本发明属于生物医药领域，涉及一种抗酶解交联透明质酸钠凝胶及其制备方法和制剂。
背景技术：
：透明质酸(又名玻尿酸)是一种由葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基葡萄糖通过糖苷键连接而成的线性大分子多糖。在生理状态下，透明质酸通常以钠盐形式存在。透明质酸钠是细胞外基质的重要组成部分，具有调节免疫、屏障保护、调节渗透压、调控大分子物质的转运等多种作用。透明质酸钠可用于眼科手术辅助用药及骨关节炎的辅助治疗，并且在创伤修复、组织生成等方面具有重要的生理功能。用于提高交联透明质酸钠抗酶解性能的传统方法是通过增加交联剂浓度、提高交联时起始透明质酸钠浓度等方法来实现，但往往会导致交联透明质酸钠透明度降低、生物相容性差、推注性能差等缺点，不利于产品的临床应用。技术实现要素：针对现有技术中的交联透明质酸钠凝胶的抗酶解性能不佳以及用于提高交联凝胶抗酶解性能的方法会导致凝胶生物相容性差等问题，本发明旨在提供一种新型抗酶解交联透明质酸钠凝胶及其制备方法和制剂。本发明使用具有不同分子量的两种透明质酸钠作为原料，在碱性环境中进行交联，经有机溶剂沉淀、洗涤、干燥、溶胀后，得到抗酶解交联透明质酸钠凝胶。该交联透明质酸钠凝胶具有浓度可控、低交联剂残留、抗酶解性强等优点。整个制备方法便于操作，易于控制。具体而言，本发明采用如下技术方案：一种抗酶解交联透明质酸钠凝胶的制备方法，其包括下列步骤：1)采用碱液溶解透明质酸钠：将由高分子量透明质酸钠和低分子量透明质酸钠组成的混合物溶解于碱液中，得到透明质酸钠的碱性溶液；2)透明质酸钠的交联：在搅拌条件下，向步骤1)中得到的透明质酸钠的碱性溶液中加入交联剂，于25～55℃反应1～6小时，得到交联透明质酸钠的碱性溶液；3)交联透明质酸钠的沉淀、洗涤及干燥：使用酸将步骤2)中得到的交联透明质酸钠的碱性溶液的ph值调节至6.5～7.5，再加入沉淀用溶剂，直至不再析出沉淀为止，然后使用沉淀用溶剂将析出的沉淀洗涤5次以上，低温真空干燥，得到交联透明质酸钠粉末；4)交联透明质酸钠粉末的溶胀：在无菌条件下，将步骤3)中得到的交联透明质酸钠粉末加入到磷酸盐缓冲液(pbs缓冲液)中，充分溶胀后搅拌均匀，得到抗酶解交联透明质酸钠凝胶。在一项优选的技术方案中，以重量百分比计，步骤1)中所述混合物由10％～50％的所述高分子量透明质酸钠和50％～90％的所述低分子量透明质酸钠组成。在一项优选的技术方案中，步骤1)中所述高分子量透明质酸钠和所述低分子量透明质酸钠均通过细菌发酵法制得。在一项优选的技术方案中，步骤1)中所述高分子量透明质酸钠的分子量为1.0×106～4.0×106道尔顿，优选1.5×106～3.0×106道尔顿。在一项优选的技术方案中，步骤1)中所述低分子量透明质酸钠的分子量为1.0×105～1.0×106道尔顿，优选2.0×105～5.0×105道尔顿。在一项优选的技术方案中，步骤1)中所述碱液为氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。在一项优选的技术方案中，步骤1)中所述碱液的摩尔浓度为0.1～0.5摩尔/升，优选0.25摩尔/升。在一项优选的技术方案中，步骤1)中所述混合物与所述碱液的用量比为1～2克:10毫升，优选1克:10毫升。在一项优选的技术方案中，步骤2)中所述交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)或二乙烯基砜(dvs)。在一项优选的技术方案中，步骤2)中所述交联剂与步骤1)中所述混合物的重量比为1:5～100，优选1:10～50。在一项优选的技术方案中，步骤3)中所述酸为盐酸。在一项优选的技术方案中，步骤3)中所述沉淀用溶剂为醇或其水溶液，其中所述醇为甲醇、乙醇或异丙醇。在一项优选的技术方案中，步骤3)中所述低温真空干燥的温度为0～4℃。在一项优选的技术方案中，步骤4)中所述磷酸盐缓冲液包含以重量百分比计的下列成分：0.65％～0.9％的氯化钠(nacl)、0.05％～0.2％的磷酸氢二钠(na2hpo4)、0.005％～0.03％的磷酸二氢钠(nah2po4)和余量的纯化水，所述磷酸盐缓冲液的ph值为6.5～7.5。在一项优选的技术方案中，步骤4)中所述交联透明质酸钠粉末与所述磷酸盐缓冲液的用量比为15～30毫克:1毫升，优选20毫克:1毫升。一种抗酶解交联透明质酸钠凝胶，其通过上述制备方法而制得。一种抗酶解交联透明质酸钠凝胶制剂，其由上述抗酶解交联透明质酸钠凝胶通过分装和灭菌而制得。在一项优选的技术方案中，所述分装的具体过程如下：在无菌条件下，使用全自动真空加塞灌装机将所述交联透明质酸钠凝胶分装入预灌装注射器中，并真空加塞。在一项优选的技术方案中，所述灭菌为高压蒸汽灭菌，温度为110～130℃，时间为10～15分钟。与现有技术相比，采用上述技术方案的本发明具有如下优点：(1)本发明采用高、低分子量透明质酸钠互相交联的方式获得的交联透明质酸钠凝胶，与现有的交联凝胶制备工艺相比，减少了工艺步骤，节省了生产成本；(2)本发明的交联透明质酸钠凝胶具有稳定的三维网络结构，与通过两相凝胶制备方法获得的产品相比，抗热解性能、抗酶降解性和推注流畅性得到明显提高；(3)本发明利用有机溶剂乙醇或异丙醇进行沉淀并结合低温真空干燥的方法得到交联透明质酸钠干粉，使得配制任意浓度的凝胶得以实现，与两相凝胶制备方法中采取的透析工艺相比，具有操作方便、浓度可控的优点。附图说明图1为实施例1至5中的交联透明质酸钠凝胶在灭菌前后的弹性模量对比图。图2为实施例1至5中的交联透明质酸钠凝胶与市售产品的抗酶解性能对比图。图3为不同的漂洗次数对交联透明质酸钠凝胶中交联剂残留的影响效果图。具体实施方式以下将结合附图和具体实施例对本发明做出进一步的描述。除非另有说明，下列实施例中所使用的仪器、试剂、材料等均可通过常规商业手段获得。实施例1：抗酶解交联透明质酸钠凝胶及凝胶制剂的制备。称取由细菌发酵法制得的高分子量透明质酸钠(0.2g，3.0×106da)和低分子量透明质酸钠(1.8g，4.0×105da)，混合后溶解于0.25m氢氧化钠水溶液(20ml)中，得到透明质酸钠的碱性溶液。在机械搅拌条件下，向上述透明质酸钠的碱性溶液中加入bdde(0.2g)，于40℃水浴中反应3h，得到交联透明质酸钠的碱性溶液。向上述交联透明质酸钠的碱性溶液中加入0.1m盐酸并调节至ph＝7.0，缓慢加入95％乙醇至白色沉淀完全析出。用95％乙醇将析出的沉淀漂洗5次，于4℃真空干燥，得到交联透明质酸钠粉末1.84g。按照20mg:1ml的用量比，将上述干燥后的粉末加入到pbs缓冲液(包含以重量百分比计的下列成分：0.65％～0.9％的nacl、0.05％～0.2％的na2hpo4、0.005％～0.03％的nah2po4和余量的纯化水)中，充分溶胀后搅拌均匀，得到抗酶解交联透明质酸钠凝胶。在无菌条件下，使用全自动真空加塞灌装机将上述单相交联透明质酸钠凝胶分装入预灌装注射器中，并真空加塞，然后于121℃高压蒸汽灭菌15min，得到抗酶解交联透明质酸钠凝胶制剂。实施例2：抗酶解交联透明质酸钠凝胶及凝胶制剂的制备。称取由细菌发酵法制得的高分子量透明质酸钠(1.0g，3.0×106da)和低分子量透明质酸钠(1.0g，4.0×105da)，混合后溶解于0.25m氢氧化钠水溶液(20ml)中，得到透明质酸钠的碱性溶液。在机械搅拌条件下，向上述透明质酸钠的碱性溶液中加入bdde(0.04g)，于40℃水浴中反应3h，得到交联透明质酸钠的碱性溶液。向上述交联透明质酸钠的碱性溶液中加入0.1m盐酸并调节至ph＝6.5，缓慢加入95％乙醇至白色沉淀完全析出。用95％乙醇将析出的沉淀漂洗5次，于4℃真空干燥，得到交联透明质酸钠粉末1.82g。按照20mg:1ml的用量比，将上述干燥后的粉末加入到pbs缓冲液(包含以重量百分比计的下列成分：0.65％～0.9％的nacl、0.05％～0.2％的na2hpo4、0.005％～0.03％的nah2po4和余量的纯化水)中，充分溶胀后搅拌均匀，得到抗酶解交联透明质酸钠凝胶。在无菌条件下，使用全自动真空加塞灌装机将上述单相交联透明质酸钠凝胶分装入预灌装注射器中，并真空加塞，然后于121℃高压蒸汽灭菌15min，得到抗酶解交联透明质酸钠凝胶制剂。实施例3：抗酶解交联透明质酸钠凝胶及凝胶制剂的制备。称取由细菌发酵法制得的高分子量透明质酸钠(0.5g，3.0×106da)和低分子量透明质酸钠(1.5g，4.0×105da)，混合后溶解于0.25m氢氧化钠水溶液(20ml)中，得到透明质酸钠的碱性溶液。在机械搅拌条件下，向上述透明质酸钠的碱性溶液中加入bdde(0.1g)，于50℃水浴中反应2h，得到交联透明质酸钠的碱性溶液。向上述交联透明质酸钠的碱性溶液中加入0.1m盐酸并调节至ph＝7.5，缓慢加入异丙醇至白色沉淀完全析出。用异丙醇将析出的沉淀漂洗5次，于4℃真空干燥，得到交联透明质酸钠粉末1.83g。按照20mg:1ml的用量比，将上述干燥后的粉末加入到pbs缓冲液(包含以重量百分比计的下列成分：0.65％～0.9％的nacl、0.05％～0.2％的na2hpo4、0.005％～0.03％的nah2po4和余量的纯化水)中，充分溶胀后搅拌均匀，得到抗酶解交联透明质酸钠凝胶。在无菌条件下，使用全自动真空加塞灌装机将上述单相交联透明质酸钠凝胶分装入预灌装注射器中，并真空加塞，然后于121℃高压蒸汽灭菌15min，得到抗酶解交联透明质酸钠凝胶制剂。实施例4：抗酶解交联透明质酸钠凝胶及凝胶制剂的制备。称取由细菌发酵法制得的高分子量透明质酸钠(1.0g，1.5×106da)和低分子量透明质酸钠(1.0g，4.0×105da)，混合后溶解于0.25m氢氧化钾水溶液(20ml)中，得到透明质酸钠的碱性溶液。在机械搅拌条件下，向上述透明质酸钠的碱性溶液中加入dvs(0.2g)，于50℃水浴中反应2h，得到交联透明质酸钠的碱性溶液。向上述交联透明质酸钠的碱性溶液中加入0.1m盐酸并调节至ph＝7.0，缓慢加入异丙醇至白色沉淀完全析出。用异丙醇将析出的沉淀漂洗5次，于4℃真空干燥，得到交联透明质酸钠粉末1.86g。按照20mg:1ml的用量比，将上述干燥后的粉末加入到pbs缓冲液(包含以重量百分比计的下列成分：0.65％～0.9％的nacl、0.05％～0.2％的na2hpo4、0.005％～0.03％的nah2po4和余量的纯化水)中，充分溶胀后搅拌均匀，得到抗酶解交联透明质酸钠凝胶。在无菌条件下，使用全自动真空加塞灌装机将上述单相交联透明质酸钠凝胶分装入预灌装注射器中，并真空加塞，然后于121℃高压蒸汽灭菌15min，得到抗酶解交联透明质酸钠凝胶制剂。实施例5：抗酶解交联透明质酸钠凝胶的制备。称取由细菌发酵法制得的高分子量透明质酸钠(0.2g，1.5×106da)和低分子量透明质酸钠(1.8g，3.0×105da)，混合后溶解于0.25m氢氧化钾水溶液(20ml)中，得到透明质酸钠的碱性溶液。在机械搅拌条件下，向上述透明质酸钠的碱性溶液中加入dvs(0.1g)，于50℃水浴中反应2h，得到交联透明质酸钠的碱性溶液。向上述交联透明质酸钠的碱性溶液中加入0.1m盐酸并调节至ph＝7.0，缓慢加入95％乙醇至白色沉淀完全析出。用95％乙醇将析出的沉淀漂洗5次，于4℃真空干燥，得到交联透明质酸钠粉末1.85g。按照20mg:1ml的用量比，将上述干燥后的粉末加入到pbs缓冲液(包含以重量百分比计的下列成分：0.65％～0.9％的nacl、0.05％～0.2％的na2hpo4、0.005％～0.03％的nah2po4和余量的纯化水)中，充分溶胀后搅拌均匀，得到抗酶解交联透明质酸钠凝胶。在无菌条件下，使用全自动真空加塞灌装机将上述单相交联透明质酸钠凝胶分装入预灌装注射器中，并真空加塞，然后于121℃高压蒸汽灭菌15min，得到抗酶解交联透明质酸钠凝胶制剂。实施例6：抗酶解交联透明质酸钠凝胶的弹性模量测定试验。分别取实施例1至5中制得的抗酶解交联透明质酸钠凝胶，使用taar2000ex流变仪，打开气阀至30bar，设定温度为25℃，频率为0.25hz，检测灭菌前后的弹性模量，其结果如图1所示。由图1可知，灭菌后实施例1至5中样品的弹性模量仅比灭菌前略有下降，基本上保持稳定，说明样品的结构具有较高的抗热解性能。实施例7：抗酶解交联透明质酸钠凝胶的抗酶解性能测定试验。分别取实施例1至5中制得的交联透明质酸钠凝胶4mg，按照10u/mg的比例加入透明质酸酶溶液，37℃水浴48h，100℃加热30min，然后离心取上清，按照咔唑显色法检测530nm处的光吸收值，并计算抗酶解率。同时，取市售产品restylane作为对照品，同法处理后检测，其结果如图2所示。由图2可知，实施例1至5中样品的糖醛酸释放率均明显低于已上市产品restylane，说明样品具有较高的抗酶解性能。实施例8：抗酶解交联透明质酸钠凝胶中的交联剂残留测定试验。以实施例1中加入95％乙醇后析出的白色沉淀作为检测样品，考察不同洗涤次数后凝胶中的交联剂(bdde)残留，其结果如图3所示。由图3可知，经过5次漂洗以后，凝胶中的交联剂残留已经低于2ppm，符合凝胶产品的相关要求。实施例9：抗酶解交联透明质酸钠凝胶的推注力测定试验。以实施例1至5中制得的交联透明质酸钠凝胶作为检测样品，使用万能材料试验机以30mm/min的推动速度，271/2g的针头检测产品的推注力，其结果如表1所示。表1凝胶产品的推注力测定结果实施例编号推注力(n)116215317416514由表1中的结果可知，实施例1至5中样品的推注力均小于20n，说明临床使用时具有较好的手感，易于操作。当前第1页12