一种提高聚合酶链式反应效率的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高聚合酶链式反应效率的方法。

背景技术：

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)是最常用的体外dna扩增技术，使目标产物在几小时内增加数百万倍。虽然pcr非常敏感，但许多因素如聚合酶、dna模板的长度和浓度、mg²⁺浓度、退火温度等都会影响pcr的特异性和产量。纳米材料作为添加剂可以改善pcr的效率。2005年首次发现金纳米粒子能提高pcr的产量及特异性(angewandtechemieinternationaledition，2005，44：5100-5103)。此后发现量子点(biochimie，2009.91：969-973)、碳纳米材料(nanotechnology，2004，15∶154-157)、聚合物纳米粒子(acsappliedmaterials&interfaces，2015，7∶13142-13153)等对pcr都有一定的改善。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种提高聚合酶链式反应效率的方法。

本发明的具体技术方案如下：

一种提高聚合酶链式反应效率的方法，在pcr反应体系中添加黑磷烯纳米片进行反应，该黑磷烯纳米片在pcr反应体系中的终浓度为0.016～0.32mg/ml。

在本发明的一个优选实施方案中，所述黑磷烯纳米片在pcr反应体系中的终浓度为0.04～0.32mg/ml。

进一步优选的，所述黑磷烯纳米片在pcr反应体系中的终浓度为0.08～0.32mg/ml。

进一步优选的，所述黑磷烯纳米片在pcr反应体系中的终浓度为0.08～0.24mg/ml。

在本发明的一个优选实施方案中，所述黑磷烯纳米片的制备方法包括如下步骤：

(1)取超纯水，通氮气除去其中的氧气；

(2)称取适量黑磷体材料，加入到步骤(1)的除去氧气的超纯水中，在冰浴条件下进行超声处理，得到呈浑浊棕色的黑磷材料；

(3)将步骤(2)制得的黑磷材料于1500～2000rpm离心去除未充分散开的黑磷体材料后，得上清液；

(4)将步骤(3)得到的上清液再次9000～11000rpm离心取沉淀，即为所述黑磷烯纳米片。

进一步优选的，所述黑磷体材料与超纯水的比例为15～25mg；35～45ml。

本发明的有益效果是：本发明的方法在聚合酶链式反应体系中添加黑磷烯纳米片，可以显著增强聚合酶链式反应的特异性及产量。

附图说明

图1为本发明实施例1中制备的bp通过透射显微镜观察得到的形貌照片。

图2为本发明实施例1的实验结果对比图之一。

图3为本发明实施例2的实验结果对比图之二。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

方法步骤如下：

1、材料的制备

黑磷烯纳米片(bp)的制备方法包括如下步骤：

(1)取40ml超纯水，通氮气30min除去其中的氧气；

(2)称取20mg黑磷体材料，加入到步骤(1)的除去氧气的超纯水中，在冰浴条件下进行超声处理，得到呈浑浊棕色的黑磷材料；

(3)将步骤(2)制得的黑磷材料于2000rpm离心去除未充分散开的黑磷体材料后，得上清液；

(4)将步骤(3)得到的上清液再次10000rpm离心取沉淀，即为如图1所示的所述黑磷烯纳米片，尺寸大小为几百个纳米左右。

2、pcr基本过程

pcr体系的基本成分见表1和2。扩增程序为：(1)94℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)65℃退火30s；(4)72℃延伸1min；(5)72℃延伸10min。其中2-4步循环31次。

表1pet-32a质粒dna的pcr反应体系组分

表2基因组dna的pcr反应体系组分

pcr程序结束后扩增后的产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，凝胶用溴化乙锭(ethidiumbromide，eb)染色，在150v条件下电泳约30min，在凝胶成像系统下拍照。

图2是在不同pcr条件下添加bp对pet-32a质粒扩增的影响，目标产物为689bp，m为dl-2000dnamarker。图2a)为第1轮pcr反应的结果。如该图所示，所有条带都处于约700bp的位置，表明加入bp不影响引物和模板准确结合，扩增产物为设计的片段。对照组c中产物条带明亮，但拖尾现象比较明显，表明扩增过程中有大分子量的非特异性产物生成。随bp(0.4mg/ml)添加量的增加，发现当bp的添加量在1～5μl时，电泳条带的非特异性产物逐渐减少，目的条带也越来越亮。当bp的添加量为5μl时，只得到了单一的目的产物条带，没有出现拖尾条带，目的条带也最亮，表明5μl的bp可有效抑制非特异性反应的发生并提高了pcr反应的效率。当bp的添加量继续增加至5μl以上时，pcr产物的特异性也明显提高，但目的条带的亮度减弱，表明pcr反应受到抑制。上述实验结果表明，在pcr扩增中，bp的添加量低于5μl时，pcr的特异性及效率随着bp的增加而加强；当添加量为5μl时得到的条带没有拖尾且目的条带最亮，表明5μl为最佳的添加量；继续添加bp至10～20μl时，可以显著增强pcr产物的特异性，但随着添加量的增加目的条带的亮度慢慢变弱。表明bp对pcr反应特异性的提高具有浓度依赖性。

图2b)为改变pcr反应模板浓度，bp对pcr反应的影响。当稀释模板浓度后，加入bp可使稀释模板浓度到100倍后仍有目的条带。图2c)为改变pcr反应的扩增循环数，bp对pcr反应的影响。当扩增循环数减小到10个时加入bp依然能够得到目的条带。图2d)为改变pcr反应的退火温度，bp对pcr反应的影响。当把退火温度降至25℃时，bp依然能够显著增强其特异性及目的条带产量。此外对于多轮pcr，bp能够增强其特异性及目的条带产量到第三轮(如图3所示，其中的1～3代表pcr反应的轮数)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种提高聚合酶链式反应效率的方法，在PCR反应体系中添加黑磷烯纳米片进行反应，该黑磷烯纳米片在PCR反应体系中的终浓度为0.016～0.32mg/mL。本发明的方法在PCR反应体系中添加黑磷烯纳米片，可以显著提高聚合酶链式反应的特异性及产量。

技术研发人员：孙莉萍;桂洁;翁建
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：2017.05.09
技术公布日：2017.09.01