本申请是以下申请的分案申请：申请日：2007年5月24日；申请号：200780027882.9(pct/us2007/069662)；发明名称：同上。
相关申请的交叉参考
本申请要求保护2006年5月26日申请的美国临时申请序号60/808,834的优先权权益。
发明领域
本发明涉及转基因玉米事件(transgeniccornevent)mon89034及其植物部分和种子。该事件表现出对鳞翅目昆虫的昆虫侵袭的抗性。本发明还涉及含有某种dna的植物和种子的使用方法，所述dna在探测转基因事件独有的核苷酸序列的存在情况时诊断转基因事件的存在情况，以及通过检测转基因事件独有的特异性核苷酸序列检测所述玉米事件在生物样品中的存在情况的方法。本发明提供所述事件独有的核苷酸序列。
发明背景
本发明涉及本文称为事件mon89034的鳞翅类抗性转基因玉米(zeamays)植物品种，并涉及存在的独特dna序列，其在任何玉米样品或品种中检测时诊断该样品或品种中转基因玉米植物事件mon89034的存在情况，还涉及玉米mon89034中转基因/基因组插入区的检测，以及由其获得的子代植物和种子。
玉米植物事件mon89034尤其抗鳞翅科的昆虫，例如秋天行军虫(spodopterafrugiperda)、欧洲玉米螟(ostrinianubilalis)、谷实夜蛾(helicoverpazea)、西南玉米螟(diatraeagrandiosella)和小地老虎(agrotisipsilon)等，所有这些都是农业上重要的害虫。
玉米是一种重要的作物，在世界上很多地区都是主要的食物来源。已将生物技术方法应用于玉米，用以改进产品的农学性状和品质。一种这样的农学性状是昆虫抗性，例如遗传工程过的对鳞翅类和鞘翅类昆虫的抗性，该抗性出现在遗传工程后的玉米植物中，所述玉米被遗传工程为含有一种或多种编码杀虫剂的基因(参见例如美国专利6,489,542和美国专利6,620,988)。有利之处在于检测特定转基因事件在生物样品中的存在情况，以便确定有性杂交的一个或多个子代是否含有转基因物质。例如，检测样品中的事件对于许可用途、建立和保持纯度标准很重要，对遵照管理机构、遵照食品成分标准、按法定程序用于确定一个或多个具体个人或机构已使用特定事件而没有得到针对该转基因事件的任何专利的所有人或被许可人的许可、确保遵照多个政府法规和/或法律很重要。
另外，在遵照规定重组农作物来源食物的上市前的批准和标识要求的法规时，能够检测具体植株的方法应是有用的。反对样品中存在转基因事件的个体和机构也需要可靠的方法来检测样品中转基因的存在情况，以便使他们能够利用他们的没有转基因的产品的生意中获益。
尽管有这些优势，但是昆虫有可能对仅表达一种苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的植物进化出抗性。此抗性一旦被广泛传播，无疑会明显限制含有单个bt基因的种质的商业价值。
提高经由转基因植物提供的并旨在控制靶害虫的杀虫剂有效性并同时减弱抗这类杀虫剂的害虫出现的可能性的一种可能途径应是确保转基因作物表达高水平的这些杀虫剂，例如苏云金芽孢杆菌δ内毒素(mcgaughey和whalon(1992),science258:1451-55；roush(1994)biocontrol.sci.technol..4:501-516)。此外，具有有效对抗多类害虫且通过不同作用模式显示其作用的杀虫基因库可以避免抗性发展。由于提供表达两种或更多种对相同昆虫物种具有重叠毒性的杀虫活性的作物，可以显著延迟抗性的发生。实现这种双作用模式的一种方法可以提供表达bt基因连同dsrna的植物，bt基因对特定昆虫物种有毒性，dsrna为了靶向抑制bt毒素所靶向的相同昆虫物种的必需基因而提供，dsrna在被靶害虫摄入时激发rnai应答，为昆虫对dsrna或bt基因发展出抗性的事件中的冗余提供了方法。或者，在植物中共表达两种或更多种对相同昆虫物种均有毒性但每种均表现出不同的其杀伤活性实现模式的杀虫毒素，尤其是在二者均以高水平表达时，提供了有效抗性管理的方法。可用于这些组合的这类杀虫剂的实例包括但不限于bt毒素、致病杆菌属(xenorhabdussp.)或光杆状菌属(photorhabdussp.)杀虫蛋白、脱敏和去糖基化patatin蛋白和/或permutein、植物凝集素等。
已知外来基因在植物中的表达受到它们的染色体位置的影响，这或许是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)紧邻整合位点(weising等，(19880ann.rev.genet22:421-477)。因此，经常必须筛选大量事件，以鉴别以最佳表达所导入的目标基因为特征的事件。尽管这样，采用手头上的几十乃至上百个不同转基因事件，也不能确定成功鉴定这样的单个转基因事件：其提供至少两种不同毒素或杀虫剂的最佳表达水平，且没有由于插入某些必需的或部分必需的植物基因组区域或转基因表达水平产生的毒性作用而引起的任何不需要的农学缺陷或植物毒性作用。例如，已经在植物和其它生物中观察到，在事件中所导入基因的表达水平可能广泛变化。表达的空间或时间模式也可能有差异，例如在多种植物组织中的转基因相对表达的差异，这可能不符合由所导入的基因构建体中存在的转录调节元件预期的模式。因此，通常产生成百至上千的不同事件，并筛选事件中具有商业用途所需要的转基因表达水平和模式的单个事件。具有需要的转基因表达水平或模式的事件可使用常规育种方法有性杂交而用于将转基因基因渐渗到其它遗传背景中。这类杂交的子代保留了原始转化体的转基因表达特征。该策略用于在非常适合当地生长条件的多个品种中确保可靠的基因表达。
通过任何公知的核酸检测方法，诸如聚合酶链式反应(pcr)或使用核酸探针的dna杂交，有可能检测转基因的存在情况。这些检测方法一般集中于经常使用的遗传元件，例如启动子、终止子、标志基因乃至编码由转基因表达的目标蛋白或dsrna的编码序列，等等。因此，这些方法可能对区别不同事件无效，特别是使用同一dna构建体产生的那些，除非邻近插入dna的染色体dna序列(“侧翼dna”)是已知的。根据用于将转基因导入植物基因组中的方法，可以观察到异常或不常见的作用，这些作用经常将预期导入到植物中的转基因dna侧翼的植物基因组序列的鉴定复杂化。通常，插入dna的重排、侧翼基因组dna的重排或插入dna和侧翼基因组dna这二者的重排很普遍，使要评价的插入事件的分析复杂化。因此，有利的是得到选择、鉴定和确保样品中特定转基因事件的纯度和特征的方法，实现这一点的唯一方法是鉴定仅与所需转基因事件相关的一种或多种独有序列，因此，这些序列在含有转基因dna插入其中从而产生事件的植物物种dna的生物样品中的存在情况诊断该样品中的事件。
发明概述
本发明涉及称为mon89034的转基因玉米植物及其与玉米事件(cornevent)mon89034无法区分的子代(它们也含有至少一种对应于插入转基因dna的等位基因)，其种子已于2006年3月28日保藏于美国典型培养物保藏中心(atcc)，保藏号pta-7455。本发明的又一方面是所述玉米事件mon89034的植物和种子的子代植物或种子或可再生部分，所述玉米事含有选自以下的多核苷酸：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5。本发明还包括玉米事件mon89034的植物部分，包括但不限于花粉、胚珠、花、枝条(shoots)、根、茎(stalks)、穗丝、花序(tassels)、耳穗和叶，只要这些部分含有至少如上所述的多核苷酸。包含在mon89034基因组中的新的遗传组分，以及得自mon89034的这些产物，例如对应于mon89034事件的玉米粉、玉米面、玉米油、玉米浆和留在玉米作物田间的生物量(biomass)，都为本发明的一个方面。
本发明提供具有玉米事件mon89034的所有生理学和形态学特征的昆虫抗性玉米植物。
按照本发明的一个方面，提供检测称为mon89034的新玉米植物的转基因/基因组插入区的存在情况的组合物和方法。提供含有mon89034的至少一种接合序列的dna序列，所述接合序列选自seqidno:1(位于seqidno:5上的2051-2070位)和seqidno:2(位于11367-11388位)及其互补物；其中接合序列涵盖插入基因组中的异源dna和侧接插入位点的玉米细胞dna之间的接合，并诊断所述事件(图1)。玉米事件mon89034和含有这些dna分子的种子为本发明的一个方面。
含有玉米事件mon89034的新转基因/基因组插入区、seqidno:3和seqidno:4(图2)的dna序列是本发明的多个方面。含有这些分子的玉米植物和种子也是本发明的多个方面。
按照本发明的又一方面，提供用于dna检测方法中的两个dna分子，其中第一个dna分子包含seqidno:3的dna分子的转基因区的任何部分的至少11个以上连续多核苷酸，以及seqidno:3的5’侧翼玉米基因组dna区的任何部分的类似长度的dna分子，其中这些dna分子在一起使用时可在产生扩增子的dna扩增方法中用作dna引物。在使用这些dna引物在dna扩增方法中产生的扩增子含有seqidno:1时，该扩增子诊断玉米事件mon89304。通过与seqidno:3的任何部分同源或互补的dna引物产生的任何扩增子以及含有seqidno:1的任何扩增子是本发明的一个方面。
按照本发明的又一方面，提供用于dna检测方法中的两个dna分子，其中第一个dna分子含有seqidno:4的dna分子的转基因区的任何部分的至少11个以上的连续多核苷酸和seqidno:4的3’侧翼玉米基因组dna的任何部分的类似长度的dna分子，其中这些dna分子可在dna扩增方法中用作dna引物。当使用这些dna引物在dna扩增方法中产生的扩增子含有seqidno:2时，该扩增子诊断玉米事件mon89304。通过与seqidno:4的任何部分同源或互补的dna引物产生的任何扩增子和含有seqidno:2的任何扩增子是本发明的一个方面。
按照本发明的又一方面，提供检测样品中对应于玉米事件mon89034的dna的存在情况的方法。这些方法包括：(a)使含有dna的样品与引物组接触，所述引物组在玉米事件mon89034的基因组dna的核酸扩增反应时，产生诊断玉米事件mon89034的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，由此产生扩增子；和(c)检测扩增子，其中所述扩增子含有seqidno:1或seqidno:2。
玉米植物、种子或产物来源于植物或种子mon89034，其中包含的基因组dna含有的dna分子基本上由seqidno:5或其互补物组成。玉米植物或种子或产物来源于植物或种子mon89034，其中基因组dna在分离自玉米植物、种子或产物时，含有掺入seqidno:5的核苷酸的2061-11377及其互补物的dna分子。
玉米植物或种子或产物来源于植物或种子mon89034，其中基因组dna在分离自玉米植物或种子或产物时，在dna扩增方法中产生扩增子，其中在dna扩增方法中使用dna引物分子seqidno:6和seqidno:7。
按照本发明的又一方面，检测样品中对应于mon89034事件的dna的存在情况的方法，这些方法包括：(a)使含有dna的样品与探针接触，所述探针在严格杂交条件下与玉米事件mon89034的基因组dna杂交，但在严格杂交条件下不与对照玉米植物杂交；(b)对样品和探针实施严格杂交条件；和(c)检测探针与玉米事件mon89034dna的杂交，其中所述探针含有seqidno:1和seqidno:2。
本发明的又一方面是测定玉米事件mon89034子代的接合性的方法，包括：(a)使含有玉米dna的样品与包含sq2842(seqidno:6)、sq2843(seqidno:7)、sq6523(seqidno:10)、sq6524(seqidno:11)、pb880(seqidno:14)和pb2931(seqidno:15)的引物组接触，所述引物组在玉米事件mon89034的基因组dna的核酸扩增反应中使用时，产生诊断玉米事件mon89034的第一个扩增子，和(b)进行核酸扩增反应，由此产生第一个扩增子；和(c)检测第一个扩增子；和(d)使含有玉米dna的样品与所述引物组接触，所述引物组在玉米植物的基因组dna的核酸扩增反应中使用时，产生含有与鉴定为玉米事件mon89034的转基因插入序列的玉米基因组区同源的天然玉米基因组dna的第二个扩增子；和(e)进行核酸扩增反应，由此产生第二个扩增子，和(f)检测第二个扩增子；和(g)比较样品中的第一个和第二个扩增子，其中两个扩增子均存在指示该样品对转基因插入序列为杂合的。
本发明的一个方面是在鳞翅类害虫的膳食中提供有效杀虫量的玉米事件mon89034。
本发明的又一方面提供为农产品或食品形式的组合物或生物样品，其来源于玉米事件mon89034，所述农产品或食品包含玉米耳穗、去包叶玉米、玉米穗丝、玉米花粉、玉米糁、玉米粉、压碎玉米、玉米面、玉米油、玉米淀粉、玉米浆、玉米麦芽、玉米糖、玉米糖浆、由玉米油生产的人造黄油、不饱和玉米油、饱和玉米油、玉米片、爆裂玉米、由含有诊断玉米事件mon89034的dna的玉米或玉米产物产生的乙醇和/或汁(liquor)、由这些玉米事件发酵产生的干酒糟(distillersdrygoodssolids,ddgs)，以及含有这些ddgs和/或玉米(无论是完整的、碎裂的还是压碎的)的动物饲料、加工食品、化妆品和其中存在可检测量的多核苷酸的填充剂，所述多核苷酸诊断生物样品中转基因玉米事件mon89034的存在情况。提供玉米作为食品的替代方法以多种喂饲用粒状形式提供玉米，例如完整玉米、玉米糁、压碎玉米，以及在与蜀黍、板油、粟、向日葵、燕麦、小麦、水稻、豆等的混合物中以多种先前形式提供玉米。在所述农产品或食品中的可检测量的核苷酸序列，如在seqidno:1或seqidno:2中所示，或其互补物，诊断样品中该转基因事件mon89034dna的存在情况，由此，诊断样品中产生所述dna的转基因事件细胞的存在情况。
根据以下的详述，本发明的前述方面和其它方面将变得更显而易见。
附图简述
图1.在转基因玉米事件mon89034基因组中存在的转基因插入序列的构成。中空或白色条棒代表插入dna。白色条棒以下是代表了插入dna中的多个元件的示意图。插入dna的末端已被随意地称为5’(至图的左侧)和3’(至图的右侧)。右边界和左边界序列或区段在每个示意图底部标记，图解了插入dna中的多个元件。插入dna内的表达盒中的标记元件以连续顺序由右边界开始为：e35s启动子、小麦cab非翻译前导序列、水稻肌动蛋白内含子、cry1a.105编码序列、小麦hsp173’终止和多腺苷酸化序列、fmv启动子、hsp70内含子、rubisco小亚基叶绿体靶向肽编码序列、cry2ab编码序列、nos3’终止和多腺苷酸化信号序列，然后为左边界。在中空或白色条棒的任一个末端的垂直阴影条棒对应于随意标记的5’和3’玉米基因组侧翼序列。在阴影和空心或白色条棒之上的最长黑线代表seqidno:5(该图提供的全长序列图示了5’侧翼序列、插入dna序列和3’侧翼序列)。标记为seqidno:5的黑线之上和之下的较短黑线代表seqidno:5中的近似位置，其中每个具体标记的序列都可以找到(即seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3和seqidno:4)。seqidno:1和seqidno:2以及来源于含有seqidno:1和/或seqidno:2的玉米事件mon89034的任何序列，都诊断生物样品中的玉米事件mon89034dna。
发明详述
提供以下定义和方法以更好地详细说明本发明，并指导本领域一般技术人员实施本发明。除非另外指出，否则术语根据相关领域的一般技术人员的常规用法来理解。分子生物学的普通术语的定义也可见于rieger等,glossaryofgenetics:classicalandmolecular,第5版,springer-verlag:newyork,1991；和lewin,genesv,oxforduniversitypress:newyork,1994。
本文使用的术语“玉米”是指玉米(zeamays)，包括可与玉米交配的所有植物品种，包括野生玉米种。
本文使用的术语“包含”意指“包括但不限于”。
通过用异源dna(即含有目的转基因的核酸构建体)转化植物细胞，再生由转基因插入植物基因组而产生的植物群，并选择以插入到特定基因组位置为特征的特定植株，产生转基因“事件”。术语“事件”是指含有异源dna的原初转化体和转化体后代。术语“事件”还指通过在转化体和含有异源dna的另一个品种之间进行有性异型杂交产生的后代。即使在与回交亲本进行重复回交后，来自于转化亲本的插入dna和侧翼dna也存在于杂交后代中的同一染色体位置。术语“事件”也指含有插入dna和与插入dna紧密相邻的侧翼基因组序列的原初转化体的dna，预期该dna应由于一个含有插入dna的亲本系(如原初转化体和由自交产生的后代)与不含有插入dna的亲本系进行有性杂交而被转移到接受含有目的转基因的插入dna的后代中。本发明涉及事件mon89034dna、来源于mon89034的植物细胞、组织、种子和加工产物。
还要理解的是，也可以使两种不同的转基因植物交配，产生含有两个独立地分离添加的外源基因的后代。适宜后代的自交能够产生对于两个所添加的外源基因为纯合的植物。还设想了对亲本植物回交和与非转基因植物异交，无性繁殖就是这种情况。通常用于不同性状和作物的其它育种方法的描述可见于若干参考文献当中的一篇，如fehr，载于breedingmethodsforcultivardevelopment，wilcoxj.编辑，americansocietyofagronomy，madisonwi(1987)。
“探针”是连接常规可检测的标记或报告分子的分离核酸，所述标记或报告分子例如为放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。这样的探针与靶核酸链互补，就本发明而言，与玉米事件mon89034的基因组dna链互补，无论它来自玉米植物还是来自包含该事件的dna的样品。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括特异性地结合靶dna序列并可用于检测该靶dna序列的存在情况的聚酰胺和其它探针材料。
“引物”是分离的核酸，它们通过核酸杂交与互补靶dna链退火，在引物和靶dna链之间形成杂合体，随后经聚合酶如dna聚合酶沿着靶dna链延伸。本发明的引物对是指它们例如通过聚合酶链式反应(pcr)或其它常规核酸扩增方法来扩增靶核酸序列的用途。
探针和引物一般为11个以上长度的核苷酸，优选为18个以上的核苷酸，更优选为24个以上的核苷酸，最优选为30个以上的核苷酸。这些探针和引物在高严格杂交条件下与靶序列特异性杂交。优选地，尽管可以通过常规方法设计与靶序列不同并保有同靶序列杂交的能力的探针，但根据本发明的探针和引物与靶序列具有完全的序列相似性。
制备与使用探针和引物的方法描述于例如molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,1-3卷,sambrook等编辑,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny,1989(在下文，“sambrook等，1989”)；currentprotocolsinmolecularbiology,ausubel等编辑,greenepublishingandwiley-interscience,newyork,1992(定期更新)(在下文,“ausubel等,1992”)；和innis等,pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications,academicpress:sandiego,1990。pcr引物对可从已知序列得到，例如，通过使用拟用于该用途的计算机程序，如primer(0.5版,
基于此处公开的侧翼dna和插入序列的引物和探针可用于通过常规方法(例如通过重新克隆和对这些序列测序)证实(如有需要，则校正)所公开的序列。
本发明的核酸探针和引物在严格条件下同靶dna序列杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法均可用于鉴定样品中转基因事件的dna的存在情况。在某些情况下，核酸分子或其片段能够与其它核酸分子特异性杂交。在本文中，如果两个核酸分子能形成反向平行的双链核酸结构，则这两个分子被称为能够彼此特异性杂交。如果核酸分子显示出完全互补，则一个核酸分子被称为另一个核酸分子的“互补物”。在本文中，当一个分子的每个核苷酸均与另一个分子的核苷酸互补时，这些分子被称为表现出“完全互补”。如果两个分子可相互杂交，具有的稳定性足以使它们在至少常规的“低严格”条件下保持互相退火，则它们被称为“最低限度互补”。类似的，如果分子可相互杂交，具有的稳定性足以使它们在常规的“高严格”条件下保持互相退火，则这些分子被称为“互补”。常规严格条件由sambrook等,1989和haymes等，描述于：nucleicacidhybridization,apracticalapproach,irlpress,washington,dc(1985)。因此，允许相对于完全互补有偏离，只要这些偏离没有完全排除分子形成双链结构的能力。为了使核酸分子用作引物或探针，仅仅需要在序列上足够互补，以能够在所用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。
在本文中，大体上同源的dna序列是指这样的核酸序列：在高严格条件下其将与同其比较的核酸序列互补物特异地杂交。促进dna杂交的适宜严格条件，如在约45℃下的6.0×氯化钠/柠檬酸钠(ssc)，随后在50℃以2.0×ssc洗涤，是本领域技术人员已知的，或者可见于currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,n.y.(1989),6.3.1-6.3.6。例如，洗涤步骤中的盐浓度可选自低严格的50℃、约2.0×ssc到高严格的50℃、约0.2×ssc。此外，洗涤步骤的温度也可以从约22℃室温的低严格条件升高到约65℃的高严格条件。温度和盐浓度都是可变的，或者温度或盐浓度中的任一个可保持恒定，而改变另一个变量。在优选的实施方案中，在中度严格条件(如约2.0×ssc和约65℃)下，本发明的核酸与seqidno:1和2中所示的一种或多种核酸分子或其互补物或任一个的片段特异性杂交。在特别优选的实施方案中，在高严格条件下，本发明的核酸与seqidno:1和seqidno:2中所示的一种或多种核酸分子或任一个的互补物或片段特异性杂交。在本发明的一方面，本发明优选的标记核酸分子具有seqidno:1和seqidno:2中所示的核酸序列或其互补物或任一个的片段。在本发明的又一方面，本发明优选的标记核酸分子与seqidno:1和seqidno:2中所示的核酸序列或其互补物或任一个的片段共有80％-100％或90％-100％的序列同一性。在本发明的再一方面，本发明优选的标记核酸分子与seqidno:1和seqidno:2中所示的序列或其互补物或任一个的片段共有95％-100％的序列同一性。seqidno:1和seqidno:2可以在植物育种方法中用作标记，以鉴定遗传杂交的后代，这类似于在“dnamarkers:protocols,applications,andoverviews:(1997)173-185,cregan等编辑,wiley-lissny”中针对简单序列重复dna标记分析所描述的方法；所述文献在此全部引用作为参考。探针与靶dna分子的杂交可通过本领域技术人员已知的众多方法中的任一种检测，这些方法可包括但不限于荧光标签法、放射性标签法、基于抗体的标签法和化学发光标签法。
关于利用特定扩增引物对进行靶核苷酸序列扩增(例如通过pcr)，“严格条件”是指这样的条件：在dna热扩增反应中使引物对仅与靶核酸序列(具有相应野生型序列(或其互补物)的引物应与该靶核酸序列结合)杂交并优选产生独特的扩增产物—扩增子。
术语“特异于(靶序列)”是指在严格杂交条件下探针或引物仅同含有靶序列的样品中的该靶序列杂交。
本文所用的“扩增的dna”或“扩增子”是指为核酸模板一部分的靶核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定玉米植物是否由含有本发明玉米植物的转基因事件基因组dna的有性杂交产生，可使用包含来源于紧邻插入异源dna的插入位点的植物基因组中的侧翼序列的引物和来源于插入异源dna的第二个引物的引物对，对从玉米植物组织样品提取的dna实施核酸扩增方法，以产生诊断事件dna的存在情况的扩增子。所述扩增子具有一定长度，并具有也诊断所述事件的序列。扩增子的长度可在引物对加一个核苷酸碱基对、优选加大约50个核苷酸碱基对、更优选加大约250个核苷酸碱基对、甚至更优选加大约450个核苷酸碱基对的组合长度范围内。或者，引物对可来源于插入dna两边的侧翼序列，以便产生包含全部插入核苷酸序列的扩增子。来自植物基因组序列的引物对的成员可以与插入dna分子相距一定距离定位，该距离可以在一个核苷酸碱基对至最高大约两万个核苷酸碱基对的范围内。术语“扩增子”的使用特别排除了可以在dna热扩增反应中形成的引物二聚体。
核酸扩增可以通过本领域已知的多种核酸扩增方法中的任一种来实现，包括聚合酶链式反应(pcr)。多种扩增方法是本领域已知的，尤其是描述于美国专利号4,683,195和4,683,202以及pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications,innis等编辑,academicpress,sandiego,1990。pcr扩增方法已发展成扩增最多22kb的基因组dna和最多42kb的噬菌体dna(cheng等，proc.natl.acad.sci.usa91:5695-5699,1994)。这些方法以及dna扩增领域已知的其它方法可用于实施本发明。来自玉米事件mon89034和以atcc编号保藏的种子样品的异源dna插入序列或侧翼序列可如下检验(且如有必要进行校正)：使用源于本文提供的序列的引物扩增来自所述事件的这些序列，随后对pcr扩增子或克隆的dna进行标准dna测序。
可以通过多种技术来检测通过这些方法产生的扩增子。一个这样的方法是遗传比特分析(geneticbitanalysis)(nikiforov等，nucleicacidres.22:4167-4175,1994)，其中设计与相邻侧翼基因组dna序列和插入dna序列这二者重叠的dna寡核苷酸。将寡核苷酸固定在微量滴定板的孔中。在对目的区域进行pcr后(使用位于插入序列的一个引物和位于相邻侧翼基因组序列的一个引物)，可以将单链pcr产物同固定的寡核苷酸杂交，并作为模板用于利用dna聚合酶和特异于下一个期望碱基的标记ddntp的单碱基延伸反应。读数器可以是荧光的或基于elisa的。信号指示归因于成功的扩增、杂交和单碱基延伸的插入序列/侧翼序列的存在情况。
另一个方法是winge(innov.pharma.tech.00:18-24,2000)描述的焦磷酸测序技术(pyrosequencingtechnique)。在该方法中，设计与相邻基因组dna和插入dna接合区重叠的寡核苷酸。使寡核苷酸与来自目的区域的单链pcr产物杂交(一引物位于插入序列，另一引物位于侧翼基因组序列)，并在dna聚合酶、atp、硫酸化酶、萤光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷5’磷酸硫酸酯以及萤光素存在下温育。单独加入dntp，测量掺入产生的光信号。光信号指示归因于成功的扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸的转基因插入序列/侧翼序列的存在情况。
如chen等描述的荧光偏振(genomeres.9:492-498,1999)是一种可用于检测本发明的扩增子的方法。使用此方法设计与基因组侧翼和插入dna接合区重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸与来自目的区域的单链pcr产物杂交(一引物位于插入dna序列，另一引物位于侧翼基因组dna序列)，并在dna聚合酶和荧光标记的ddntp存在下温育。单碱基延伸导致掺入ddntp。可以使用荧光计根据偏振变化测量掺入。偏振变化指示归因于成功的扩增、杂交和单碱基延伸的转基因插入序列/侧翼序列的存在情况。
如tyangi等(naturebiotech.14:303-308,1996)所述，业已描述了分子信标可用于序列检测。简而言之，设计与侧翼基因组和插入dna接合区重叠的fret寡核苷酸探针。fret探针的独特结构使其含有保持荧光部分和淬灭部分紧邻的二级结构。将fret探针和pcr引物(一引物位于插入dna序列，一引物位于侧翼基因组序列)在热稳定聚合酶和dntp存在下循环。在成功pcr扩增之后，fret探针与靶序列杂交导致除去探针二级结构以及荧光和猝灭部分空间分离，这导致产生荧光信号。荧光信号指示归因于成功的扩增和杂交的侧翼序列/转基因插入序列的存在情况。
其它描述的方法，例如微流化(美国专利公布号2006068398、美国专利号6,544,734)，提供了分离和扩增dna样品的方法和装置。光学染料用于检测和定量特定dna分子(wo/05017181)。然后可使用含有检测dna分子的电传感器的纳管装置(wo/06024023)或结合特定dna分子的纳珠检测。
使用本文公开的组合物提供dna检测试剂盒。所述试剂盒可用于鉴定样品中的玉米事件mon89034dna，并可至少应用于育种含适宜事件dna的玉米植物的方法。所述试剂盒含有与选自seqidno:1-7所示序列的区段同源或互补的dna引物和/或探针，或与包含在如序列表所示的dna的转基因遗传元件中的dna同源或互补的dna引物或探针。这些dna序列可用于dna扩增反应，或在dna杂交方法中用作探针，检测诊断样品中靶dna的存在情况的多核苷酸的存在情况。在热扩增反应中产生的预定扩增子诊断样品中对应于pto-7455基因组dna的dna的存在情况。如果杂交是选择性的，则检测探针与生物样品的杂交诊断样品中mon89034转基因事件dna的存在情况。通常，样品为玉米或玉米产物或玉米应用的副产品。
本发明提供称为玉米事件mon89034的转基因玉米植物、植物子代和植物细胞，以及由植物产生的种子。用于生长植物、生产子代、获得细胞或生产一组含有转基因玉米事件的所述种子的代表性种子已于2006年3月28日保藏于美国典型培养物保藏中心(atcc)，并获得保藏号pta-7455。
植物和细胞以及由这些实施方案生产的产物等含有诊断任何生物样品中来源于转基因玉米事件mon89034来源的任何细胞的dna存在情况的dna。这是因为这两个新序列包含在转基因玉米事件mon89034细胞中。诊断dna包含的核苷酸序列选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5。这些序列的关系在本文和图1的图例中以及参考图1更具体地描述。
由对诊断转基因玉米事件mon89034的dna为纯合的种子培育的玉米植物也属于本发明的范围。由对诊断转基因玉米事件mon89034的dna为杂合的种子培育的玉米植物也在本发明的范围内，只要这些种子也含有诊断dna序列。由含有诊断dna的这些植物产生的细胞、种子和组织也在本发明的范围内。
含有诊断转基因玉米事件mon89034的dna的玉米植物和玉米植物细胞等表现出对鳞翅类昆虫侵袭的抗性。这些细胞和植物含有编码杀虫蛋白(杀虫剂、毒剂)cry2ab的dna以及具有seqidno:1和seqidno:2的核苷酸序列(构成植物细胞基因组的一部分)的dna。这些植物和植物细胞还含有编码杀虫蛋白(杀虫剂、毒剂)cry1a.105的dna。这些蛋白可被分别或倒转称为第一种和第二种杀虫蛋白。这些蛋白的表达由嵌入在表达盒中的调节组分/遗传元件实现，所述表达盒供编码这些毒素的每种dna序列表达用，并在本文和图1的图例中以及参考图1和示于seqidno:5的序列完整描述。含有这些序列的玉米植物和玉米植物细胞有效保护植物免于鳞翅类害虫侵袭，无论对其中存在这些编码序列的等位基因是杂合的还是纯合的。
本发明还提供可由本文所述的序列产生的扩增子，其诊断生物样品中来源于转基因玉米事件mon89034dna的dna的存在情况。诊断生物样品中的转基因玉米事件mon89034dna存在情况的扩增子含有至少一种由seqidno:1或seqidno:2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸区段。这些扩增子可以使用下文所述的引物序列由含有来源于转基因玉米事件mon89034的至少约0.5飞摩尔(femto-mole)或约0.5皮克dna的任何生物样品产生。这些对应于转基因玉米事件mon89034的dna的生物样品源可以为来源于该转基因事件的玉米粉、玉米油、玉米饼、玉米种子、玉米胚芽、玉米淀粉和玉米面等。
本发明还提供分离的多核苷酸分子，其具有连续核苷酸序列，例如在seqidno:5中所示的那些。这些连续核苷酸序列包含：(1)约11个至约12000个核苷酸以及其间的任何长度，并还含有如在seqidno:1中的1-11或9-20位核苷酸和seqidno:2中所示的1-11或9-20位核苷酸所示的连续核苷酸；(2)如在seqidno:3中所示的约11个至约2000个核苷酸以及其间的任何长度的任何连续核苷酸序列，并还含有如在seqidno:1中的1-11和9-20位核苷酸所示的连续核苷酸；如在seqidno:4中的约11个至约914个核苷酸以及其间的任何长度所示的任何连续核苷酸序列，并还含有如在seqidno:2中的1-11和9-20位核苷酸所示的连续核苷酸。这些分离的多核苷酸分子可用于dna扩增方法中由含有玉米dna的生物样品产生一种或多种扩增子。此扩增子的检测诊断样品中转基因玉米事件mon89034dna的存在情况。分离的多核苷酸分子还可用于多种核苷酸检测方法，这些方法用于检测生物样品中来源于转基因玉米事件mon89034的dna的存在情况。具体地说，含有如在seqidno:1或seqidno:2中所示的至少约11个连续核苷酸的多核苷酸探针可在检测样品中的转基因事件mon89034dna的这类方法中用作探针。这些分离的多核苷酸分子的互补序列也可以用于相同的检测和/或扩增方法中。
本发明还提供用于检测生物样品中来源于转基因玉米事件mon89034的dna的存在情况的试剂盒。使用探针多核苷酸分子的试剂盒应可用于检测样品中mon89034dna的存在情况，所述探针分子含有至少约11个至约12000个连续核苷酸，与包含在seqidno:5中所示序列的核苷酸区段具有显著同源性，或具有显著互补性。探针分子应含有如在seqidno:1和seqidno:2中所示的至少一种序列。在seqidno:1和seqidno:2中所示的序列还可以被称为接合序列，即在插入玉米植物中而产生转基因玉米事件mon89034的转基因dna的任一个末端的序列。这些序列随意地分别被称为5’和3’末端，含有部分插入dna序列和部分侧翼玉米基因组序列。例如，seqidno:1在其5’一半提供侧接插入dna的5’末端的玉米基因组序列的3’末端，插入dna的5’末端由在seqidno:1中所示序列的3’末端一半提供。seqidno:2在其5’一半提供插入dna的3’末端，在其3’末端一半提供侧接插入dna的3’末端的玉米基因组序列的5’末端。在天然的玉米基因组中seqidno:5所示的插入序列的位置，插入dna的5’末端的侧翼序列和插入dna的3’末端的侧翼序列接合，与seqidno:3所示序列(非seqidno:3的3’末端的21个核苷酸)的互补序列杂交的第一个引物分子和与seqidno:4所示序列(非seqidno:4的5’末端的20个核苷酸)杂交的第二个引物分子将在模板为非mon89034dna的dna的热扩增反应中产生扩增子，该扩增子用于诊断mon89034中不存在插入dna，当使用mon89034dna作为模板时，相同的引物将产生稍微大于12000个核苷酸的扩增子(取决于引物在seqidno:3和seqidno:4中所示的侧翼序列中的位置)。还提供其它实施方案。
提供在生物样品中检测玉米事件mon89034的接合序列seqidno:1或seqidno:2的试剂盒。该试剂盒含有多核苷酸探针，还含有用于核酸扩增反应的引物对，所述多核苷酸探针为选自seqidno:1或seqidno:2或其互补物的序列，或与该序列完全互补。所述引物对可被称为第一引物和第二引物，第一引物由seqidno:3的玉米基因组部分的至少约15个至约50个连续核苷酸组成，第二引物由与seqidno:5的异源插入dna部分互补的至少约15个至约50个连续核苷酸组成。多核苷酸引物对的第一引物与对应于seqidno:3中约核苷酸1位至约2050位所示序列的反向互补序列特异性杂交，所述多核苷酸引物对的第二引物与seqidno:5中约核苷酸位2060至约核苷酸位12,208所示的序列特异性杂交，所述引物对彼此相对延伸，形成含有seqidno:1的扩增子，所述扩增子诊断样品中mon89034事件dna的存在情况。不同的引物对可被称为第一引物和第二引物，第一引物由与seqidno:4的玉米基因组部分互补的至少约15个至约50个连续核苷酸组成，第二引物由seqidno:5的异源插入dna部分的至少约15个至约50个连续核苷酸组成。多核苷酸引物对的第一引物与对应于seqidno:5中由约核苷酸1位至约11,370位所示序列的反向互补序列特异性杂交，多核苷酸引物对的第二引物与seqidno:4中由约核苷酸1位至约核苷酸914位所示的序列特异性杂交，所述引物对彼此相对延伸，形成含有seqidno:2的扩增子，所述扩增子诊断所述样品中mon89034事件dna的存在情况。
这些引物对可用于产生含有seqidno:1或seqidno:2的扩增子，视情况而定，并因此诊断生物样品中mon89034dna的存在情况。这些扩增子能够检测生物样品中诊断玉米事件mon89034的接合序列的存在情况。
还提供产生和检测扩增子的方法，所述扩增子诊断含有玉米dna的生物样品中的转基因玉米事件mon89034dna。该方法包括使生物样品与两种或更多种引物在核酸扩增反应中一起接触，进行核酸扩增反应，然后检测扩增子。扩增子的存在情况诊断样品中的所述事件dna，只要该扩增子含有seqidno:1和seqidno:2中约1-11或9-20位核苷酸所示的至少一种连续序列，或对应于这些位置的互补序列。
还可以使用其它方法检测诊断生物样品中转基因玉米事件mon89034的存在情况的核苷酸序列。例如，使怀疑含有mon89034dna的生物样品与探针接触，所述探针在严格杂交条件下与在seqidno:1或seqidno:2中所示的一种或多种核苷酸序列杂交，对样品和探针实施严格杂交条件；然后检测探针与核苷酸序列的杂交。检测杂交诊断样品中mon89034dna的存在情况。
本发明还提供用于在热扩增反应中产生扩增子的引物多核苷酸，所述扩增子诊断生物样品中玉米事件mon89034dna的存在情况。通常，引物成对提供，为方便起见，引物对的成员被称为第一引物和第二引物。第一引物可以由在seqidno:3中所示的玉米基因组部分的至少约15个连续核苷酸组成，第二引物可以由与seqidno:5中所示的异源插入dna部分互补的至少约15个连续核苷酸组成。这2个引物应在热扩增反应中产生扩增子，采用的模板dna得自玉米事件mon89034dna，含有seqidno:1所示多核苷酸序列。或者，第一引物可以由seqidno:4的玉米基因组部分的至少约15个连续核苷酸组成，第二引物可以由与seqidno:5的异源插入dna部分互补的至少约15个连续核苷酸组成。这2个引物应在热扩增反应中产生扩增子，采用的模板dna得自玉米事件mon89034dna，含有seqidno:2所示多核苷酸序列。
检测含有玉米dna的生物样品中玉米事件mon89034的接合序列(例如seqidno:1或seqidno:2)的替代方法由以下组成：使样品与在严格杂交条件下与其中一个接合序列杂交的多核苷酸探针接触，对样品和探针实施严格杂交条件；检测探针与接合序列的杂交。检测探针与接合序列的结合/杂交指示生物样品中mon89034dna的存在情况。其dna在实施本文所述方法时产生含有seqidno:1或seqidno:2的dna扩增子的稳定转化的玉米植物，属于本发明的范围。具体地说，示例性的引物序列—引物对序列，陈述于本文中的实施例以及seqidno:6和seqidno:7。
检测生物样品中玉米事件mon89034dna的存在情况的替代方法可以由以下步骤组成：使样品探针接触，所述探针在严格杂交条件下与mon89034dna杂交，但在严格杂交条件下不与非mon89034dna的玉米植物基因组dna杂交，对样品和探针实施严格杂交条件，然后检测探针与mon89034dna的杂交。符合本实施方案的探针为选自seqidno:1和seqidno:2的序列，或与该序列互补。检测探针与样品的杂交诊断样品中玉米事件mon89034多核苷酸的存在情况。生物样品可以为任何含有mon89034dna的样品，包括但不限于玉米油、玉米粉、玉米面、玉米面筋、玉米饼、玉米淀粉、玉米浆、玉米组织、玉米细胞、玉米籽粒、玉米花粉、玉米根组织、ddgs，甚至作为这类转基因玉米发酵的副产物产生的乙醇，只要该样品含有至少可检测量的、诊断样品中mon89034事件的存在情况的多核苷酸。多核苷酸探针可以为选自脱氧核糖核酸、核糖核酸和核苷酸类似物的任何核苷酸，并可以用至少一种荧光团、含有放射性发射同位素的分子或可以用抗体或其它结合型反应特异性检测的半抗原型分子标记。
可以通过使含有转基因玉米事件mon89034dna的玉米植物与非事件mon89034的玉米植物一起交配，产生含有诊断所述事件的dna的杂种玉米植物，从而获得含有诊断mon89034转基因事件dna的存在情况的dna的玉米品种。含有诊断转基因玉米事件mon89034的dna的该杂种玉米植物属于本发明的范围，由该杂种产生的种子(只要含有诊断转基因玉米事件mon89034的dna)，以及杂种玉米植物mon89034的花粉、胚珠、种子、根或叶(也是就它们含有诊断dna序列而言)，和由这些实施方案产生的子代，也属于本发明的范围。
本发明提供保护玉米植物免遭鳞翅类昆虫侵袭的方法，包括在靶鳞翅类害虫的膳食中提供一种或多种转基因玉米植物细胞，每种玉米植物细胞在其基因组中均含有对应于seqidno:1和seqidno:2二者所示序列以及在seqidno:1和seqidno:2之间的、如seqidno:5所示的连续核苷酸序列的多核苷酸。以这样的转基因玉米植物细胞为食的靶鳞翅类昆虫被抑制进一步以源自玉米植物细胞的玉米植物为食。
本发明还提供对玉米植物的靶鳞翅类害虫有毒的组合物。以靶鳞翅类害虫膳食提供转基因植物细胞组合物，其中每种转基因玉米植物细胞在其基因组中均含有对应于seqidno:1和seqidno:2二者所示序列连同在seqidno:1和seqidno:2之间的、如在seqidno:5中所示的连续核苷酸序列的多核苷酸，所述组合物为玉米植物或玉米植物细胞有效提供抵御鳞翅类昆虫侵袭的保护，只要玉米植物或细胞由连续核苷酸序列中包含的表达盒表达cry1a.105和/或cry2ab2。为转基因玉米种子形式的这些组合物已保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号pta-9708。这些昆虫抗性玉米植物或其部分在这些植物细胞基因组中将含有以下dna：其具有至少一种选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5的核苷酸序列。昆虫抗性玉米植物的子代和种子，其中所述子代和种子具有本文提出的诊断序列，也包括在本发明范围内。这些昆虫抗性玉米植物可以用包含以下步骤的方法生产：使转基因玉米植物事件mon89034与不同的玉米植物杂交，并通过分析至少一种选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5的核苷酸序列选择昆虫抗性子代。
昆虫抗性转基因玉米事件mon89034可以与其它玉米转基因品种组合，例如抗除草剂如草甘膦、草铵膦和麦草畏等的玉米，或由于插入编码蛋白如ps149b1和修饰的cry3bb的序列而抗食根昆虫的玉米，或由于插入编码其它毒素蛋白如vip3a、cry1ab和cry1fa等的序列而抗鳞翅类昆虫侵袭的其它转基因玉米品种。所有这些不同转基因事件的各种组合与本发明的玉米植物(即mon89034事件)一起育种，提供抗鞘翅类和鳞翅类侵袭并抗选择的除草剂的改良杂种转基因玉米品种。这些品种相比于非转基因品种和单独性状的转基因品种表现出产量提升和耐干旱特征。
提供一种生产抗昆虫侵袭的玉米植物的方法，其中玉米植物含有杀虫有效量的毒素编码序列，如在seqidno:5中所示。该方法包括由转基因玉米事件mon89034提取毒素编码序列，并将这些编码序列单独或一起导入一种或多种玉米细胞中，产生含有这一种或多种毒素编码序列的转基因玉米细胞。然后将转基因玉米细胞培育(再生)为含有一种或多种编码序列的转基因玉米植物，转基因植物则表现出对昆虫侵袭的抗性。
本发明提供一种测定含有玉米事件mon89034dna的转基因玉米植物的dna相对于诊断生物样品中的该mon89034dna的存在情况的dna的接合性的方法。该方法由以下组成：作为第一步，使样品与包含seqidno:6、seqidno:7和seqidno:10的3种不同引物接触，所述引物在一起用于含有玉米事件mon89034dna的核酸扩增反应时，产生诊断玉米事件mon89034的第一扩增子，在用于含有非mon89034dna的玉米基因组dna的核酸扩增反应时，产生诊断非mon89034dna的玉米基因组dna的第二扩增子。后续步骤由以下组成：进行核酸扩增反应，并比较在热扩增反应过程中产生的扩增子。检测两种扩增子的存在情况诊断样品的接合性。仅检测到第一扩增子指示样品仅含有mon89034dna，即纯合样品。仅检测到第二扩增子指示样品不含mon89034dna。在样品中同时检测到第一和第二扩增子指示(1)样品含有相对于仅含有杂合起始物质的纯样品的杂合dna，或(2)样品含有纯合和杂合的起始样品dna，或(3)样品含有纯合、杂合和/或非mon89034dna的样品的某些组合。
本发明还提供生长玉米植物，其含有诊断插入到玉米植物细胞基因组中的转基因dna区段的dna。玉米细胞基因组中的dna包含选自以下的任一个或全部序列：
(a)如在seqidno:5所示的核苷酸序列；
(b)如在seqidno:1和seqidno:2所示的两个核苷酸序列；
(c)如在seqidno:3所示的核苷酸序列；和
(d)如在seqidno:4所示的核苷酸序列。
包括下列实施例是为了证明本发明的某些优选实施方案的实施例。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表本发明人已发现的在本发明实施中有效的方法，因此可被认为构成用于实施本发明的优选模式的实施例。然而，根据本文的公开内容，本领域的技术人员应当理解，可在不偏离本发明的精神和范围的情况下，在公开的具体实施方案中进行多种改变，而仍可获得相同或相似的结果。
实施例
实施例1
本实施例阐述了转基因玉米事件mon89034的构建和分子表征。
采用质粒构建体pmon38850(表达盒示于图1)进行农杆菌介导的近交玉米系转化方法产生玉米植物mon89034。所用转化方法类似于在美国专利号6,603,061中描述的方法。质粒构建体pmon38850含有连锁植物表达盒，该表达盒具有在玉米植物细胞中表达cry1a.105杀虫蛋白所必需的调节遗传元件。将玉米细胞再生为由至少约23,000个不同转基因事件组成的完整玉米植株。由事件群中选择显示出植物表达盒完整性和对鳞翅类幼虫摄食损伤抗性的单独的转基因事件(植株)。在其基因组中含有pmon38850的连锁植物表达盒的玉米植株是本发明的一个方面。在大体分析了这些转基因事件后，基于其分子特征和没有任何不需要的表型或农学缺陷作用选择mon89034转基因事件。
包含在mon89034玉米基因组中的转基因遗传元件的序列如在图1中所示，由每个彼此有效连接的以下元件组成。首先，在序列的随意确定的5’末端(即接近图1中所示区段的左中心部分)标记根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)右边界区(rb)的部分。这之后为按顺序由以下组成的表达盒：增强的camv35s启动子元件(本文称为p-camv35sen，位于seqidno:5上的2350-2651位)；小麦叶绿素a/b结合蛋白非翻译前导序列(本文称为l-ta.lhcb1，位于seqidno:5上的2678-2738位)；水稻肌动蛋白内含子序列(本文称为i-os.act1，位于seqidno:5上的2755-3234位)；编码嵌合基因cry1a.105的非天然序列(位于seqidno:5上的3244-6777位)；小麦的3’终止区(本文称为t-ta.hsp17-1:1:1，位于seqidno:5上的6809-7018位)。以上提到的非边界序列的元件的组合，在玉米植物中时一起用于引起cry1a.105杀虫蛋白表达。这些元件随后按顺序连接至另一个表达盒，该表达盒由以下元件组成：玄参花叶启动子(位于seqidno:5上的7086-7649位)、玉米hsp70前导序列(本文称为hsp70或i-hsp70，位于seqidno:5上的7672-8475位)和玉米叶绿体转运肽编码序列(本文称为ctp2或ts-ssu-ctp，位于seqidno:5上的8492-8892位)。这些有效连接的区段然后连接至编码杀虫蛋白cry2ab的核苷酸序列(位于seqidno:5上的8893-10800位)，该序列以其3’末端连接根癌农杆菌的胭脂碱合酶基因的3'非翻译区(本文称为t-agrtu.nos-1:1:13，位于seqidno:5上的10827-11377位)。cry2ab编码序列侧翼的这些元件在玉米植物中存在时一起用于指导cry2ab表达。cry2ab表达盒随后按顺序后接由根癌农杆菌的左边界(lb)区的足够部分组成的核苷酸序列。
在dna扩增方法中用作引物的dna分子可来源于mon89034事件中包含的转基因插入序列的遗传元件的序列。这些引物分子可以用作引物组的组成部分，该引物组还包含来源于侧接转基因插入片段的事件基因组的dna引物分子。
pmon38850质粒dna的一部分插入玉米基因组中，产生转基因玉米植物事件mon89034，该部分由左和右边界区段以及边界区段之间的两个连锁植物表达盒(第一个表达盒编码cry1a.105，第二个表达盒编码cry2ab，其中就某一个表达盒而言，无论是被称为第一个还是第二个表达盒，每个表达盒均是可互换的)组成，该部分通过详细的分子分析来表征。进行这些分析，以鉴定仅含单个且完整的插入区段(由边界和边界之间所需的两个表达盒(玉米基因组中的整合位点数量)组成)的事件、拷贝数(一个基因座中的t-dna拷贝数)和插入基因表达盒的完整性(即与已知存在于质粒pmon38850中的序列没有任何重排或序列变异)。所用的dna分子探针包含完整的cry1a.105编码区及其对应的调节元件、植物表达盒的启动子、内含子和多腺苷酸化序列，以及质粒pmon38850骨架dna区。得自所有事件分析的数据表明，mon89034含有单个t-dna插入和1个拷贝的cry1a.105表达盒。在mon89034基因组中没有检测到与完整基因表达盒连接或未连接的、得自转化载体pmon38850的额外元件。最后，进行pcr和dna序列分析，以确定5’和3’插入序列-植物基因组接合，检验插入序列中的元件构成(参见例如图1)，并确定插入到玉米植物基因组中产生转基因玉米事件mon89034的dna的完整序列。完整的插入序列，连同在插入dna的任一个末端的玉米基因组侧翼序列部分，示于如seqidno:5中所示的序列。
首先通过在harbil5g-hd涂料振荡仪(harbilinc,cincinnati,ohio)中将种子(至多200个种子)加工为精细粉末，由玉米种子提取mon89034的基因组dna和非mon89034的玉米的非转基因dna(对照dna)。简而言之，以提取缓冲液(emscience目录号3700,emscience,gibbstown,newjersey,usa)提取粉末化的种子，用异丙醇(sigma目录号i-0398,sigma,st.louis,mo,usa)由溶液沉淀dna。将沉淀的dna倒入含有70％乙醇的微离心管中。以最大速度(约14,000rpm)沉淀微离心管中的dna约5分钟，真空干燥，并再溶解在te缓冲液(ph8.0)中。然后将dna储存于4℃冰箱中。该方法可由本领域技术人员修改，以便由单个玉米种子提取dna。
用于在样品中鉴定事件mon89034的代表性方法描述于事件特异性终点taqmanpcr，用于其的条件实例描述于表1和表2。用于该测定的dna引物为引物sq2842(seqidno:6)、sq2843(seqidno:7)、6famtm标记引物pb880(seqidno:14)和victm标记引物pb2931(seqidno:15)，6fam和vic为appliedbiosystems(fostercity,ca)的荧光染料产品，与dna引物连接。对于taqmanmgb探针，taqdna聚合酶的5'-胞外核酸酶活性由5'-末端切割荧光团和猝灭剂之间的探针。在与靶dna链杂交时，猝灭剂和荧光团在三维空间足够分离，产生荧光(荧光团激发波长)信号。
sq2842(seqidno:6)和sq2843(seqidno:7)在与pb880(seqidno:14)一起用于这些反应方法时产生dna扩增子，该扩增子诊断事件mon89034dna。用于该分析的对照应包括得自含有事件mon89034dna的玉米的阳性对照、得自非转基因玉米或非事件mon89034的转基因玉米的阴性对照以及不含模板dna的阴性对照。
sq1564(seqidno:17)和sq1565(seqidno:18)在与pb351(seqidno:21)一起用于这些反应方法时，产生诊断mon89034中的cry1a.105的扩增子。
这些测定为用于appliedbiosystemsgeneamppcrsystem9700或stratagenerobocycler、mjengine、perkin-elmer9700或eppendorfmastercyclergradient热循环仪进行了优化。本领域技术人员已知的、产生鉴定事件mon89034dna的扩增子的其它方法和装置在本领域技术范围之内。
在生物样品中特异性结合seqidno:1或其完全互补序列、并含有如在seqidno:1中所示的至少11个连续核苷酸、或者视情况含有seqidno:1中序列的反向互补物的任何探针，只要可以检测到结合，就可用于诊断该样品中玉米事件mon89034dna的存在情况。在生物样品中特异性结合seqidno:2或其完全互补序列、并含有如在seqidno:2中所示的至少11个连续核苷酸、或者视情况含有seqidno:2中序列的反向互补物的任何探针，只要可以检测到结合，就可用于诊断该样品中玉米事件mon89034dna的存在情况。
用于或设计用于由含有玉米dna的生物样品产生扩增子以及含有seqidno:1或seqidno:2中的任一个或者视情况含有这两个序列的扩增子的任何引物对，被认为属于本发明的范围。对于本文公开的本发明用途，含有seqidno:1或seqidno:2中的任一个或这二者的任何这样的扩增子，均用于诊断所述生物样品中玉米事件mon89034dna的存在情况。提供以下实施例供本领域技术人员参考。
表1.玉米mon89034事件特异性终点taqmanpcr
可使用任何用于热循环的方法设置和进行dna扩增，包括人工操作或电控操作温度步骤和循环。已成功使用stratagenerobocycler、mjengine、perkin-elmer9700或eppendorfmastercyclergradient热循环仪或appliedbiosystemsgeneamppcrsystem9700或mjresearchdnaengineptc-225热循环仪实施下列循环参数。在使用eppendorfmastercyclergradient或mjengine进行pcr时，热循环仪以计算模式循环。在使用perkin-elmer9700时，循环条件以设为最大的升温速度实施。
表2.接合性测定热循环仪条件
实施例2
本实施例阐述了含有诊断其基因组中的转基因玉米事件mon89034的dna的玉米植物的鉴定，以及该玉米植物的接合性测定。
在接合性测定中描述了用于鉴定在其基因组中含有事件mon89034dna的纯合子代和杂合子代的方法，在表3和表4中示例了用于该接合性测定的条件。用于接合性测定的示例性dna引物是引物sq2842(seqidno:6)、sq2843(seqidno:7)、sq6523(seqidno:10)、sq6524(seqidno:11)、6famtm标记引物pb880(seqidno:14)和victm标记引物pb2931(seqidno:15)。如上所示，6fam和vic是appliedbiosystems(fostercity,ca)的荧光染色产品，连接dna引物。
当sq2842(seqidno:6)、sq2843(seqidno:7)、sq6523(seqidno:10)、sq6524(seqidno:11)一起用于热扩增反应时，产生用于诊断非玉米事件mon89034dna的玉米dna的dna扩增子(与玉米dna是来源于非转基因样品还是某些其它转基因样品无关)，在所述热扩增反应中，含有模板dna的生物样品含有诊断该样品中玉米事件mon89034的存在情况的dna。或者，反应将由含有来源于玉米基因组的dna的生物样品产生两个不同的dna扩增子，所述来源于玉米基因组的dna对于和转基因玉米事件mon89034中存在的插入dna对应的等位基因是杂合的。这两个不同的扩增子将对应于来源于野生型玉米基因组基因座的第一扩增子和诊断玉米事件mon89034dna的存在情况的第二扩增子。仅产生对应于针对杂合基因组描述的第二扩增子的单个扩增子的玉米dna样品诊断样品中玉米事件mon89034的存在情况，并诊断确定用作模板的玉米dna由对于和转基因玉米事件mon89034插入dna对应的等位基因为纯合的玉米种子产生。该分析的对照应包括得自含有事件mon89034dna的纯合和杂合玉米的阳性对照、得自非转基因玉米或任何其它转基因玉米品种的阴性对照以及不含模板dna的阴性对照。该测定为用于stratagenerobocycler、mjengine、perkin-elmer9700或eppendorfmastercyclergradient热循环仪进行了优化。本领域技术人员已知的产生扩增子的其它方法和装置包括在本技术领域的范围内，所述扩增子鉴定用mon89034植株产生的杂交后代的接合性。
表3.接合性测定反应溶液
在stratagenerobocycler、mjengine、perkin-elmer9700或eppendorfmastercyclergradient热循环仪或appliedbiosystemsgeneamppcrsystem9700或mjresearchdnaengineptc-225热循环仪中进行的dna扩增已成功运行下列循环参数。在使用eppendorfmastercyclergradient或mjengine时，循环以计算模式运行。在使用perkin-elmer9700时，循环以设为最大的升温速度运行。
表4.接合性测定热循环仪条件a
a：使用appliedbiosystemsgeneamppcrsystem9700
对应于转基因事件mon89034的种子已根据布达佩斯条约于2006年3月28日保藏在美国典型培养物保藏中心(atcc),10801universityboulevard,manassas,va.20110。atcc保藏号或专利保藏号为pta-7455。保藏物将在保藏处保藏30年，或在最后请求后保藏5年，或保藏专利的有效期，取更长久的那一个，并根据需要在该期限内更换。
已经图解和详述了本发明的原理，对于本领域技术人员应当显而易见的是，在不偏离这些原理的情况下，可在排列和细节上对本发明进行修改。我们要求保护在随附权利要求书的精神和范围内的所有修改。
本说明书中引用的所有出版物和公开专利文件都在此引用作为参考，其引用程度如同每种单独的出版物或专利申请具体个别地指明引入作为参考一样。
<110>monsantotechnologyllc
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<120>对应于转基因事件mon89034的玉米植物和种子及其检测方法
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<160>22
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>5'接合序列；对应于seqidno:5的2051-2071
<400>1
aatgagtatgatggatcagca21
<210>2
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<212>dna
<213>人工的
<220>
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<400>2
actcattgcatccccggaaa20
<210>3
<211>2071
<212>dna
<213>人工的
<220>
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<400>3
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<212>dna
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<220>
<223>3'侧翼序列加接合序列；对应于seqidno:5的11295-12208
<400>4
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<210>5
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<212>dna
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<223>5’侧翼序列加插入的dna序列加3’侧翼序列
<400>5
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gttagatctaggaagcagctttttctaaaagctggctttctcacagtgcaaatctgaaag840
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<213>人工的
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<400>11
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<212>dna
<213>人工的
<220>
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<212>dna
<213>人工的
<220>
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<212>dna
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<212>dna
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ctgtcaagccaataaaagggttgttt26
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<212>dna
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<213>人工的
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<212>dna
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<220>
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<400>19
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<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>20
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<211>17
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列；对应于seqidno:5的4587-4603
<400>21
cagagctcctatgttct17
<210>22
<211>26
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>22
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