鉴定淮麦33小麦品种的方法与流程

本发明属于小麦种质资源品种鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定淮麦33小麦品种的方法。

背景技术：

小麦（triticumaestivuml.）是我国最重要的粮食作物之一，常年种植面积3.6亿亩左右。随着种子商业化水平的提高及优良新品种的不断出现，我国小麦品种更新换代越来越快。而且随着我国农村土地流转速度加快，农民购买良种率也在不断提高，年需求小麦良种约50亿斤。商业价值的存在致使很多种子企业开始经营小麦良种，而没有品种权的企业为获得高额利润，品种假包装、套牌等违法行为在市场上时有发生，伪劣假冒种子伤害农民的现象也屡次出现，一定程度上影响农民购买良种的意愿，也侵犯了正规企业的合法权益，遏制了育种家育种创新的动力，影响我国小麦种子产业的健康稳定发展。为保护小麦新品种权，给维权打假工作提供有效证据，亟待需要准确、快速、稳定的品种鉴定方法。

通过对小麦籽粒、幼苗和植株等传统的形态鉴定需要经验丰富的专家进行，而且往往存在鉴定时间长，易受人为主观因素影响等问题，法院不宜采用；采用苯酚染色法、氢氧化纳测定等化学鉴定手段易受种子发育程度、环境条件等制约，鉴定准确度不高；采用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳等蛋白标记技术往往存在条带较多，结果不易判定，且难以对亲缘关系较近的品种进行鉴定；采用单个品种的全基因组测序往往存在技术复杂、费用昂贵等诸多问题。上述技术存在的缺陷使其难以作为针对不同小麦品种统一的鉴定手段。

目前，分子标记（包括rapd、rflp、ssr和kasp）技术在小麦基因组的研究中得到了广泛应用。与其它分子标记相比，ssr标记主要具备以下优点：（1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上；（2）是共显性标记，呈孟德尔遗传；（3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。目前已广泛应用于小麦遗传连锁图谱的构建、目的基因的标记和定位、染色体片段的鉴定、遗传多样性分析和标记辅助选择等方面。因此，根据分子标记的技术特点，利用分子标记技术筛选出1个或几个特异引物，且这些引物能够真实反应该品种的基因型信息，即可将这些特异引物用于该小麦品种的鉴定工作。采用该技术可为小麦品种的维权打假工作提供有效证据，有利于相关品种保护工作的开展。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供一种鉴定淮麦33小麦品种的方法，利用ssr标记技术，采用能够较好表达黄淮麦区小麦品种的特异性引物barc45和wmc382，通过这两对引物为淮麦33小麦品种提供快速、准确的鉴定方法。

本发明的技术解决方案是：利用ssr标记技术，通过对分布于小麦21条染色体上的800对ssr引物进行筛选，确认barc45和wmc382号引物针对淮麦33品种具有较好的特异性，用于淮麦33品种的鉴定；该鉴定方法包括以下步骤：

（1）采用ctab法，分别对淮麦33小麦品种和待测小麦品种的任何器官或组织提取dna；

（2）以步骤（1）提取的淮麦33小麦品种和待测小麦品种的dna为模板，以barc45和wmc382为引物序列，分别进行pcr扩增；所述barc45和wmc382为引物序列对应如下表所述：

（3）对步骤（2）所得pcr扩增产物进行电泳，电泳结束后显色；

（4）对步骤（3）所得显色后样品进行带型统计，对比判定:如果待测小麦品种的pcr扩增样品电泳结果与淮麦33小麦品种的pcr扩增样品结果带型一致，表明待测小麦品种为淮麦33；如果不一致，则表明待测小麦品种非淮麦33。

其中，步骤（2）中，12.5µlpcr扩增反应体系设置如下：步骤（1）提取的dna模板2µl，taqdna聚合酶（5u/µl）0.08µl，10×buffer（包含tris-hcl100mm、kcl500mm、mgcl215mm）1.25µl，dntps（10mm）0.25µl，超纯水6.92µl，引物对barc45和wmc382以10µmol/l计，上游序列、下游序列各1µl；所述扩增程序（touchdownpcr）：94℃预变性3min；94℃变性30s；62℃(每循环降1℃)复性40s；72℃延伸40s，10个循环；94℃变性30s；52℃复性40s；72℃延伸40s，26个循环；最后72℃延伸5min；pcr扩增产物置于4℃保存备用。

其中，步骤（3）中，电泳前加入上样缓冲液，所述的上样缓冲液组分为：0.3mol/l氢氧化钠，6mmedta（ph8.0），质量分数0.15%的溴酚蓝，质量分数0.25%的二甲苯青。

其中，步骤（3）中，凝胶电泳分析具体为：12.5µlpcr扩增的反应体系中，加入2.5µl上样缓冲液；取样品3µl，200v恒定电压，在质量浓度为10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳100分钟，银染显色。

本发明的优点是：1、利用ssr标记技术，通过对小麦21条染色体上的800对ssr标记进行筛选，确认barc45和wmc382引物序列针对淮麦33小麦品种具有较好的特异性，用于淮麦33小麦品种的鉴定；2、本发明方法成熟，检测样品量少，快速、简便、准确度高，能够便捷、有效的应用到市场上对淮麦33品种进行真伪鉴定，有利于植物新品种权保护、新品种推广及种质资源的利用，同时也为其他小麦品种的推广利用和保护提供了较好的借鉴。

附图说明

图1为初次筛选特异性引物过程中未经处理的部分引物电泳图：其中，第1泳道为淮麦33，第二泳道为烟农19，第三泳道为郑麦991；

图2为初次筛选特异性引物过程中未经处理的部分引物电泳图：其中，第1泳道为淮麦33，第二泳道为烟农19，第三泳道为郑麦991；

图3为初次筛选特异性引物过程中未经处理的部分引物电泳图：其中，第1泳道为淮麦33，第二泳道为烟农19，第三泳道为郑麦991；

图4为初次筛选特异性引物过程中未经处理的部分引物电泳图：其中，第1泳道为淮麦33，第二泳道为烟农19，第三泳道为郑麦991；

图5为二次筛选过程中针对特异引物barc45的电泳比对图，其中从左到右分别是：marker；1：淮麦33；2：烟农19；3：郑麦991；4-16：淮麦33衍生品种（系）；17-30：黄淮麦区主推品种；31-33：江苏淮北地区部分主推品种；

图6为二次筛选过程中针对特异引物wmc382的电泳比对图，其中从左到右分别是：marker；1：淮麦33；2：烟农19；3：郑麦991；4-16：淮麦33衍生品种；17-30：黄淮麦区主推品种；31-33：江苏淮北地区部分主推品种。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明，具体介绍实施例前，对本发明所涉及的部分小麦品种来源和主要应用试剂简要介绍如下：淮麦33小麦品种及其他小麦供试材料均由淮安市农科院小麦育种室提供或由市场正规渠道购得；barc45、wmc382及其他引物序列均由takara宝生物工程（大连）有限公司合成提供；taqdna聚合酶购于takara宝生物工程（大连）有限公司；pcr反应在德国eppendorf系列pcr仪上运行。

本发明的难点及关键点在于针对淮麦33小麦品种的特异引物序列barc45和wmc382的筛选获得，对于该引物序列的筛选过程介绍如下。

一、特异性引物序列的初步筛选

1、ssr引物选择：ssr引物选用覆盖小麦21条染色体的800对简单重复序列（simplesequencerepeat，ssr）引物，包括wmc、barc、cfd和gwm的ssr引物系列；引物序列信息在graingene2.0(http://wheat.pw.usda.gov/)查阅获得；相关引物序列均由takara宝生物工程（大连）有限公司合成提供；

2、dna提取、pcr扩增及扩增产物的电泳：以小麦品种淮麦33及其亲本烟农19和郑麦991为检测材料进行引物的初步筛选，具体步骤如下：

（1）采用ctab法，分别对淮麦33小麦和待测小麦品种的任何器官或组织提取dna；

（2）以步骤（1）中提取的淮麦33小麦和待测小麦品种的dna为模板，以barc45和wmc382为引物序列，分别进行pcr扩增；12.5µlpcr扩增反应体系设置如下：步骤（1）提取的dna模板2µl，taqdna聚合酶（5u/µl）0.08µl，10×buffer（包含tris-hcl100mm、kcl500mm、mgcl215mm）1.25µl，dntps（10mm）0.25µl，超纯水6.92µl，引物对barc45和wmc382以10µmol/l计，上游序列、下游序列各1µl；pcr扩增程序（touchdownpcr）：94℃预变性3min；94℃变性30s；62℃(每循环降1℃)复性40s；72℃延伸40s，10个循环；94℃变性30s；52℃复性40s；72℃延伸40s，26个循环；最后72℃延伸5min；pcr扩增产物置于4℃保存备用；

（3）对步骤（2）中pcr扩增产物进行电泳：步骤（2）中12.5µlpcr扩增产物，加入2.5µl上样缓冲液；取样品3µl在质量浓度为10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，银染显色；所述上样缓冲液组分为：0.3mol/l氢氧化钠、6mmedta（ph8.0）、质量分数0.15%溴酚蓝，质量分数0.25%二甲苯青；

（4）对步骤（3）显色后样品进行带型统计，根据电泳结果，筛选出pcr扩增的淮麦33的带型与其亲本烟农19和郑麦991均不相同的引物对。

筛选结果表明，淮麦33的带型与其亲本烟农19和郑麦991均不相同的引物对有30个，具体如下表所示，部分初步电泳图如图1、图2、图3和图4所示。

二、特异引物序列的二次筛选

初步筛选得到的淮麦33品种的特异性引物数量相对较多，并不适合直接用于小麦品种的鉴定工作，因此尚需进一步的筛选；二次筛选过程中，以淮麦33的标准种子（国家种质资源库植物新品种权保护种子）、淮麦33的亲本2个、淮麦33衍生品种（系）13个、目前黄淮麦区主推品种及部分江苏淮北地区主推品种17个共计33份材料为基础，对初步筛选出来的30对引物进行进一步的特异性引物筛选；从中筛选出的特异引物再对外观长相与淮麦33相似的淮麦33衍生新品种（系），以及差异较大的黄淮及部分淮北地区主推品种进行检测验证；具体步骤如下：

（1）筛选过程中所用小麦品种：具体所用小麦品种情况如下表所示，其中编号1为淮麦33小麦品种；2和3为淮麦33的父母本；4-16为淮麦33衍生品种（系）；17-30为黄淮麦区主推品种；31-33为江苏淮北地区部分主推品种；

（2）对小麦基因组dna提取、pcr扩增及扩增样品的电泳同初步筛选；筛选时，对淮麦33和淮麦33外观长相接近的淮麦33衍生品种（系）进行筛选，因为衍生系遗传了淮麦33的部分基因，部分品种（系）像淮麦4046及淮麦08147在表型性状上与淮麦33标准种子非常相似，需要经验丰富的专家进行表型鉴定；从衍生品种（系）中筛选出的特异引物再对当前生产上推广面积较大的黄淮麦区主推品种和部分江苏淮北地区主推品种进行检测验证；4-16号材料为淮麦33的衍生后代，淮麦33在barc45位点只与淮麦4046和淮麦08147带型一致；在wmc382位点仅与淮麦508带型一致；17-30为黄淮麦区主推品种，淮麦33在上述两位点均与主推品种带型不同，也就初步判定引物标记barc45和wmc382可以作为淮麦33的特异标记，结合两对ssr标记的扩增结果，有效鉴定淮麦33小麦品种的真伪。

综上所述，结合最终的针对特异引物barc45和wmc382的电泳比对图（如图5和图6所示），可以看出，ssr标记barc45和wmc382具有较好的特异性，可用于筛选鉴定淮麦33小麦品种。