罗布麻花多糖、提取方法及其应用与流程

本发明属于中药提取技术领域，具体涉及一种罗布麻花多糖、提取方法及其应用。

背景技术：

罗布麻（apocynumvenetuml）是夹竹桃科（apocynaceae）植物，俗称野麻，又名“夹竹桃麻”、“茶花麻”、“茶棵子”等。罗布麻花性味甘、苦，微寒，具有平肝降压，养心安神，清热利水的功能。罗布麻花中主要含黄酮类和强心苷等，其有效成分具有降低血压、血脂，强心利尿，平肝疏肝，抗炎，止咳平喘，抗过敏等功能。在新疆，当地居民用其花和叶泡茶保健用。罗布麻花气味芳香宜人,一直是维吾尔族传统的降压饮品。此外罗布麻花水煎服可治疗头晕，晒干后装枕头可以明目、降血压。多糖是由10个以上的单糖及糖苷键相连接而成的高聚物。多糖不仅可以作为支持组织，能量来源，还参与生物合成反应以及细胞间的识别、受精、胚胎形成、神经细胞发育、激素激活、细胞增殖、病毒和细菌的感染、肿瘤细胞转移等生命现象和生理过程。随着实验技术的发展，国内外研究者对多糖的认识进一步加深。文献检索显示：植物多糖具抗氧化、降血糖、降血脂、抗血栓、抑菌、抗炎以及免疫调节、抗疲劳等作用。药理活性与化学成分密切相关，目前尚未见有罗布麻花多糖的结构和体外溶栓(或纤溶)作用的相关报道，因此研究罗布麻花多糖，对于罗布麻的深度开发利用具有重要意义。

血液凝固简称凝血，是在内源性或（和）外源性凝血途径下产生凝血酶原激活物，凝血酶原激活物在凝血因子的作用下产生凝血酶，最后凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，血液由溶胶状态转变为凝胶状态。凝血过程通常分为：①内源性凝血途径；②外源性凝血途径；③共同凝血途径。外源性凝血途径是从组织因子暴露于血液而启动，到因子x被激活的过程；临床上以凝血酶原时间（pt）测定来反映外源性凝血途径的状况。内源性凝血途径是指从因子xii激活，到因子x激活的过程；临床上以活化部分凝血活酶时间（aptt）来反映体内内源性凝血途径的状况。从因子x被激活至纤维蛋白形成，是内、外源共同凝血途径；主要包括凝血酶生成和纤维蛋白形成两个阶段。

技术实现要素：

本发明目的在于在于克服现有技术缺陷，提供一种罗布麻花多糖、提取方法及其在凝血方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种罗布麻花多糖的提取方法，其包括如下步骤：

1）罗布麻花先用石油醚脱脂，再用乙醇提取脂溶性组分，取滤渣加水于90±5℃进行热提，热提后醇沉，取沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，冷冻干燥，然后用蒸馏水溶解，采用sevag法脱除蛋白，将得到的上清液透析、冷冻干燥得到粗多糖；

2）粗多糖经离子交换色谱和凝胶渗透柱色谱纯化后，得到四个多糖组分vp1、vp2a-i、vp2a-ii和vp3。

步骤1）具体为：将罗布麻花和石油醚混合后回流提取1－3次，每次回流提取1－3h，回流提取结束后过滤，滤渣晾干，加入70±5%乙醇于50±5℃加热提取2－4次，每次加热提取1－3h，加热提取结束后过滤，滤渣晾干获得脱脂罗布麻花，然后用蒸馏水于90±5℃热提取3－4次，每次热提取3－4h，热提取结束后趁热抽滤，滤液减压浓缩获得浓缩液，然后向浓缩液中加入乙醇使终浓度为70±5%，静置，离心得沉淀。

步骤2）具体包括如下步骤：

a）将粗多糖用蒸馏水溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，上样到deae-52色谱柱，依次用蒸馏水、0.1mol/l氯化钠溶液和0.2mol/l氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测490nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，减压浓缩，透析，冷冻干燥；其中，蒸馏水的洗脱峰为组分1，0.1mol/l氯化钠溶液的洗脱峰为组分2，0.2mol/l氯化钠溶液的洗脱峰为组分3；

b）组分1用蒸馏水溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，上样到sephadexg-100色谱柱，用蒸馏水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法进行检测，测其在490nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，得到单一洗脱峰，减压浓缩、冷冻干燥后得到的多糖组分命名为vp1；

c）组分2采用步骤b）同样的方法进行洗脱，得到两组洗脱峰，减压浓缩、冷冻干燥后得到的多糖组分分别命名为vp2a-i、vp2a-ii；

d）组分3采用步骤b）同样的方法进行洗脱，得到单一洗脱峰，减压浓缩、冷冻干燥后得到的多糖组分命名为vp3；

罗布麻花多糖即为vp1或vp3。

采用上述提取方法得到的罗布麻花多糖vp1或vp3。

罗布麻花多糖组分vp1在制备促凝血药物方面的应用。

罗布麻花多糖组分vp3在制备抗凝血药物方面的应用。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明提供具有活性多糖来源的植物罗布麻花，且从罗布麻花中提取获得四个精制多糖组分vp1、vp2a-i、vp2a-ii和vp3，并对罗布麻花精制多糖的体外抗凝血效果进行考察。试验结果表明：罗布麻花精制多糖组分vp1具有良好的促凝血效果，且vp1促凝血效果优于云南白药，可见它可以单独用于制备促凝血剂。罗布麻花精制多糖组分vp3则具有良好的抗凝血效果，且vp3抗凝血效果好于灯盏花素，可见其可以单独用于制备抗凝血剂。

附图说明

图1为凝血机制图；

图2为经deae-52色谱柱洗脱得到的罗布麻花多糖组分1、组分2和组分3的洗脱曲线图；

图3为经sephadexg-100色谱柱洗脱得到的罗布麻花精制多糖组分vp1、vp2a-i、vp2a-ii和vp3的洗脱曲线图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

罗布麻的干燥花于2015年7月采集于新疆阿克苏地区。经由河南大学中药研究所李昌勤教授鉴定为夹竹桃科多年生宿根植物罗布麻(apocynumvenetuml.)干燥花。实施例中乙醇浓度如无特殊说明，均指的是体积浓度。

实施例1罗布麻花多糖的提取

一种罗布麻花多糖的提取方法，其包括如下步骤：

1）取阴干的罗布麻花770g，用2l石油醚在圆底烧瓶中60℃下回流提取2次，每次回流提取1h。回流提取结束后过滤，滤渣晾干，加入70%乙醇9l，于50℃加热提取3次，每次加热提取1h。加热提取结束后过滤，滤渣晾干得脱脂罗布麻花479.7g。取全部脱脂罗布麻花，加10重量倍蒸馏水于90℃热提取4次，每次热提取4h。热提取结束后趁热抽滤，滤液减压浓缩获得浓缩液，然后向浓缩液中加入95%乙醇使终浓度为70%，静置24h，离心得沉淀。取沉淀然后用无水乙醇，丙酮，无水乙醚依次洗涤两次。冷冻干燥（在冷冻干燥机中进行，-40℃真空冷冻干燥10-12h，下同），然后用蒸馏水溶解，采用sevag法脱除蛋白（具体为：将溶解有沉淀的蒸馏水与sevag试剂按5：1的体积比混合，震荡、离心分层，将中间变性蛋白质和下层有机溶剂除去，将上清液按上述步骤重复操作5-10次，直到无变性蛋白质出现；sevag试剂为体积比5:1的氯仿、正丁醇混合液），将得到的上清液进行透析（用透析袋在4℃下透析2天，透析袋截留分子量为8000－14000，每4h更换一次蒸馏水，下同）以除去小分子物质，最后冷冻干燥，得到粗多糖58.58g；

2）将约250mg粗多糖溶解于15ml蒸馏水中并离心。取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液上样到deae-52色谱柱（2.6×40cm），依次用蒸馏水、0.1mol/l氯化钠溶液和0.2mol/l氯化钠溶液进行洗脱（恒流泵流速20r/min，用自动收集器收集洗脱液，每管8min，每管6ml），洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，用酶标仪测波长490nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，减压浓缩，透析（条件同上述步骤1），冷冻干燥；其中，蒸馏水的洗脱峰为组分1，0.1mol/l氯化钠溶液的洗脱峰为组分2，0.2mol/l氯化钠溶液的洗脱峰为组分3；

3）组分1用蒸馏水溶解为浓度0.04g/ml的溶液，离心（tgl-16rg，5000r/min，15min），0.22μm微孔滤膜过滤，滤液上样到sephadexg-100色谱柱（1.6×100cm），用蒸馏水进行洗脱（恒流泵流速4r/min，用自动收集器收集洗脱液，每管40分钟，每管6ml），采用苯酚-硫酸法进行检测，测其在波长490nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，得到单一洗脱峰，减压浓缩、冷冻干燥后得到的多糖组分命名为vp1；

4）组分2采用步骤3）同样的方法进行洗脱，得到两组洗脱峰，减压浓缩、冷冻干燥后得到的多糖组分分别命名为vp2a-i、vp2a-ii；

5）组分3采用步骤3）同样的方法进行洗脱，得到单一洗脱峰，减压浓缩、冷冻干燥后得到的多糖组分命名为vp3；

罗布麻花多糖即为vp1或vp3。

实施例2罗布麻花多糖的抗凝血试验。

方法：家兔体外血浆凝血四项检测。

仪器和材料：tgl-16gr高速台式冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；hf6000-4半自动凝血分析仪（南方汉方医疗器械有限公司）；lrh-150生化培养箱（上海一恒科技有限公司）；氯化钠注射液；0.109mol/l枸橼酸钠溶液、注射用灯盏花素（湖南恒生制药有限公司，20110202）；活化部分凝血酶时间（aptt）测定试剂盒（1121911）、凝血酶原时间（pt）测定试剂盒（105295）、凝血酶时间（tt）测定试剂盒（121168）、纤维蛋白原（fib）含量测定试剂盒（132107）均由上海太阳生物技术有限公司生产。

实验动物：獭兔，雄性，体重2.0～2.5kg，由河南大学药学院中药研究所提供（医动字14-2-6号）。在25±2℃和湿度45-65％，12/12小时光暗环境中循环饲养，可自由获得水和食物，动物饲养于标准笼。

样品溶液配制：

称取罗布麻花多糖vp16.2mg，v2pa-i6mg，vp2a-ii7.5mg，vp34.6mg溶解于适量生理盐水中，配置成5mg/ml浓度的溶液；

称取灯盏花素8mg溶解于600μl生理盐水中，制得浓度为13.33mg/ml的溶液；

称取云南白药1mg溶解于200μl生理盐水中，制得浓度为5mg/ml的溶液。

实验方法。

(1)对aptt影响的检测方法

血浆的制备：家兔耳缘静脉取血3.6ml，置于含有400μl浓度为0.109mol/l枸橼酸钠的离心管中，轻轻颠倒混匀，3000rpm离心15min，取上层清液，备用。

在测试杯中加入25μl样品溶液，再加入100μl血浆和37℃预温的aptt试剂100μl，37℃孵育5min后加入37℃预温的0.025mol/lcacl2溶液100μl，记录凝固时间，即为aptt值。

(2)对pt影响的检测方法

血浆的制备方法同上。在测试杯中加入25μl的样品溶液，再加入100μl的血浆，37℃孵育3min后加入37℃预温的pt试剂200μl，记录凝固时间，即为pt值。

(3)对tt影响的检测方法

血浆的制备方法同上。在测试杯中加入50μl样品溶液和200μl的血浆，孵育3min后加入tt试剂200μl，记录凝固时间，即为tt值。

(4)对fib影响的检测方法

血浆的制备方法同上。按照说明书绘制标准曲线。取200μl血浆和100μl样品溶液，然后加入700μlfib缓冲液（购买的试剂盒中所含），混匀。取前述稀释后的血浆200μl，37℃预温3min，加入100μlfib凝血酶溶液（fib凝血酶溶液是用2.5mlfib缓冲液稀释fib凝血酶所得，fib凝血酶为购买的试剂盒中所含），记录纤维蛋白原的含量，即为fib值。

数据处理：抗凝血活性的数据处理

结果采用算术平均值和标准差表示，数值统计采用spss19.0软件单因素方差分析（one-wayanova）进行组间比较，p<0.05说明具有统计学意义。测定结果见表1。

注：与空白组比较，***p<0.001，0.01<**p<0.001；

与云南白药比较，^￥￥￥p<0.001，与灯盏花素比较，^###p<0.001。

由表1可以看出：与空白组比较，vp1与vp3都能极显著地缩短aptt（p<0.001），其中vp1效果超过了阳性对照云南白药（p<0.001），而vp3效果远不如阳性对照云南白药（p<0.001）；vp2a-i与vp2a-ii极显著地延长了aptt（p<0.001），但效果弱于阳性对照灯盏花素。与空白组比较，vp3与vp2a--ii极显著地延长了pt（p<0.001），其效果与阳性对照灯盏花素相似；vp1与vp2a-i作用效果与空白组相似。与空白组比较，vp1能极显著地缩短tt（p<0.001），其效果远不如阳性对照云南白药（p<0.001）；vp3能极显著地延长tt（p<0.001），其效果远不如阳性对照灯盏花素（p<0.001）；vp2a-i与vp2a-ii作用效果与空白组相似。与空白组比较，vp1能极显著地升高fib（p<0.001），vp2a-i、vp2a-ii与vp3作用效果与空白组相似。

综合上述结果可以看出：罗布麻花多糖组分vp1具有一定的体外促凝血活性，可用于制备促凝血药物；而罗布麻花多糖组分vp3则具有一定的体外抗凝血作用，可用于制备抗凝血药物。