本发明涉及利用一种基于染色质3d构象技术关键作用分子检测方法，用于肿瘤与疾病相关的分子检测与临床诊断等领域。
背景技术：
染色质三维3d构象是一类影响遗传学及表观遗传学过程的重要现象。基因组的空间构象一直被视为基因表达的重要调控因素，在基因组中调控元件往往并非仅仅处于目标基因附近；基因组空间构象对于基因调控起着重要作用，同时染色体的其他行为活动也都涉及其三维构象，除了影响基因调控以外，染色体折叠也在癌症发展中具有重要作用。
染色体折叠有助于研究癌症成因，同时也有助于对癌症进行预测。随着正常细胞转变为肿瘤细胞，基因也会以特定方式改变其空间构象；当正常细胞转变为癌细胞时，特定基因的位置会发生显著改变。
体细胞拷贝数变异scna或基因删除/扩增，都是癌细胞基因组不稳定性的标志，目前已证实基因组成环是特定scna形成的原因；染色体易位也是特定癌症的标志，也很可能是通过染色体的空间构象形成的。
因此在基因组3d构象的基础上开发癌症诊断工具与分析算法对于癌症基础和临床应用研究具有重要意义，我们已围绕染色质3d结构的检测和分析开展了相应的前期工作。
技术实现要素：
目的：为解决现有临床诊疗应用研究中关键作用分子检测与分析等方面的技术不足，本发明主要应用hi-c技术，有效整合多源高通量组学信息，对染色体互作用位点进行全基因组范围综合检测；所采用的方法涉及到多染色体链和多片段的拼接和重组定位等一系列先前步骤；其次是根据全局染色体片段定位信息，并结合高通量组学的信息进行全染色体组型筛查，对照多模态的参考组，最终实现染色体双链中的高危及致癌关联片段的检测与诊断。
一种基于染色质3d构象技术的关键作用分子检测方法，包括如下步骤：
（1）、利用高通量染色质构象捕获hi-c技术，对全基因组的关键分子及作用元件的互相作用状态进行检测与定位分析，从而获得相关蛋白在全基因组内的分布特征及水平；
（1-1）、用甲醛对细胞进行固定，使dna与蛋白，蛋白与蛋白之间进行交联；
（1-2）、进行酶切，使交联两侧产生粘性末端；
（1-3）、末端修复，引入生物素标记，连接；
（1-4）、解交联，使dna和蛋白、蛋白和蛋白分开，提取dna，打断，捕获带有生物素标记片段，进行建库；
（1-5）、结合二代测序技术，对上述样本进行测序。
（2）、利用染色质免疫共沉淀结合高通量测序的chip-seq技术，对全基因组转录因子的绑定状态进行检测与分析；
（2-1）、利用染色质免疫共沉淀chip-seq技术，完善相关细胞系或组织样本中目标蛋白与基因组中dna等关键研究对象的全基因组定位；
（2-2）、利用基因组位点以及前期测序丰度的关键信息，确定目标蛋白与基因组中dna相互作用位点；并在rt-pcr扩增实验的基础上进一步验证结论的可重复性和可信度；
（2-3）、结合二代测序技术，基于chip-seq技术确定转录因子绑定位点等信息。
（3）、利用rna-seq技术在全基因范围对rna转录本进行测序和统计分析；
（3-1）、样品提取总rna后，对于真核生物，用带有oligo(dt)的磁珠富集mrna，对于原核生物，先去除rrna，向得到的mrna中加入fragmentationbuffer使其片断成为短片段，再以片断后的mrna为模板，用六碱基随机引物合成cdna第一链；
（3-2）、加入缓冲液、dntps、rnaseh和dnapolymerasei合成cdna第二链，经过qiaquickpcr试剂盒纯化并加eb缓冲液洗脱经末端修复、加碱基a，加测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行pcr扩增，从而完成整个文库制备工作，构建好的文库用illuminahiseq2000进行测序；
（3-3）、全基因组范围开展基于rna-seq数据的rna转录本差异表达分析，获取mrna和lncrna候选基因信息。
（4）、基于上述实验步骤和相关检测分析结论，结合多源信息融合统计和计算途径，对染色质3d构象下，对包含的拓扑结构域中的mrna和lncrna的表达达水平进行定性和定量化的评价与鉴定，并结合后续验证实验，对mrna和lncrna作用分子作为生物标记物的可靠性进行验证。
上述计算和统计分析需要结合相关实验验证环节来开展，从而使得实验与计算部分的结论具有较高的可信度和可重复性，同时能够在试验和计算可控范围内，大幅提高基于染色质3d构象技术的关键作用分子的检测和分析精度，缩小检测和鉴定的时间。有益效果：
1、本发明利用染色质捕获技术hi-c高通量测序技术、染色质免疫共沉淀chip技术和rna-seq高通量技术，提出了一种基于多源基因组学资源融合的染色质3d构象下对关键作用分子进行检测与分析技术，填补了国内外在此项研究上的空白；能够实现多源实验平台组学信息的快速整合、染色质3d构象下对关键作用分子进行高精度检测与分析等用途，并且具有软硬件实现成本较低，适用范围较广的优点。
2、该技术方法不需要特殊环境资源，具有对环境无污染和绿色环保等特点。
3、本发明基于染色质捕获技术hi-c高通量实验平台，并结合现有dna分子表达水平检测与实验设备，提出了多源组学信息融合互验的检测和分析途径；相关的检测和分析对象可以采用实验室细胞系和组织样本，具有较大的适用范围和市场前景。
附图说明
图1为基于染色质3d构象技术的关键分子检测与分析流程图。
具体实施方式：
如图1所示，一种基于染色质3d构象技术的关键作用分子检测方法，包括如下步骤：
（1）、利用高通量染色质构象捕获hi-c技术，对全基因组的关键分子及作用元件的互相作用状态进行检测与定位分析，从而获得相关蛋白在全基因组内的分布特征及水平；
（1-1）、用甲醛对细胞进行固定，使dna与蛋白，蛋白与蛋白之间进行交联；
（1-2）、进行酶切，使交联两侧产生粘性末端；
（1-3）、末端修复，引入生物素标记，连接；
（1-4）、解交联，使dna和蛋白、蛋白和蛋白分开，提取dna，打断，捕获带有生物素标记片段，进行建库；
（1-5）、结合二代测序技术，对上述样本进行测序。
（2）、利用染色质免疫共沉淀结合高通量测序的chip-seq技术，对全基因组转录因子的绑定状态进行检测与分析；
（2-1）、利用染色质免疫共沉淀chip-seq技术，完善相关细胞系或组织样本中目标蛋白与基因组中dna等关键研究对象的全基因组定位；
（2-2）、利用基因组位点以及前期测序丰度的关键信息，确定目标蛋白与基因组中dna相互作用位点；并在rt-pcr扩增实验的基础上进一步验证结论的可重复性和可信度；
（2-3）、结合二代测序技术，基于chip-seq技术确定转录因子绑定位点等信息。
（3）、利用rna-seq技术在全基因范围对rna转录本进行测序和统计分析；
（3-1）、样品提取总rna后，对于真核生物，用带有oligo(dt)的磁珠富集mrna，对于原核生物，先去除rrna，向得到的mrna中加入fragmentationbuffer使其片断成为短片段，再以片断后的mrna为模板，用六碱基随机引物合成cdna第一链；
（3-2）、加入缓冲液、dntps、rnaseh和dnapolymerasei合成cdna第二链，经过qiaquickpcr试剂盒纯化并加eb缓冲液洗脱经末端修复、加碱基a，加测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行pcr扩增，从而完成整个文库制备工作，构建好的文库用illuminahiseq2000进行测序；
（3-3）、全基因组范围开展基于rna-seq数据的rna转录本差异表达分析，获取mrna和lncrna候选基因信息。
（4）、基于上述实验步骤和相关检测分析结论，结合多源信息融合统计和计算途径，对染色质3d构象下，对包含的拓扑结构域中的mrna和lncrna的表达达水平进行定性和定量化的评价与鉴定，并结合后续验证实验，对mrna和lncrna作用分子作为生物标记物的可靠性进行验证。
上述计算和统计分析需要结合相关实验验证环节来开展，从而使得实验与计算部分的结论具有较高的可信度和可重复性，同时能够在试验和计算可控范围内，大幅提高基于染色质3d构象技术的关键作用分子的检测和分析精度，缩小检测和鉴定的时间。
本发明利用染色质捕获技术hi-c高通量测序技术、染色质免疫共沉淀chip技术和rna-seq高通量技术，提出了一种基于多源基因组学资源融合的染色质3d构象下对关键作用分子进行检测与分析技术，填补了国内外在此项研究上的空白；能够实现多源实验平台组学信息的快速整合、染色质3d构象下对关键作用分子进行高精度检测与分析等用途，并且具有软硬件实现成本较低，适用范围较广的优点。
本发明基于染色质捕获技术hi-c高通量实验平台，并结合现有dna分子表达水平检测与实验设备，提出了多源组学信息融合互验的检测和分析途径；相关的检测和分析对象可以采用实验室细胞系和组织样本，具有较大的适用范围和市场前景。