一种检测待测样本中目标miRNA的含量的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测待测样本中目标mirna的含量的方法。

背景技术：

microrna(mirna)是一类长度约为18-25个核苷酸的非编码内源性单链rna分子，它通过与靶mrna特异性的碱基互补配对，引起靶mrna的降解或者抑制其翻译，从而实现对靶基因转录后的调控。现有研究表明，mirna可作为癌症标志物用于癌症早期诊疗。

传统的mirna定量检测依赖于pcr等扩增手段，该类手段虽然检测灵敏，然而也有高成本、操作复杂、检测耗时长、需借助大型仪器等不足。传统的mirna定量检测主要有三类：第一类是基于直接杂交的定量检测技术，优点是通量高(即一次可以检测多个mirna的表达情况)，缺点是成本高，还存在同一mirna家族成员之间互相错配杂交的噪音信号，且不适合表达量较低的mirna检测；第二类是结合pcr与探针的定量检测技术，需要使用mirna特异的探针，这类方法的突出优点是特异性强，常常能区分同一mirna家族的不同变体，缺点是探针的设计与合成需借助于商业公司，方便性与特异性很难得到统一的解决；第三类是基于pcr与荧光染料的定量检测技术，优点是灵敏度高，但检测耗时长且需借助大型仪器。

随着生物传感器的快速发展，以核酸等生物材料作为信号识别元件，可以在短时间内不基于扩增技术实现对mirna的定量检测。基于mirna核酸材料的特异性杂交性能，一种经典的mirna生物传感模式是利用固定于传感界面的捕获探针(cp)和荧光标记的信号探针(sp)分别与mirna两端进行杂交的夹心型生物传感器，可以快速、高灵敏度和高选择性的定量检测复杂基质中的mirna。但是，夹心型生物传感器在开发中面临如下挑战：对于固载捕获探针数目有限的界面而言，当mirna的量超过溶液中的信号探针时，mirna与mirna/sp杂交体一起竞争界面捕获探针的杂交位点，产生假阴性信号，极大程度上干扰检测结果。一种抑制假阴性信号的形成的策略是采用大量的信号探针(如2013年yanliwen，gangliu，haopei等人在《methods》上发表的基于dna纳米结构的超灵敏电化学夹心型mir生物传感器中，使用高于mirna浓度500倍以上的信号探针进行检测)，但超高浓度的信号探针将提升单次检测成本，且可能对界面形成非特异性吸附，引发假阳性信号，不利于提升检测的准确性。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何检测待测样本中目标mirna的含量。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种检测待测样本中目标mirna的含量的方法，即生物传感器检测方法：将捕获探针固定在传感界面上，信号探针与目标mirna的复合物被捕获探针捕获，通过检测荧光信号即检测出被捕获的目标mirna的量。

本发明所提供的检测待测样本中目标mirna的含量的方法，可包括步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)：

所述步骤(a)可包括如下步骤：

(a-1)信号探针、封锁dna和待测样本混匀，孵育；

(a-2)完成步骤(a-1)后，采用捕获探针检测荧光信号值；

所述步骤(b)可包括如下步骤：

(b-1)所述信号探针、所述封锁dna和目标mirna标准溶液混匀，孵育；

(b-2)完成步骤(b-1)后，采用所述捕获探针检测荧光信号值；

所述步骤(c)：根据所述目标mirna标准溶液中目标mirna的浓度和相应荧光信号值绘制标准曲线，将所述步骤(a-2)得到的荧光信号值代入所述标准曲线，得到待测样本中目标mirna的含量；

所述目标mirna可为单链rna分子，自5’末端到3’末端依次可包括如下元件：a1片段和a2片段；

所述信号探针可为单链dna分子，可包括如下元件：s1片段；所述s1片段的核苷酸序列与所述a1片段的核苷酸序列反向互补；所述信号探针具有荧光基团；

所述封锁dna可为单链dna分子，自5’末端到3’末端依次可包括如下元件：b1片段、b2片段和b3片段；所述b1片段的核苷酸序列可与所述a2片段的核苷酸序列反向互补；所述b3片段的核苷酸序列可与所述a1片段的核苷酸序列反向互补；所述b2片段可由n3个脱氧核糖核苷酸组成，且不能与所述目标mirna、所述信号探针和所述捕获探针进行杂交；n3可为大于等于6且小于等于12的自然数；

所述捕获探针为单链dna分子，可包括如下元件：e2片段；所述e2片段的核苷酸序列可与所述a2片段的核苷酸序列反向互补。

上述方法中，所述信号探针的3’末端可具有荧光基团。

上述方法中，所述信号探针自5’末端到3’末端依次可包括如下元件：所述s1片段和s2片段；所述s2片段由n1个脱氧核糖核苷酸组成，且不能与所述目标mirna和所述捕获探针进行杂交；n1为大于等于5且小于等于12的自然数。所述s2片段具体可由n1个a组成。

上述方法中，所述捕获探针自5’末端到3’末端依次包括如下元件：e1片段和所述e2片段；所述e1片段由n2个脱氧核糖核苷酸组成，且不能与所述目标mirna和所述信号探针进行杂交；n2为大于等于6且小于等于12的自然数。

上述方法中，所述信号探针和所述目标mirna形成的组装体的稳定性大于所述封锁dna和所述目标mirna形成的组装体的稳定性。所述封锁dna和所述目标mirna形成的组装体的稳定性大于所述捕获探针和所述目标mirna形成的组装体的稳定性。

上述方法中，所述步骤(a-1)或(b-1)中，所述孵育的体系中还可含有杂交缓冲液；所述杂交缓冲液可为含0.20-0.30mmgcl2的ph7.5-8.0、9-11mmtris-hcl缓冲液。

所述杂交缓冲液具体可为含0.25mmgcl2的ph7.94、10mmtris-hcl缓冲液。

上述方法中，所述目标mirna可由所述a1片段和所述a2片段组成。所述信号探针可由所述s1片段和所述s2片段组成。所述封锁dna可由所述b1片段、所述b2片段和所述b3片段组成。所述捕获探针可由所述e1片段和所述e2片段组成。

上述方法中，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列1所示(即n2为8)。所述信号探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示(即n1为5)。所述封锁dna的核苷酸序列如序列表中序列3所示(即n3为7)。此时检测的目标mirna为与人类癌症密切相关let-7a，其核苷酸序列为：5’-ugagguaguagguuguauaguu-3’。

上述方法中，所述荧光基团具体可为cy5.5荧光基团。

上述方法中，所述步骤(a-1)或(b-1)中，所述孵育的体系中，所述信号探针浓度可为3nm-7nm。所述封锁dna的浓度可为15-25nm。

上述方法中，所述步骤(a-1)或(b-1)中，所述孵育的体系中，所述信号探针浓度具体可为5nm。所述封锁dna的浓度具体可为20nm。

上述方法中，所述待测样本可为待测液相样本。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测待测样本中目标mirna的含量的试剂盒。

本发明所提供的检测待测样本中目标mirna的含量的试剂盒，可包括上述任一所述封锁dna、所述捕获探针和所述信号探针。

上述试剂盒中，还可包括上述任一所述杂交缓冲液。

上述试剂盒中，还可包括光纤。所述光纤具体可为南京春辉科技实业有限公司的产品。

上述试剂盒中，所述待测样本可为待测液相样本。

上述任一所述试剂盒在检测待测样本中目标mirna的含量中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述待测样本可为待测液相样本。

实验证明，采用本发明提供的封锁dna可对目标mirna进行结构封锁，形成locker/mirna组装体。locker/mirna组装体不与mirna/sp杂交体竞争界面捕获探针位点，同时在信号探针存在的情况下仍可以形成mirna/sp杂交体，即可抑制假阴性信号的形成，保障检测结果的准确性。因此，采用本发明提供的方法检测待测样本中目标mirna的含量成本低且准确率高，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为不同浓度let-7a的检测结果图。

a为不同浓度let-7a的检测图；b为let-7a检测的标准曲线图。

图2为反应体系中有无封锁dna对荧光信号值的影响。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

piraha溶液：由98.3％(m/m)的硫酸水溶液和30％(m/m)过氧化氢水溶液按体积比3:1混合而成。

apts溶液：含1％(v/v)3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane，apts)的无水甲苯溶液。

杂交缓冲液：含0.25mmgcl2的ph7.94、10mmtris-hcl缓冲液。

短链掺杂溶液：含100nm捕获探针和100nmdna短链的50mmnacl水溶液。

实施例1、检测待测样本中目标mirna的含量的方法

考虑到假阴性信号出现的实质是反应体系中游离mirna比例的增加，因此设计了封锁dna(locker)。封锁dna可对目标mirna进行结构封锁，形成locker/mirna组装体。locker/mirna组装体不与mirna/sp杂交体竞争界面捕获探针位点，同时在信号探针存在的情况下仍可以形成mirna/sp杂交体，即可抑制假阴性信号的形成，保障检测结果的准确性。

本实施例以与人类癌症密切相关的mirna—let-7a作为目标mirna，然后设计并合成了相应的捕获探针、信号探针、封锁dna和dna短链。捕获探针、信号探针、封锁dna、dna短链和let-7a均为单链核酸分子，核苷酸序列信息依次见表1中第2行、第3行、第4行、第5行和第6行。

表1

信号探针自5’末端起第1至12位所示的dna分子与let-7a自5’末端起第1至12位所示的dna分子反向互补。

捕获探针自5’末端起第9至18位所示的dna分子与let-7a自5’末端起第13至22位所示的dna分子反向互补。

封锁dna自5’末端起第1至6位所示的dna分子与let-7a自5’末端起第17至22位所示的dna分子反向互补。封锁dna自5’末端起第14至17位所示的dna分子与let-7a自5’末端起第3至6位所示的dna分子反向互补。

一、制备修饰捕获探针的光纤

1、将光纤(南京春辉科技实业有限公司的产品；光纤规格：600μm芯径)浸泡于piraha溶液，110℃静置1h。

2、完成步骤1后，取所述光纤，用超纯水冲洗3次(每次冲洗时间为1min)，然后用氮气吹干。

3、完成步骤2后，将所述光纤浸泡于apts溶液中，然后置于摇床，37℃、150rpm振荡1h。

4、完成步骤3后，取所述光纤，先用甲苯冲洗3次(每次冲洗时间为1min)，再用氮气吹干，然后200℃烘烤2h。

5、完成步骤4后，将所述光纤自然降温，浸泡于1％(v/v)戊二醛水溶液中，然后置于振荡器，37℃、150rpm振荡12h。

6、完成步骤5后，将所述光纤浸泡于短链掺杂溶液，然后置于摇床，37℃、150rpm振荡1h。

7、完成步骤6后，将所述光纤浸泡于20mm的甘氨酸水溶液中，室温静置1h。

8、完成步骤7后，将所述光纤浸泡于含20mg/ml的nacnbh3的50mmnacl溶液中，25℃静置1h。

9、完成步骤8后，将所述光纤浸泡于浓度为2mg/ml的bsa水溶液，37℃、150rpm6h(目的为减少非特异性吸附)，得到修饰捕获探针的光纤。

二、制备locker组装体

1、在锡纸包裹避光下制备反应体系甲。反应体系甲由信号探针、封锁dna、let-7a和杂交缓冲液组成。反应体系甲中，信号探针的浓度为5nm，封锁dna的浓度为20nm，let-7a的浓度为1pm(即1e-3nm)、0.01nm、0.04nm、0.08nm、0.15nm、0.3nm、0.5nm、1nm、2.5nm、5nm、10nm或15nm。

2、完成步骤1后，取反应体系甲，先90℃水浴3min，再室温水浴3min，得到locker组装体。

三、检测

1、将步骤一制备的修饰捕获探针的光纤装入全光纤倏逝波生物传感器。

2、完成步骤1后，将修饰捕获探针的光纤先用ph1.9、浓度为0.05％(0.05mg/100ml)的sds水溶液冲洗，再用ph7.4、10mmpbs缓冲液冲洗直至基线平稳。

3、完成步骤2后，开启蠕动泵，将步骤二制备的locker组装体通入全光纤倏逝波生物传感器，然后停止蠕动泵，进行mirna检测，收集不同let-7a浓度下产生的荧光信号值。

实验结果见图1中a。结果表明，随着let-7a浓度的增加，荧光信号值逐渐增大。

4、完成步骤3后，向全光纤倏逝波生物传感器中通入ph1.9、浓度为0.05％(0.05mg/100ml)的sds水溶液冲洗，再用ph7.4、10mmpbs缓冲液冲洗直至基线平稳。

5、以let-7a浓度为横坐标，荧光信号值为纵坐标，绘制标准曲线。

标准曲线如图1中b所示，let-7a浓度在180pm-2.38nm线性范围良好。

根据最低检测限为仪器信噪比3倍的原则，let-7a的最低检测限为24pm。

6、按照上述步骤，将步骤二中的let-7a替换为待测样本，其它步骤均不变，得到待测样本的荧光信号值。进一步根据标准曲线，即可获得待测样本中目标mirna的含量。

四、反应体系中有无封锁dna对荧光信号值的影响

按照上述步骤三中1至4，将步骤3中“步骤二制备的locker组装体”替换为“非locker组装体”，其它步骤均不变，进行mirna检测，收集不同let-7a浓度下产生的荧光信号值。

非locker组装体的制备方法如下：

(1)在锡纸包裹避光下制备反应体系丙。反应体系丙由信号探针、let-7a和杂交缓冲液组成。反应体系丙中，信号探针的浓度为5nm，let-7a的浓度为1pm(即1e-3nm)、0.01nm、0.04nm、0.08nm、0.15nm、0.3nm、0.5nm、1nm、2.5nm、5nm、10nm或15nm。

(2)完成步骤1后，取反应体系丙，先90℃水浴3min，再室温水浴3min，得到非locker组装体。

实验结果见图2((a)为非locker组装体，(b)为locker组装体)。结果表明，如果反应体系中不加封锁dna，随着let-7a浓度的增加，出现假阴性信号(图2中(a)箭头标注)；而反应体系中加入封锁dna，则没有出现假阴性信号(图2中(b)箭头标注)。因此，本发明提供的方法可以在不提高信号探针的前提下，准确的检测目标mirna的含量。

<110>清华大学

<120>一种检测待测样本中目标mirna的含量的方法

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