本发明属于生物技术领域，具体涉及一种apmv-4型病毒的检测方法。
背景技术：
禽副黏病毒(apmvs)属于副黏病毒科腮腺炎病毒属（禽流感病毒除外），常常能从世界各地的家禽及野生鸟类中分离得到。目前，腮腺炎病毒属的apmvs分为9个血清型(apmv1~9)。新城疫病毒是禽副黏病毒1型的代表，也是各禽副黏病毒类型中特点和研究最为透彻的。而对禽副黏病毒2~9(apmv2~9)的分子特性和致病性知之甚少，对于apmv-4的研究现在已获悉apmv-4只能从水禽中分离到，可导致病禽的肺炎、支气管炎等呼吸道症状。apmv-4的基因组全长是15054个核苷酸，并与副黏病毒“六规则”一致。基因组包含6个非重叠的基因，囊膜蛋白为np（核蛋白）、p（磷酸化蛋白）和l（rna依赖性聚合酶）；外部蛋白为m膜蛋白、f（融合蛋白）和hn（血凝素-神经氨酸酶蛋白）。目前针对apmv-4型病毒的相关研究非常少，关于本病的诊断研究则更少。文献《禽副黏病毒4型荧光rt-pcr检测方法的建立》提供了一种荧光rt-pcr检测方法，该方法成本高，需要昂贵的仪器设备，不适合普通基层实验室进行应用。中国专利cn101892321a公开了一种检测禽副黏病毒1型的方法，该方法仅仅是针对禽副黏病毒1型的np蛋白的高度保守区设计了引物。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种apmv-4型病毒的检测方法。
本发明所采用的具体技术方案为：
本发明提供了一种apmv-4型病毒的检测方法，该方法所采用的引物为：
apmv4-f：5'-tcacaaggactcgaggcaac-3'；
apmv4-r：5'-tcaatttcgaggtcggcaca-3'。
进一步的，所述检测方法具体包括以下步骤：
（1）取200μl的病毒尿囊液，进行样品rna的提取，然后用25μldepc水来溶解rna，得待测产品；
（2）将上述待测产品进行一步法rt-pcr反应；
（3）对dna扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检验。
进一步的，所述rt-pcr反应条件：反转录反应第一步42min20℃，第二步94℃3min，第三步pcr扩增94℃20s、52℃20s、72℃30s进行33个循环，第四步72℃延伸4min。
本发明的有益效果为：本发明建立了可用于检测apmv-4的一步法rt-pcr方法，该方法能克隆微量mrna而不需构建cdna文库，即cdna合成与pcr反应在同一buffe及酶中进行，减少了反应时间。特异性试验表明本方法特异性强，与新城疫病毒(ndv)无交叉反应。灵敏度高，本发明的检测最小量可为102eid50。因此，本发明所建立的一步法的rt-pcr技术具有快速、准确、灵敏等优点，可用于apmv-4样品的检测，非常适合基层实验室的应用；本发明特异性的针对apmv-4型病毒，可区分检测apmv-1型和apmv-4型的病毒。
附图说明
图1为一步法rt-pcr检测结果
m.markerdl20001-3.apmv-4的扩增结果4.ndv的扩增结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1
1、参照genbank中apmv-4的f基因序列，设计一对引物（apmv4-f、apmv4-r），用于扩增f基因部分片段。引物由华大基因公司合成，pageplus级纯化。
apmv4-f：5'-tcacaaggactcgaggcaac-3'
apmv4-r：5'-tcaatttcgaggtcggcaca-3'，预计扩增798bp。
2、rt-pcr
2.1rna提取
选取鸭apmv-4分离毒株qy17进行检测。病毒rna的提取按照博日生物simplernakit操作进行，最后用25μldepc水来溶解rna。
2.2一步法rt-pcr
rt-pcr按照takara公司的一步法rt-pcr的操作说明进行：2×pcrbuffer（含dntp）25μl、混合酶（rtase、hstaq、rnaseinhibitor）2μl、rna模板10μl、rnase-freeh2o补充至50μl。rt-pcr反应条件：反转录反应第一步42min20℃，第二步94℃3min，第三步pcr扩增94℃20s、52℃20s、72℃30s进行33个循环，第四步72℃延伸4min。取5µl反应产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检验。以dl2000的marker作为参考，tae缓冲液为电泳缓冲液，电泳（5v/cm）电泳30min，凝胶成像系统观察结果。
rt-pcr扩增：apmv-4分离毒株pcr扩增得到预期大小的扩增片段，约0.8kb。对照组ndv（即apmv-1病毒）在此处未出现扩增条带。(见图1)
敏感性试验:将分离毒株原液进行10倍的倍比稀释，随后同样进行rt-pcr操作。扩增结果显示本方法的检测最小量可为102eid50，说明建立的检测方法灵敏性较好。
对比例1
1.1采用引物（cn101892321a提供的引物）进行检测，
1.2.rna提取
选取鸭apmv-4分离毒株qy17和apmv-1病毒进行检测。病毒rna的提取按照博日生物simplernakit操作进行，最后用25μldepc水来溶解rna；
1.3一步法rt-pcr
rt-pcr按照takara公司的一步法rt-pcr的操作说明进行：2×pcrbuffer（含dntp）25μl、混合酶（rtase、hstaq、rnaseinhibitor）2μl、rna模板10μl、rnase-freeh2o补充至50μl。rt-pcr反应条件：反转录反应第一步42min20℃，第二步94℃3min，第三步pcr扩增94℃20s、52℃20s、72℃30s进行33个循环，第四步72℃延伸4min。取5µl反应产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检验。以dl2000的marker作为参考，tae缓冲液为电泳缓冲液，电泳（5v/cm）电泳30min，凝胶成像系统观察结果。apmv-4分离毒株qy17和apmv-1病毒都得到了387bp的片段。
结论：无法区分apmv-4及apmv-1病毒。
临床应用
选取14份动物攻毒试验后的组织样品进行上述one-steprt-pcr方法的检测。结果检测出了11株阳性样品，经序列比对证实为apmv-4病毒。以上检测结果与鸡胚接种分离病毒的检测结果一致，由此说明本方法的特异性高，而且检测周期只需几小时，而鸡胚接种检测则需数天完成。
核苷酸序列表
<110>山东省农业科学院家禽研究所
<120>一种apmv-4型病毒的检测方法
<160>2
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>1
tcacaaggactcgaggcaac20
<210>2
<211>25
<212>dna
<213>人工合成
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<400>2
tcaatttcgaggtcggcaca20