用于山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光定量PCR检测引物的制作方法

本发明涉及一种用于山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光定量pcr检测引物，属于分子生物学领域。

背景技术：

山羊支原体山羊肺炎亚种(mycoplasmacapricolumsubsp.capripenumoniae,mccp)是丝状支原体簇的成员之一，是引起山羊传染性胸膜肺炎(contagiouscapripleuropneumonia,ccpp)的病原。被感染羊群无年龄和性别差异，发病率和死亡率都较高(储岳峰,2009;赵萍,2010)，该病的发病率达100%(nichlasetal.,2012;chuetal.,2011)，死亡率高达60-70%（郑莹莹,2014）。该病潜伏期为2-28d，平均10d，其临床特征主要表现为纤维素性胸膜肺炎。ccpp最早可追溯到1873年的阿尔及利亚，1976年由macowan和minette在肯尼亚成功分离到病原，命名为f38。现主要流行于非洲、亚洲和地中海沿岸各养羊国家和地区，我国最早可追溯到1992年新疆伊犁，随后宁夏、甘肃、贵州、湖南、广西、河北、贵州、辽宁、江苏、内蒙、河南、青海、四川等省市均匀该病发生的报道(赵萍,2010,2016;郭晗,2011)。该病每年给养羊业造成的经济损失较为严重。

sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr是在pcr反应体系中加入荧光物质，利用荧光信号积累实时监测整个pcr过程，对未知模板可进行定量分析的方法。因其无需电泳，且具有快速性及定量性而广为推崇。查阅国内外文献发现，至今尚未见检测mccp的sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr方法。本发明的建立可以填补该领域的空白。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的引物。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于山羊支原体山羊肺炎亚种的sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr检测引物，引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’-gaactgaagaaggtatggctgaaga-3’，

下游引物：5’-cctgttccagcaccaactaaaac-3’。

利用本发明的引物可用于对mccp的相应基因进行检测，尤其适用于sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr技术的检测。通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立了一套可用于检测mccp的sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr方法。具体操作方法如下：

1、引物设计：根据genbank上公布的mccpay529462.1基因组序列，利用primer6.0软件对arcd基因序列进行引物设计，采用blast工具进行检索，初步验证其特异性。

2、反应体系的优化：优化出的25μl最佳反应体系为：sybrpremixextaq2×12.5μl、上、下游引物（10μmol/l）各0.5μl、模板2μl、水补足至25μl。最佳反应条件为：95℃，30s预变性；95℃，5s，60℃，30s，共40个循环。

3、阳性标准品的制备：以mccpf38株的dna为模板，进行arcd基因的pcr扩增。20μlpcr扩增体系为：premixtaq^tmversion2.0plusdye10μl、上下游引物(10μmol/μl)各1μl、模板2μl、无菌去离子水补足至20μl。反应条件：94℃2min；94℃30s、60℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。取pcr产物5μl，在1%琼脂糖凝胶上电泳。将pcr产物经胶回收试剂盒纯化后连接至pmd19-t载体上，并转化至基因工程菌dh5α.中，提取重组质粒，用pcr和双酶切方法鉴定，阳性重组质粒送至宝生物工程（大连）有限公司进行测序。经鉴定正确的阳性重组质粒作为标准品。

4、标准曲线的建立：用easydilution将构建的标准品梯度稀释(10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copies/μl)作为模板，以优化的反应体系进行荧光定量pcr扩增，以拷贝数为横坐标，以ct值为纵坐标建立标准曲线，判断阳性的标准。

该方法可用于山羊传染性胸膜肺炎病原的早期快速检测和流行病学调查，为疾病的预防和治疗奠定技术基础。

有益效果

本发明根据genbank登录的ay529462.1的arcd基因序列，设计特异性引物，于国内外首先建立山羊支原体山羊肺炎亚种的sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr方法，该方法特异性好、灵敏度高、重复性好，可用于山羊传染性胸膜肺炎病原的早期快速检测和流行病学调查。

附图说明

图1mccpsybrgreenⅰ实时荧光定量pcr方法的扩增曲线。

图2为mccp的sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr的标准曲线。

具体实施方式

实施例1mccpsybrgreenⅰ荧光定量pcr方法的建立

一、材料：

mccpf38株由中国科学院兰州研究所馈赠，大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌等由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病实验室和猪病实验室馈赠；绵肺炎支原体、羊口疮病毒为本科室分离、保存。

二、步骤

1、仪器与试剂：

mastercyclereprealplex荧光定量pcr仪购自eppendorf公司；胶回收试剂盒购自康宁生命科学（吴江）有限公司；sybrpremixextaqⅱ（2×）、pmd19-t载体、dl2000marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒小量抽提试剂盒购自omegabio-tek公司；荧光定量pcr管购自axygen。

2.引物的特异性

引物的特异性是本实验所建立方法的最重要因素。根据genbank登录的ay529462.1的arcd基因序列，通过比对分析，设计引物。

引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’-gaactgaagaaggtatggctgaaga-3’，

下游引物：5’-cctgttccagcaccaactaaaac-3’。

3、阳性标准品的制备

以mccpf38株dna为模板，进行arcd基因的pcr扩增。20μlpcr扩增体系为：premixtaq^tmversion2.0plusdye10μl、上下游引物(10μmol/μl)各1μl、模板2μl、无菌去离子水补足至20μl。反应条件：94℃2min；94℃30s、60℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。取pcr产物5μl，在1%琼脂糖凝胶上电泳。将pcr产物经胶回收试剂盒纯化后连接至pmd19-t载体上，并转化至基因工程菌dh5α.中，提取重组质粒，用pcr和双酶切方法鉴定，阳性重组质粒送至宝生物工程（大连）有限公司进行测序。经鉴定正确的阳性重组质粒作为标准品，置于-70℃冰箱保存备用。

4.反应条件的优化

采用25μl反应体系(sybrpremixextaq2×)12.5μl，pcr上游引物（10μmol/l）0.5μl，pcr下游引物（10μmol/l）0.5μl，倍比稀释后的阳性标准品2μl，补水至终体积25μl，以出现最小的ct值以及在熔解曲线分析中不出现非特异性峰为指标，分别对退火温度（51～65℃）和引物浓度（0.2～1.0μmol/l）进行优化。

用nanodrop2000测定提取质粒的浓度。根据重组质粒的分子量将其质量浓度换算为拷贝数浓度：拷贝/μl=(ng/μl×10^-9)×(6.02×10²³)/dnalength×660)；其中重组质粒浓度为87.6ng/μl，总长度为2862bp。经计算拷贝数为2.79×10¹⁰拷贝/μl，用easydilution将构建的标准品梯度稀释(10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copies/μl)作为模板，以优化的反应条件进行荧光定量pcr扩增，以拷贝数为横坐标，以ct值为纵坐标建立标准曲线。

对阳性标准品的扩增曲线和标准曲线显示，建立的sybrgreenⅰ荧光定量pcr方法对山羊支原体山羊肺炎亚种的ct与拷贝数在2.79×10³～2.79×10⁹copies/μl反应范围内有很好的线性关系，相关系数为0.998，扩增效率为103%。扩增曲线见图1，标准曲线见图2。

6特异性检测

6.1特异性检测

用优化的条件分别检测mccp、丝状支原体山羊亚种、大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌、绵肺炎支原体、羊口疮病毒核酸样品进行检测，对其特异性进行评价。结果显示，除mccp有检测到荧光信号，其余样品均未检测到荧光信号，表明该方法特异性好。

6.2可重复性及再现性评估

对同一阳性标准品设3个重复管，用sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr进行检测，评价其重复性，计算组内变异系数；将阳性标准品置于-20℃冰箱保存，分别于第3、6、9d重检，评价其再现性，计算其组间变异系数。结果显示，组内变异系数为0.59%～0.67%，组间变异系数为0.82%～0.98%，表明该方法重复性好。

sequencelisting

<110>福建省农科院畜牧兽医研究所

<120>用于山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光定量pcr检测引物

<130>2

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gaactgaagaaggtatggctgaaga25

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cctgttccagcaccaactaaaac23