本发明涉及食品安全领域，具体而言涉及一种用于吸附贝类毒素的壳聚糖微球的制备方法。
背景技术：
贝类毒素属海洋天然有机物，它的形成与海洋中有毒藻类赤潮密切相关。有害赤潮已经成为世界性的问题，其发生的范围仍在不断扩大，能形成赤潮的有害藻类种类也在不断增加。据文献报道，能形成赤潮的微藻约有184267种，其中有毒微藻约为60～78种。有毒藻类产生的毒素往往通过食物链进入贝类体内，因而通常称这些毒素为贝毒，人们食用带有贝毒的贝类而造成食物中毒。我国四大海域中贝类毒素污染状况非常严重。调查发现，各大海域均存在广泛的贝类毒素污染情况，南北沿海均普遍存在。浙江省、中国台湾及广东省大亚湾均发生因食用染毒贝类而引起的多人中毒或死亡事件。
另一方面，贝毒污染的严重性和地域的广泛性已严重影响到相关水产品的出口贸易。由于出口到欧盟的贝类多次被检出含有麻痹性贝类毒素，而我方未能提供官方贝类卫生监控计划。因此，欧盟从1997年7月1日起禁止我国贝类海产品进入欧盟市场。为尽快恢复对欧盟的贝类出口，参照国外情况，我国有关部门于1997年l1月建立了贝类生产环境卫生监督管理的相关规定，对供出口贝类加工厂做原料的或直接上市的活贝类提出了卫生标准。但由于各国毒素分布状况有一定差异，我国沿海贝类毒素分布情况并不十分清楚，因此卫生标准难以反映毒素实际存在情况；再加上没有建立相应的监督管理机构和完善的贝类监测、检测手段及标准毒素。所以贝类水产品的质量改观不大。在2000-86-ec决议中，贝类仍被列为“不满意”和需进一步努力的产品行列。
贝类毒素是由海洋中的有毒藻类通过食物链传递给藻食性的贝类，并在其体内蓄积、放大、转化形成的有毒高分子化合物，食用含有贝类毒素的贝类可能导致食源性疾病，根据中毒症状及机制的不同，贝类毒素主要分为4类：即腹泻性贝类毒素，麻痹性贝类毒素，遗忘性贝类毒素、及神经性贝类毒素。据统计，全球由藻毒素引起的中毒事件中，87％是由麻痹性贝类毒素引起的，而第二位的腹泻性贝类毒素也占5％的比例，我国海洋赤潮毒素中最常见的也是麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素。国际上普遍接受的麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素的最大限量分别为80ug/100g贝肉以及20ug/100g贝肉。
壳聚糖是由自然界广泛存在的甲壳素在碱性条件下水解并脱去部分乙酰基后生成的衍生物，来源丰富，无毒。自1859年，法国人rouget首先得到壳聚糖后，这种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展。
天然状态的壳聚糖大部分为粉末状，作为吸附载体，使载体和吸附物都难以回收，从而限制其应用。在特定的条件下，壳聚糖能发生水解、烷基化、酰基化、羧甲基化、磺化、硝化、卤化、氧化、还原、缩合和络合等化学反应，可生成各种具有不同性能的壳聚糖衍生物，从而扩大了壳聚糖的应用范围。
壳聚糖在蛋白相互作用、抗原抗体反应、相关疾病的诊断等方面都会应用到，具体为把蛋白固定到微球上，然后进行相关分析或者检测。目前，市场上多采用环氧或-cn基团作为活化基团。因为不同活化方式的用途不一样，所以，开发多种不同的活化方式才能满足科研的实际需求。
因此为了解决生物毒素对于食品卫生行业的危害，需要一种吸附效率高，吸附效果好的一种用于吸附贝类毒素的壳聚糖微球的制备方法。
技术实现要素：
为了解决上述问题，提供一种用于吸附贝类毒素的壳聚糖微球的制备方法，本发采用以下技术方案：
一种用于吸附贝类毒素的壳聚糖微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先逐渐将120~160重量份乙酸溶液加入3~4重量份壳聚糖中，使得将壳聚糖溶解在乙酸溶液中，然后低温冷藏18~20小时，然后将壳聚糖吸入注射器中，随后将注射器中的壳聚糖逐滴加入到凝结液中，带壳聚糖凝结为球体后用去离子水反复洗涤至于中性，然后进行干燥。
在本发明中使用了乙酸作为壳聚糖的溶解剂，由于聚糖的糖苷键是半缩醛结构,而这种半缩醛结构对酸是不稳定的，壳聚糖的酸性溶液在放置过程中会发生酸催化的水解反应,采用乙酸防止酸性过强导致壳聚糖降解，而乙酸的弱酸性则可以提高壳聚糖的分散能力，有助于壳聚糖微球的制备。而采用了低温冷藏的方式可以降低壳聚糖的降解程度，提高壳聚糖微球的作用效果。
作为优选，所述的凝结液采用以下方法制备：在40~50重量份的氢氧化钠中加入2~3重量份的乙酸乙酯，均匀搅拌。
本发明采用乙酸乙酯和氢氧化钠作为凝结剂可以形成ph值较高的溶液，有助于提高壳聚糖成球的效率，同时采用该种比例的氢氧化钠和乙酸乙酯混合，由于乙酸乙酯为小分子量的化合物，在氢氧化钠中可以降低，采用该种比例的混合液可以提高壳聚糖微球表面的致密程度，有利于提高壳聚糖微球对于贝类毒素的吸附能力。
作为优选，所述的凝结液采用以下方法制备：将30~40重量份氢氧化钠溶液和20~30重量份的质量分数为5%的碳酸钠溶液混合，再加入2~3重量份的乙酸乙酯，均匀搅拌。
本发明加入了碳酸钠溶液，碳酸钠分子会吸附在壳聚糖微球上，有助于壳聚糖微球降解贝类毒素。
作为优选，所述的壳聚糖的粘均分子量为480~500kda。
本发明采用粘均分子量较大的壳聚糖，因为分子量越大壳聚糖分子变长，此时壳聚糖在成球的时候微球中的壳聚糖之间的结合更加紧密，从而增强了壳聚糖微球的表面致密性，有利于壳聚糖微球对贝类毒素进行吸附和固定。
作为优选，所述的壳聚糖经过以下方法制备：
（1）将5~6重量份的虾壳放于1300~1400重量份的盐酸中浸泡3~4小时，随后将虾壳取出后放入同浓度的1300~1400重量份的盐酸中继续浸泡8~9h，然后取出后在500~550重量份氢氧化钠溶液中煮沸40~100min，将固体取出后再日光下晒干漂白，得到甲壳素；
（2）然后将甲壳素浸没于质量分数为40~45%的氢氧化钠中，在100~110℃下保温1~1.5h。
在本发明中采用此种方法对壳聚糖进行制备，首先采用了虾壳作为原料，降低了壳聚糖的制备成本，而且在重复利用废弃原料的同时降低了对于环境的污染，而且本发明通过先酸浸泡再进行碱煮的方法可以降低所得到的甲壳素的灰分，从而提高得到的壳多糖微球的表面致密性从而壳聚糖微球的处理能力，而且后面采用了较高浓度的氢氧化钠和较高的处理温度可以得到脱乙酞度更高的壳多糖，从而提高壳多糖的吸附能力。本发明还采用了分步浸酸和碱煮的方法，有助于减少壳多糖中的杂质组分，提高壳聚糖份吸附能力。
作为优选，所述的盐酸浓度为0.5~1mol/l，所述的氢氧化钠溶液的质量分数为3~4%。
作为优选，对步骤（1）得到的晒干后的甲壳素继续进行精制，所述的精制步骤如下：将甲壳素浸泡于300~400重量份的浓度为0.5~1mol/l盐酸中浸泡3~4小时，然后在300~400重量份的质量分数为3~4%氢氧化钠溶液中煮沸1~1.5h，得到精制甲壳素，使用所述的精制甲壳素继续进行步骤（2）的操作。
在本发明中对得到的甲壳素进行进一步精制，可以进一步降低甲壳素的灰质，提高壳聚糖的吸附能力。
作为优选，所述的干燥采用真空冷冻干燥的方法。
采用了真空冷冻干燥的方法可以防止壳多糖微球在干燥时发生结构损坏影响使用效果的问题。
作为优选，所述的低温冷藏的温度为3~4℃。
采用3~4℃的温度可以在保证壳多糖充分溶解的条件下降低了壳多糖份降解程度，增强了壳多糖微球的处理能力。
本发明的有益效果在于：本发明具有吸附效率高，吸附效果好，制备简单，成本低的优点。
具体实施方式
下面结合具体实施案例对本发明作进一步解释：
实施例1
一种用于吸附贝类毒素的壳聚糖微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先逐渐将120重量份乙酸溶液加入3重量份壳聚糖中，使得将壳聚糖溶解在乙酸溶液中，然后低温冷藏18小时，低温冷藏的温度为3℃，然后将壳聚糖吸入注射器中，随后将注射器中的壳聚糖逐滴加入到凝结液中，带壳聚糖凝结为球体后用去离子水反复洗涤至于中性，然后进行真空冷冻干燥，其中壳聚糖的粘均分子量为480kda。
其中，所述的凝结液采用以下方法制备：将30重量份氢氧化钠溶液和20重量份的质量分数为5%的碳酸钠溶液混合，再加入2重量份的乙酸乙酯，均匀搅拌。
其中，所述的壳聚糖经过以下方法制备：
（1）将5重量份的虾壳放于1300重量份的盐酸中浸泡3小时，随后将虾壳取出后放入同浓度的1300重量份的1mol/l盐酸中继续浸泡8h，然后取出后在550重量份质量分数为3%氢氧化钠溶液中煮沸40min，将固体取出后再日光下晒干漂白，得到甲壳素，然后将甲壳素浸泡于400重量份的浓度为1mol/l盐酸中浸泡4小时，然后在300重量份的质量分数为3%氢氧化钠溶液中煮沸1h，得到精制甲壳素；
（2）然后将甲壳素浸没于质量分数为40%的氢氧化钠中，在110℃下保温1h。
实施例2
一种用于吸附贝类毒素的壳聚糖微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先逐渐将120重量份乙酸溶液加入3重量份壳聚糖中，使得将壳聚糖溶解在乙酸溶液中，然后低温冷藏18小时，低温冷藏的温度为3℃，然后将壳聚糖吸入注射器中，随后将注射器中的壳聚糖逐滴加入到凝结液中，带壳聚糖凝结为球体后用去离子水反复洗涤至于中性，然后进行真空冷冻干燥，其中壳聚糖的粘均分子量为480kda。
其中，所述的凝结液采用以下方法制备：将40重量份的氢氧化钠加入2重量份的乙酸乙酯，均匀搅拌。
其中，所述的壳聚糖经过以下方法制备：
（1）将5重量份的虾壳放于1300重量份的盐酸中浸泡3小时，随后将虾壳取出后放入同浓度的1300重量份的1mol/l盐酸中继续浸泡8h，然后取出后在500重量份质量分数为3%氢氧化钠溶液中煮沸40min，将固体取出后再日光下晒干漂白，得到甲壳素，然后将甲壳素浸泡于300重量份的浓度为1mol/l盐酸中浸泡3小时，然后在300重量份的质量分数为3%氢氧化钠溶液中煮沸1h，得到精制甲壳素；
（2）然后将精制甲壳素浸没于质量分数为40%的氢氧化钠中，在110℃下保温1h。
实施例3
一种用于吸附贝类毒素的壳聚糖微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先逐渐将140重量份乙酸溶液加入4重量份壳聚糖中，使得将壳聚糖溶解在乙酸溶液中，然后低温冷藏19小时，低温冷藏的温度为4℃，然后将壳聚糖吸入注射器中，随后将注射器中的壳聚糖逐滴加入到凝结液中，带壳聚糖凝结为球体后用去离子水反复洗涤至于中性，然后进行真空冷冻干燥，其中壳聚糖的粘均分子量为480kda。
其中，所述的凝结液采用以下方法制备：将35重量份氢氧化钠溶液和25重量份的质量分数为5%的碳酸钠溶液混合，再加入2重量份的乙酸乙酯，均匀搅拌。
其中，所述的壳聚糖经过以下方法制备：
（1）将6重量份的虾壳放于1400重量份的盐酸中浸泡4小时，随后将虾壳取出后放入同浓度的1300重量份的1mol/l盐酸中继续浸泡8h，然后取出后在500重量份质量分数为3%氢氧化钠溶液中煮沸60min，将固体取出后再日光下晒干漂白，得到甲壳素，然后将甲壳素浸泡于350重量份的浓度为1mol/l盐酸中浸泡3小时，然后在350重量份的质量分数为4%氢氧化钠溶液中煮沸1h，得到精制甲壳素；
（2）然后将甲壳素浸没于质量分数为45%的氢氧化钠中，在110℃下保温1h。
实施例4
一种用于吸附贝类毒素的壳聚糖微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先逐渐将160重量份乙酸溶液加入3重量份壳聚糖中，使得将壳聚糖溶解在乙酸溶液中，然后低温冷藏20小时，低温冷藏的温度为4℃，然后将壳聚糖吸入注射器中，随后将注射器中的壳聚糖逐滴加入到凝结液中，带壳聚糖凝结为球体后用去离子水反复洗涤至于中性，然后进行真空冷冻干燥，其中壳聚糖的粘均分子量为500kda。
其中，所述的凝结液采用以下方法制备：将40重量份氢氧化钠溶液和30重量份的质量分数为5%的碳酸钠溶液混合，再加入3重量份的乙酸乙酯，均匀搅拌。
其中，所述的壳聚糖经过以下方法制备：
（1）将6重量份的虾壳放于1400重量份的盐酸中浸泡3小时，随后将虾壳取出后放入同浓度的1400重量份的1mol/l盐酸中继续浸泡9h，然后取出后在550重量份质量分数为4%氢氧化钠溶液中煮沸100min，将固体取出后再日光下晒干漂白，得到甲壳素，然后将甲壳素浸泡于400重量份的浓度为1mol/l盐酸中浸泡4小时，然后在400重量份的质量分数为4%氢氧化钠溶液中煮沸1.5h，得到精制甲壳素；
（2）然后将甲壳素浸没于质量分数为45%的氢氧化钠中，在110℃下保温1.5h。
实施例5
一种用于吸附贝类毒素的壳聚糖微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先逐渐将150重量份乙酸溶液加入4重量份壳聚糖中，使得将壳聚糖溶解在乙酸溶液中，然后低温冷藏18小时，低温冷藏的温度为3℃，然后将壳聚糖吸入注射器中，随后将注射器中的壳聚糖逐滴加入到凝结液中，带壳聚糖凝结为球体后用去离子水反复洗涤至于中性，然后进行真空冷冻干燥，其中壳聚糖的粘均分子量为500kda。
其中，所述的凝结液采用以下方法制备：将30重量份氢氧化钠溶液和20重量份的质量分数为5%的碳酸钠溶液混合，再加入2重量份的乙酸乙酯，均匀搅拌。
其中，所述的壳聚糖经过以下方法制备：
（1）将5重量份的虾壳放于1300重量份的盐酸中浸泡3小时，随后将虾壳取出后放入同浓度的1300重量份的1mol/l盐酸中继续浸泡8h，然后取出后在550重量份质量分数为3%氢氧化钠溶液中煮沸100min，将固体取出后再日光下晒干漂白，得到甲壳素，然后将甲壳素浸泡于360重量份的浓度为1mol/l盐酸中浸泡3小时，然后在370重量份的质量分数为4%氢氧化钠溶液中煮沸1h，得到精制甲壳素，使用所述的精制甲壳素继续进行步骤（2）的操作
（2）然后将甲壳素浸没于质量分数为45%的氢氧化钠中，在105℃下保温1h。
下面对本发明优选实施例3进行检测：
首先制备贝类毒素：取毒藻培养液400ml于离心机中在6000r/min下离心10min，去除离心管中的上清液后收集沉淀加入0.01mol/l的乙酸溶液中继续重新悬浮，在冰水浴中超声破碎，采用工作功力为600w，采取3s，停止3s的间隔，西区上清液真空冷冻干燥。
然后将0.2g壳聚糖微球与浓度为58mgstx/l的psp30ml于50ml的三角瓶中调节ph为7，温度为15℃，吸附时间为120min，最终检测得到贝类毒素的的吸收率达到了90%以上，具有良好的吸附效果。