菌丝生长的抑制

(1)试验方法：

将黄三素链霉菌无细胞发酵滤液(原液，5、10倍的无菌水稀释液)与冷却至50℃左右的pda培养基按体积比1∶4混匀后倒平板，即得最终稀释为5、25及50倍的发酵滤液pda平板；用灭菌竹签挑取齐整小核菌(sclerotiumrolfsii)琼脂块于平板中央，菌面向上，每处理重复3次；以无菌水为对照。28℃培养，分别于24h、48h后用十字交叉法测量菌落直径，按下式计算无细胞发酵滤液对菌丝生长的抑菌率(inhibitionrateofmyceliagrowth，irmg)

式中：irmg为拮抗菌无细胞发酵滤液对菌丝生长的抑菌率，dck、dt分别为对照、处理菌落直径。

(2)试验结果：

由表1可知，以淀粉及齐整小核菌菌体作为碳源时，黄三素链霉菌可产生能抑制齐整小核菌菌丝生长的活性代谢产物。以淀粉为碳源时，黄三素链霉菌的无细胞发酵液在稀释5、25及50倍时，培养48h的抑菌率分别为52.8％、36.1％及25.0％，培养72h的抑菌率分别为46.1％、28.4％、17.6％，抑菌率呈现随稀释度增加、培养时间延长而逐渐降低的趋势；以齐整小核菌菌体做碳源时，黄三素链霉菌也能产生抑制齐整小核菌菌丝生长的活性物质，但相同时间及相同稀释度的黄三素链霉菌无细胞发酵液的抑菌率均略低于以淀粉为碳源时的黄三素链霉菌无细胞发酵滤液。

表1黄三素链霉菌无细胞发酵滤液对齐整小核菌菌丝生长的抑菌率(％)

实施例2

黄三素链霉菌(streptomycesflavotricini)25对菌核形成的抑制

(1)试验方法：

完成黄三素链霉菌对菌丝生长抑菌率的测定之后，将培养皿置于室温培养20d，将所产生的菌核刮下计数，对菌核形成的抑制率(inhibitionrateofsclectiaformation，irsf)按下式计算：

式中：irsf为菌核形成抑制率，nck、nt分别为对照、处理皿内形成的菌核数量。

(2)试验结果

由表2及图3可知，培养20天时，黄三素链霉菌不同稀释倍数发酵液对齐整小核菌菌核形成均有抑制作用(p＜0.01)。黄三素链霉菌的抑制效果良好，稀释5、25及50倍时，产生的菌核数分别为5个/皿、234个/皿及327个/皿，无细胞滤液中抗菌活性物质对菌核形成抑制率分别为99.5％、79.8％及71.8％。黄三素链霉菌发酵液抑制菌核形成的能力随稀释倍数升高而降低。

表2黄三素链霉菌无细胞发酵滤液对齐整小核菌菌核形成的抑制

注:同列数据后不同大写字母表示经lsd法检验不同处理之间差异极显著(p＜0.01)。

实施例3

黄三素链霉菌(streptomycesflavotricini)25对菌核萌发的抑制

(1)试验方法

(1.1)黄三素链霉菌无细胞发酵滤液直接加入培养基对菌核萌发的抑制率：

将黄三素链霉菌无细胞发酵滤液原液与冷却至50℃左右的pda培养基按体积比1∶4混匀后倒平板，待培养基凝固后，用接种针将菌核接种于pda平板上，每皿接种12颗菌核，置于黑暗环境中，28℃下培养，每隔24h观察1次萌发情况，按照下式计算黄三素链霉菌无细胞发酵滤液对菌核萌发的抑制率(inhibitionrateofsclerotiumgermination，irsg)

式中：irsg为发酵液对菌核萌发的抑制率，nck、nt分别为对照、处理皿内萌发菌核数量。

(1.2)黄三素链霉菌无细胞发酵滤液浸泡菌核对菌核萌发的抑制率：

将黄三素链霉菌无细胞发酵滤液原液稀释0、10、10²、10³倍，将菌核加入不同稀释度无细胞发酵滤液中浸泡24h，用接种针按12粒/皿将已浸泡菌核接种于pda平板上，置于黑暗环境中28℃下培养，每隔24h观察1次萌发情况，按下式计算无细胞发酵滤液浸泡对菌核萌发的抑制率(inhibitionrateofsclerotiumgermination，irsg)

式中：irsg为发酵液对菌核萌发的抑制率，nck、nt分别为对照、处理皿内萌发菌核数量。

48h后拍照，采用imageproplus6.0进行图像颜色分析，分别测定处理和对照的菌丝萌发面积像素值(hyphaareapixels，hap)。按下式计算无细胞发酵滤液对菌核萌发形成的新菌丝的抑制率(inhibitionrateofsub-mycelia，irsm)：

式中：irsm为发酵液浸泡后对萌发菌核产生的新菌丝生长的抑制率，hapck和hapt分别为对照和处理菌核萌发后的新菌丝面积像素值。

(1.3)黄三素链霉菌菌剂对土壤中菌核萌发的抑制：

参照rafik等的方法，将黄三素链霉菌活菌菌剂按0.5、1.0、5.0、10.0g/kg的用量加入附子种植田耕层风干土中，充分混匀，使黄三素链霉菌的孢子浓度达到1.7×10⁸、3.4×10⁸、1.7×10⁹、3.3×10⁹cfu/g土，然后按50g/皿用量将接种黄三素链霉菌活菌制剂的土壤分两次装入培养皿：先装土30g/皿，刮平后按25粒/皿均匀放置菌核，再按20g/皿在菌核上覆盖剩余土壤，加水20ml/皿后28℃培养14d，培养期间补水2次，10ml/次。培养结束后，将皿内土壤中的菌核全部挑出，自来水洗净菌核表面土壤后，用2％次氯酸钠表面消毒3min，无菌水洗3次，再将表面消毒后的菌核置于pda平板上，28℃培养3d后观察萌发率。以上处理每个浓度重复5皿。按下式计算黄三素链霉菌活菌制剂对土壤中菌核的萌发抑制率(inhibitionrateofstreptomycesisolatesonsclerotialgerminationinfieldsoil，irf)。

式中：irf为放线菌活菌制剂对土壤中菌核萌发的抑制率，nck、nt分别为对照、添加黄三素链霉菌活菌制剂处理皿中的菌核萌发数。

菌剂效应，即菌剂处理较对照组的增率⊿ck按下式计算

(2)试验结果

(2.1)黄三素链霉菌无细胞发酵滤液加入培养基中对齐整小核菌菌核萌发的抑制效果：

由表3可知，将菌核置于拮抗菌5倍稀释发酵液pda平板上培养24h时，黄三素链霉菌对齐整小核菌菌核萌发的抑制率达到100％。随着培养时间延长，黄三素链霉菌对菌核萌发抑制率未受到影响。如图4所示，在培养96h时，黄三素链霉菌发酵液对菌核萌发的抑制率仍为100％。根据后期观察，黄三素链霉菌处理的菌核已完全丧失萌发能力。

表3黄三素链霉菌无细胞发酵滤液加入培养基稀释5倍对齐整小核菌菌核萌发的影响

注:同列数据后不同大写字母表示经lsd法检验不同处理之间差异极显著(p＜0.01)。

(2.2)黄三素链霉菌无细胞发酵滤液浸泡菌核对菌核萌发的抑制效果：

由表4可知，黄三素链霉菌发酵液原液浸泡菌核对菌核萌发有一定抑制作用。培养24h、48h时，对菌核的抑制率分别为47.2％、2.8％，其余稀释倍数的发酵液处理菌核的萌发数与对照无显著差异，说明拮抗菌无细胞发酵滤液浸泡仅能延迟菌核萌发，不能使其彻底丧失萌发能力。尽管如此，发酵滤液浸泡对菌核萌发后产生的新菌丝生长仍有显著的抑制作用，黄三素链霉菌发酵滤液原液、10倍及10²倍稀释液对新菌丝生长的抑制率分别达到82.8％、72.6％及77.1％。

表4黄三素链霉菌发酵液浸泡处理对齐整小核菌菌核萌发及新菌丝生长的抑制率

注:同一稀释梯度同列数据后不同大写字母表示在同一时间不同菌株无细胞发酵滤液对齐整小核菌菌核萌发及生长抑制率经lsd法检验差异达到极显著(p＜0.01)。

(2.3)黄三素链霉菌活菌制剂对土壤中菌核活性的影响

由表5可知，添加黄三素链霉菌活菌制剂对土壤中菌核腐烂有促进作用，但残留菌核的萌发率仍较高，当菌剂用量高达10.0g/kg时，菌核的总萌发率降低至44％，显示出对菌核萌发的抑制作用(p＜0.01)，从源头减小了白绢病的危害。

表5黄三素链霉菌活菌制剂对大田土壤中菌核腐烂及萌发的影响

注:同列数据后不同大写字母表示经lsd法检验不同处理之间差异极显著(p＜0.01)。

实施例4

黄三素链霉菌(streptomycesflavotricini)25合成的真菌细胞壁水解酶活性及对齐整小核菌菌丝的酶溶致畸作用。

(1)试验方法

以齐整齐整小核菌菌体作为碳源时可诱导黄三素链霉菌产生真菌细胞壁水解酶，其无细胞发酵滤液为诱导酶粗酶液，以该粗酶液为材料，测定3种真菌细胞壁组分水解酶活性。

(1.1)几丁质酶活性测定：

几丁质胶体制备、几丁质酶活测定参照shanmugaiah等的方法，取1ml制备好的黄三素链霉菌诱导酶粗酶液，加1ml10g·l^-1的胶体几丁质，混匀后置于37℃恒温水浴中水解3h，沸水浴中煮5min终止反应，用去离子水定容至3ml，于4000r·min^-1离心5min，取1ml上清液用dns法测定水解液中n-乙酰氨基葡萄糖含量。

(1.2)β-1，3-葡聚糖酶活性测定：

参照noronha等的方法，取0.5ml1.2.2制备的酶粗酶液，加.0.5ml10g·l^-1的昆布多糖，混匀后置于45℃恒温水浴中水解30min。后续处理同几丁质酶，取1ml水解液用dns法测定水解液中葡萄糖含量。

(1.3)滤纸纤维素酶活性测定：

参照ghose等的方法，取0.5ml1.2.2制备的粗酶液，加1ml0.05mol·l^-1ph4.8的柠檬酸缓冲液，混匀后放入1×6cm新华滤纸条1条，置于50℃恒温水浴中水解60min。后续处理及葡萄糖测定同β-1，3-葡聚糖酶。

以上3种酶测定时均以高温灭活酶液为对照，每处理重复3次。酶活性定义：将37℃时1ml酶液在1min内水解几丁质产生1μgn-乙酰氨基葡萄糖的几丁质酶活性定义为1u；将45℃时1ml酶液在1min内水解昆布多糖产生1μg葡萄糖的β-1，3-葡聚糖酶活性定义为1u；将50℃时1ml酶液在1min内水解滤纸产生1μg葡萄糖的滤纸纤维素酶活性定义为1u。

(1.4)黄三素链霉菌合成的真菌细胞壁水解酶对齐整小核菌菌丝的酶溶致畸作用：

将洗净且已灭菌的盖玻片插入接有齐整小核菌的pda平皿，待菌丝铺满盖玻片后，将布满菌丝的盖玻片斜靠在直立的50ml灭菌离心管壁上，向离心管中加黄三素链霉菌无细胞发酵滤液至盖玻片高度约2/3处，37℃下保温48h后将盖玻片取出，将其中一面的菌丝擦干净后晾干，于光学显微镜下观察盖玻片浸没与未浸没部分菌丝差异，检查发酵滤液对菌丝有无溶解作用，并拍照。

(2)试验结果

(2.1)黄三素链霉菌合成的真菌细胞壁水解酶：

由表6可知，在以齐整小核菌菌体为碳源时，可诱导黄三素链霉菌合成能降解真菌细胞壁成分的水解酶，黄三素链霉菌可同时合成几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶及滤纸纤维素酶3种酶。

表6齐整小核菌菌体诱导黄三素链霉菌发酵液中3种胞外真菌细胞壁降解酶活性

(2.2)酶溶致畸作用：

图5为发酵液对病原菌丝的酶溶致畸作用。由图5可知，对照组ck为病原菌正常菌丝，粗细均匀，光滑透明；黄三素链霉菌发酵液处理过的菌丝，可见在发酵液作用下菌丝发生溶解。

综合以上实施例可知：①将黄三素链霉菌的粉状活菌制剂施入未灭菌土壤可显著促进土壤中齐整小核菌菌核腐烂，并显著降低未腐烂菌核的萌发活性。黄三素链霉菌菌剂不同用量时的腐烂菌核数为对照的1.5～4.5倍，并使残留菌核的萌发率较对照分别降低21.0％～42.0％。②以齐整小核菌菌体为碳源时，可诱导供黄三素链霉菌合成几丁质酶、葡聚糖酶及纤维素酶，可同时产生抗齐整小核菌的活性物质，这意味着黄三素链霉菌菌剂产生的真菌细胞壁水解酶能溶解齐整小核菌细胞壁，同时产生对病原菌菌丝的酶溶抗菌作用及活性物质拮抗作用。

虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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<110>陕西博秦生物工程有限公司西北农林科技大学

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