本发明涉及一种基因检测方法，具体涉及一种单核苷酸多态性检测用试剂盒及检测方法。
背景技术：
完整的dna形态在1944年由美国人埃弗里确定发现，1953年克里克教授绘制出dna的双螺旋线结构图；1985年莱斯特大学的亚历克·杰弗里斯教授又发明利用dna对人体进行鉴别的办法；dna自1988年起开始应用在司法方面。生物群体基因多态性现象十分普遍，其中，人类基因的结构、表达和功能，研究比较深入，人类基因多态性既来源于基因组中重复序列拷贝数的不同，也来源于单拷贝序列的变异，以及双等位基因的转换或替换，通常分为3大类：dna片段长度多态性、dna重复序列多态性、单核苷酸多态性。单核苷酸多态性的检测已被广泛应用于癌症突变筛查、遗传疾病诊断、新生儿出生障碍筛查、hla配型、个体化用药指导、身份鉴别等诸多研究和临床应用领域。根据科学分析，每一个人拥有400万亿个细胞（皮肤、肌肉、神经等），人体细胞除了红血球外都拥有一个由46种染色体组成的细胞核，染色体本身又由dna染色体丝构成，这种染色体丝在所有细胞中都是相同的。dna由被称作a（adenine）、t（thymine）、g（guanine）和c（cytosine）的核酸组成，正是它们构成我们人体的基因。根据dna可以断定两代人之间的亲缘关系，因为一个孩子总是分别从父亲和母亲身上接受一半基因物质的。检测技术也开发如第一代测序技术、高分辨率融解曲线、荧光定量pcr法、芯片法、二代测序法、snapshot、质谱法等技术手段。在诸多检测手段中，其中以第一代测序技术，即sanger测序和新一代测序(next-generationsequencing，ngs)最具有代表性。sanger测序具有高度的准确性和操作简单快捷、分型明确等特点，对于单个突变点检测是非常经济高效的；而新一代测序通量非常高，平均检测点的成本很低，成为高通量筛查基因变异的首选，近几年发展起来的第三代测序技术，进一步提升了dna片段处理能力，但对于单个突变位置检测的准确度方面，ngs和第三代测序等检测手段均没有sanger测序技术高。因此sanger测序是其它多种检测筛查后进行验证突变的最主要手段。sanger测序测定范围只能为单基因区段或某一位点的检测，对于在基因组上不同的位点和不同区段需要进行多次测序反应，增加了技术操作步骤和成本。
技术实现要素：
本发明公开了一种单核苷酸多态性的检测方法，利用非特异扩增循环和特异检测循环两个循环程序完成pcr扩增，并通过一代测序检测，从而可以同时获得多个基因位点的突变信息，是一种快速检测单核苷酸多态性的技术。
本发明采用如下技术方案，一种单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：
（1）确定待检测基因的检测位点；所述位点中，最上游位点与最下游位点的间隔超过800bp；所述检测位点数量为2～40；
（2）针对每一个检测位点分别设计正向引物与反向引物；相邻的两个位点对应的引物中，上游位点的反向引物5端与下游位点的正向引物5端设有互补的碱基序列；所述碱基序列与待检测基因的dna的同源序列数量小于12个；
（3）以待检测基因的dna为模板，利用步骤（2）的引物进行第一次pcr扩增，得到第一次pcr产物；
（4）以步骤（3）的第一次pcr产物的混合物为模板，以步骤（2）中，最上游位点对应的正向引物与最下游位点对应的反向引物为引物对，进行第二次pcr扩增，得到第二次pcr产物；
（5）对第二次pcr产物进行测序即完成单核苷酸多态性的检测。分析所获得基因序列的突变情况。
本发明中，步骤（1）中，所述检测位点数量优选2～25个。本发明突破了现有sanger测序一次反应体系针对于单个区域的分析，通常为800bp，可以将在基因组不同位置的突变位点进行同时分析，缩减了多次操作的繁杂程度，提高了检测通量，并降低了成本；对于多个不同位点的单核苷酸多态性的检测，通过本方法能够大大缩减操作的工作量。
本发明中，步骤（2）中，所述碱基序列包括13～18个碱基。本发明通过设计具有13～18个反向互补的重叠区域的pcr引物，经过pcr方式扩增后，再通过两端引物进行拼接，将待检测的突变点整合到一条dna模版链上，利用测序或q-pcr探针的方式进行检测；减少反应体系，降低操作的程序，节约了成本。
本发明中，步骤（2）中，除最上游位点对应的正向引物和最下游位点对应的反向引物外，其它正向引物的长度为30～40个碱基，gc含量为30%~70%，其他反向引物的长度为30～40个碱基，gc含量为30%~70%；引物中包括用于相邻两条引物的13～18个反向互补随机碱基。
本发明中，步骤（3）中，所述待检测基因的dna包括基因组dna、线粒体dna、叶绿体dna。
本发明还公开了一种单核苷酸多态性检测用试剂盒的制备方法，将引物组、常规pcr组件组合，得到单核苷酸多态性检测用试剂盒；所述引物组由针对待检测基因的每一个检测位点分别设计的正向引物与反向引物组成；所述引物组中，针对待检测基因的相邻的两个位点对应的引物中，上游位点的反向引物5端与下游位点的正向引物5端设有反向互补的碱基序列；所述碱基序列与待检测基因的dna的同源序列数量小于12个。
本发明中，常规pcr组件可以包括10xpcrbuffer、dntp、pfu聚合酶等，还可以根据需要添加其他现有试剂，不影响本发明技术效果。
本发明中，步骤（4）中，将第一次pcr产物片段拼接作为第二次pcr扩增的模板。
本发明还公开了一种单核苷酸多态性检测用试剂盒，所述单核苷酸多态性检测用试剂盒包括引物组；所述引物组由针对待检测基因的每一个检测位点分别设计的正向引物与反向引物组成；所述引物组中，针对待检测基因的相邻的两个位点对应的引物中，上游位点的反向引物5端与下游位点的正向引物5端设有反向互补的碱基序列；所述碱基序列与待检测基因的dna的同源序列数量小于12个；所述单核苷酸多态性检测用试剂盒还包括常规pcr组件；所述检测位点数量为2～40；所述碱基序列包括13～18个碱基；除最上游位点对应的正向引物和最下游位点对应的反向引物外，其它正向引物的长度为30～40个碱基，gc含量为30%~70%，其他反向引物的长度为30～40个碱基，gc含量为30%~70%。
本发明还公开了一种单核苷酸多态性检测用引物组，所述引物组由针对待检测基因的每一个检测位点分别设计的正向引物与反向引物组成；所述引物组中，针对待检测基因的相邻的两个位点对应的引物中，上游位点的反向引物5端与下游位点的正向引物5端设有反向互补的碱基序列；所述碱基序列包括13～18个碱基；针对待检测基因的检测位点数量为2～40；所述碱基序列与待检测基因的dna的同源序列数量小于12个；除最上游位点对应的正向引物和最下游位点对应的反向引物外，其它正向引物的长度为30～40个碱基，gc含量为30%~70%，其他反向引物的长度为30～40个碱基，gc含量为30%~70%。
本发明还公开了上述单核苷酸多态性检测用引物组在单核苷酸多态性检测中的应用。
本发明还公开了上述单核苷酸多态性检测用试剂盒在单核苷酸多态性检测中的应用。
本发明还公开了上述单核苷酸多态性检测用试剂盒在身份识别或者hla配型检测中的应用。
本发明中，上下游位置关系根据待测基因定义，为本领域常识，位点对应一个区段；本发明通过pcr将不同片段扩增，所扩增的基因长度可达数kb甚至几十kb。本发明首次将天然待检测的位点区段通过人工合成的重叠区引物方法连接起来，从而可以利用测序将突变位点检测出来。具体地，本发明通过设计具有13～18个重叠碱基的pcr引物，将在基因组不同位置的多个突变点，经过pcr方式扩增后，再通过两端引物进行拼接，将待检测的突变点整合到一条dna模版链上，利用测序或q-pcr探针的方式进行检测；减少反应体系，降低操作的程序，节约了成本。
本发明分别在待检测位点的上游位置和下游位置设计正向和反向两条引物，分别在第一个待检测区段的下游引物的5'-端增加数个随机碱基作为第一个重叠区，优选地，随机碱基以13-18个为佳，而在待与其拼接的第二个待检测区段设计的上游引物5'-端增加与上述的13-18个随机碱基完全反向互补的碱基序列；同样地，在其它相邻待检测位点的上下游分别设计扩增待检测位点区域，并在设计的引物的5'-端分别增加13-18个随机碱基区段。根据本发明的方法，可以针对数个、十几个甚至上三十个的突变区段同时检测。
本发明的引物中，引物自身及引物之间不存在互补序列，避免引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等二级结构，以获得较好的效率和特异性；引物总碱基序列优选长度为30-40个碱基，同样减少或避免序列自身的二级结构；同时避免与待扩增的模板和其它随机区域存在同源性序列存在。
举例来说，根据本发明的技术方案，可以采用如下实施步骤
1、确定待检测的基因位点，设计所对应的扩增引物，在除第一条片段上游引物和最后一条片段的下游扩增引物外，其它待检测片都的下游引物在5’-端增加13～18个个随机碱基，对应地在下一个片段的上游引物增加与前一个片段的上游引物反相互补的序列；通过化学方法合成这些引物。
2、通过试剂盒等方法提取待检测样品的基因组dna，可以为染色体基因组，线粒体dna，叶绿体dna等。
3、利用上述1设计合成的引物，对待检测样品dna进行扩增。可以采用25μl体系，pcr反应的试剂配制如下：模板：2～4μl；正向特异性引物：0.025～0.2μmol；反向特异性引物：0.025～0.2μmol；dntp：0.5～2μl；10xpcrbuffer1.5～3μl；pfu聚合酶0.5～2u；其余为水。pcr反应条件如下：94～95℃预变性2～3min（分钟）；94～95℃-15秒、55℃-20秒、72℃-25秒，扩增循环数设定为25～30个循环，最后4℃维持；将获得的pcr产物，从每一管中吸取10微升并混合，利用pcr产物回收试剂盒回收混合的pcr产物。
4、拼接pcr产物片段。利用设计的第一个检测片段的上游引物和最后一个片段的下游引物，对上步3的所有pcr产物混合条带进行扩增。可以采用50μl的pcr反应体系，试剂配制如下：模板：2～4μl；第一片段上游引物：0.025～0.2μmol；最后一个片段下游引物：0.025～0.2μmol；dntp：1.5～4μl；10xpcrbuffer4.5～6μl；pfu聚合酶1～3u；其余为水。pcr反应条件如下：94～95℃预变性2～3min（分钟）；94～95℃-15秒、55～58℃-20秒、72℃-25～35秒，扩增循环数设定为30～35个循环，最后4℃维持。
5、扩增后进行pcr产物回收后直接进行测序。根据设计位点，分别对不同区域进行对比，以确认特定位点的基因型或突变类型。
本发明突破了sanger测序针对于单个位点或单个基因区段的分析，可以将在基因组不同位置的区段或突变位点进行同时分析，缩减了多次操作的繁杂程度，提高了检测通量，并降低了成本，更充分地发挥sanger测序准确简单的优势。
附图说明
图1为本发明检测原理示意图。
具体实施方式
图1为本发明检测原理示意图，overlap指两个引物扩增两个片段之间有一段重叠区域，chr是代表染色体或独立的dna长链；本发明公开的单核苷酸多态性的检测方法，利用非特异扩增循环和特异检测循环两个循环程序完成pcr扩增,并通过一代测序检测,从而可以同时获得多个基因位点的突变信息，是一种快速检测单核苷酸多态性的技术。本发明首次将天然待检测的位点区段通过人工合成的重叠区引物方法连接起来，从而可以利用测序将突变位点检测出来，人基因组dna提取参照常规方式进行。
实施例一
研究表明，不同人群对叶酸的利用能力不同，因此所需的摄入剂量也不同。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)和甲硫氨酸合成酶还原酶(mtrr)是影响叶酸代谢的关键酶，其基因的多态性是造成个体间叶酸利用能力差异的主要原因。
本实施例通过单核苷酸多态性检测用试剂盒将几个功能酶常见的基因多态位点进行联合扩增分析，可以在一个反应中进行，节省了样本和操作步骤；一次可以同时对最常见的mthfr、aldh1、cyp2c19、mtrr基因相关多态性位点进行检测。
引物序列设计如下：
seqidno1：gcaggttaccccaaaggc
seqidno2：gacctcagcatcgacaagaaaagctgcgtgatgatg
seqidno3：gtcgatgctgaggtcattgaaagtggactcggaca
seqidno4：cacctgaccatcgatctggctattgtgaatggtgtt
seqidno5：atcgatggtcaggtgattttcccactatcattgatta
seqidno6：caccttgcgatcgggttaagtaatttgttatgggttc
seqidno7：cccgatcgcaaggtgaacatcaggattgtaagcaccc
seqidno8：gggtacagcacctactaagtggtttctcaggaagcaa
seqidno9：gtaggtgctgtacccaaaggccatcgcagaagaaata
seqidno10：ccatgtaccacagcttgctcac
第一次pcr反应体系如下：
2μlgdna，2μl10xpcrbuffer，1μldntp，seqidno1-seqidno10引物各0.2μl（10μm），1upfu聚合酶，加水至20μl。
第一次pcr扩增条件如下：
95℃-2分钟，25个循环（95℃-15秒，55℃-20秒,72℃-25秒）,4℃保存。
从每管pcr产物中吸取5μl，放置于新的离心管中并混匀作为下一轮pcr的模板。
第二次pcr反应体系如下：
2μl第一次pcr产物混合物，5μl10xpcrbuffer，3μldntp，seqidno1、seqidno10两条引物各0.5μl（10μm），3upfu聚合酶，加水至50μl。
第二次pcr扩增条件如下：
94℃-2分钟，30个循环（94℃-15秒，55℃-20秒,72℃-25秒）,4℃保存。
通过对30个样本dna的扩增，检测结果显示：本发明方法得到的分析结果与现有单独的扩增并测序所得的分析结果完全一致。
实施例二
egfr、met、nras、pi3kca和braf基因在多种恶性肿瘤发生发展过程中被活化。研究者们更多关注k-ras、n—ras、braf、pik3ca等一系列的基因筛查，使患者接受抗egfr单抗治疗获益逐渐增多。以结直肠癌(crc)为例，研究表明，crc的发生、发展与许多分子信号传导通路的调控有密切关系。egfr是一种跨膜酪氨酸激酶受体，与配体结合后可引起下游主要的两条信号传导通路ras/raf/mapk和p13k/akt/mtor的活化，从而诱导肿瘤细胞增殖、侵袭、转移以及血管生成。本实施例通过单核苷酸多态性检测用试剂盒进行突变状态检测虽非诊断疾病，但对是否使用egfr-tki类靶向药物是重要参考依据。
引物序列设计如下：
seqidno11：aactgtttgggacctccg
seqidno12：gacctcagcatcgacctgttttcacctctgttgctt
seqidno13：gtcgatgctgaggtcgtcgatgctgaggtc
seqidno14：cacctgaccatcgattgtactggtccctcattgc
seqidno15：atcgatggtcaggtgatactcaaacagatactggtaa
seqidno16：caccttgcgatcgggtttggatcagattttactcatagt
seqidno17：cccgatcgcaaggtgaactggtggtggttggag
seqidno18：tcacgcttgttagcatggttctggattagctgg
seqidno19：tgctaacaagcgtgatgtttgttggacatactggata
seqidno20：gggtacagcacctacctcatggcactgtactcttctt
seqidno21：gtaggtgctgtacccgcaatttctacacgagatcctc
seqidno22：cggtagaccacctataaatctttctcctgctcagtga
seqidno23：ataggtggtctaccgtacacgagatcctctctctgaa
seqidno24：cggtatgcgacctggagcacttacctgtgactccata
seqidno25：ccaggtcgcataccgctgagcaagaggctttgg
seqidno26：ttgttgtccagccaccat
第一次pcr反应体系如下：
2μlgdna，2μl10xpcrbuffer，0.5μldntp，seqidno11-seqidno26引物各0.5μl（10μm），1upfu聚合酶，加水至20μl。
第一次pcr扩增条件如下：
94℃-2分钟，25个循环（94℃-15秒，55℃-20秒,72℃-25秒）,4℃保存。
第二次pcr反应体系如下：
2μl第一次pcr产物混合物，5μl10xpcrbuffer，2μldntp，seqidno11、seqidno26各0.1μl（10μm），1upfu聚合酶，加水至50μl。
第二次pcr扩增条件如下：
94℃-2分钟，35个循环（94℃-15秒，58℃-20秒,72℃-25秒）,4℃保存。
通过对12个样本dna的扩增，检测结果显示：本发明方法得到的分析结果与单独的扩增并测序所得的分析结果完全一致。
实施例三
耐药结核病是结核病疫情有所回升的一个重要原因。据世界卫生组织2012年报告统计，全球目前大约有30万耐多药结核病患者。对于耐药性结核的治疗关键对患者的结核耐药情况并制定相应的药物选用方案，再进行有针对性的个性化用药治疗。选用一种能够快速准确的结核耐药检测方法具有非常重要的意义。本实施例通过单核苷酸多态性检测用试剂盒可以同时检测通过检测结核分枝杆菌复合群rpob基因的突变进行对利福平耐药筛选；检测katg315密码子的突变确定对异烟肼的耐药；检测embb基因检查对乙胺丁醇耐药；检测rpsl基因对链霉素耐药性筛查，通过一个反应即可完成以上检测。
引物序列设计如下：
seqidno27：ccactccgaagaagccgaact
seqidno28：agcatcgacctcagcccaggcaggtccttcaccc
seqidno29：gctgaggtcgatgctccgacgccgtggtgatat
seqidno30：accatcgatcgcagcccagcggaaatagttgga
seqidno31：gctgcgatcgatggttcgccgcgatcaaggagt
seqidno32：gcgatcgggtacagcgccgatcagaccgatgtt
seqidno33：gctgtacccgatcgccgagacgtttcggcgcatg
seqidno34：ccgtccttggcggtgtattg
第一次pcr反应体系如下：
2μlgdna，2μl10xpcrbuffer，1μldntp，seqidno27-seqidno34各1μl（10μm），1upfu聚合酶，加水至25μl。
第一次pcr扩增条件如下：
94℃-2分钟，20个循环（94℃-15秒，55℃-20秒,72℃-25秒）,4℃保存。
第二次pcr反应体系如下：
2μl第一次pcr产物混合物，5μl10xpcrbuffer，2μldntp，seqidno27、seqidno34各0.1μl（10μm），1upfu聚合酶，加水至50μl。
第二次pcr扩增条件如下：
94℃-2分钟，30个循环（94℃-15秒，56℃-20秒,72℃-25秒）,4℃保存。
通过对10个样本dna的扩增，检测结果显示：本发明方法得到的分析结果与单独的扩增并测序所得的分析结果完全一致。
实施例四
听力障碍是可筛查性疾病，有60%的耳聋是由遗传缺陷引起的。由于进行新生儿听力筛查只能发现已存在听力障碍的患儿，对于听力正常的遗传因素导致的迟发型耳聋患儿和药物致聋敏感基因携带者则有漏诊的危险。针对这种现状，本实施例通过单核苷酸多态性检测用试剂盒可同时对新生儿常见的4种耳聋基因（gjb2、gjb3、slc26a4、12srrna）相关位点进行检测，为进一步诊断提供初步信息。
引物序列设计如下：
seqidno35：agagtagaagatggattgggg
seqidno36：gacctcagcatcgacaatgctggtggagtgtttgtt
seqidno37：gtcgatgctgaggtctttgtctgcaacaccctg
seqidno38：cacctgaccatcgattggggaagtagtgatcgt
seqidno39：atcgatggtcaggtgtacttccccatctcccacatc
seqidno40：caccttgcgatcgggctggcgtggacacgaagatc
seqidno41：cccgatcgcaaggtgcacgtggcctaccggagaca
seqidno42：tcacgcttgttagcacccccttgatgaacttcc
seqidno43：tgctaacaagcgtgagccgactttgtctgcaacac
seqidno44：gggtacagcacctacgatcgtagcacacgttcttg
seqidno45：gtaggtgctgtacccagcggctggtgaagtg
seqidno46：cggtagaccacctatgggccgggacacaaag
seqidno47：ataggtggtctaccgccaacatcgtggactgctacat
seqidno48：cggtatgcgacctggaagattttcttctcggtaggtc
seqidno49：ccaggtcgcataccgtggactgctacattgccc
seqidno50：gatcgcagcggtaacgcccaccatgaagtaggt
seqidno51：gttaccgctgcgatccactcagccattttacctca
seqidno52：catcggaccggtaattagagaatagtcaacggtcg
seqidno53：attaccggtccgatggacgttactcggactacccc
seqidno54：catcgtgcgggtaggatgaatgagcctacagatga
seqidno55：cctacccgcacgatggggttctttgacgacaacatta
seqidno56：agattttgcgctggaccctcttgagatttcacttggt
seqidno57：tccagcgcaaaatctccaatggagtttttaacatc
seqidno58：gccgtcgtgtaggctgcagtagcaattatcgtctg
seqidno59：agcctacacgacggccgtcatttcgggagttagta
seqidno60：taagcccgtatggcaacatcttaccttgcagcgtg
seqidno61：tgccatacgggcttaagagtcctgattgccagtg
seqidno62：cgtccctttcgatggcttgtaagttcattacctg
seqidno63：ccatcgaaagggacggccaccactgctctttcc
seqidno64：cctacctgtgtctttcctcc
第一次pcr反应体系如下：
2μlgdna，2μl10xpcrbuffer，2μldntp，seqidno35-seqidno64各0.3μl（10μm），1upfu聚合酶，加水至20μl。
第一次pcr扩增条件如下：
94℃-2分钟，30个循环（94℃-15秒，55℃-20秒,72℃-25秒）,4℃保存。
第二次pcr反应体系如下：
5μl第一次pcr产物，5μl10xpcrbuffer，2μldntp，seqidno35、seqidno64各1μl（10μm），1upfu聚合酶，加水至50μl。
第二次pcr扩增条件如下：
94℃-2分钟，30个循环（94℃-15秒，58℃-20秒,72℃-35秒）,4℃保存。
通过对8个样本dna的扩增，检测结果显示：本发明方法得到的分析结果与单独的扩增并测序所得的分析结果完全一致。
可以看出，本发明公开的单核苷酸多态性的检测方法，分别在待检测位点的上游位置和下游位置设计正向和反向两条引物，分别在第一个待检测区段的下游引物的5'-端增加数个随机碱基作为第一个重叠区，在待与其拼接的第二个待检测区段设计的上游引物5'-端增加与上述随机碱基完全反向互补的碱基序列，利用非特异扩增循环和特异检测循环两个循环程序完成pcr扩增，并通过一代测序检测，从而可以同时获得多个基因位点的突变信息，结果精确，是一种快速检测单核苷酸多态性的技术。
sequencelisting
<110>苏州先达基因科技有限公司
<120>一种单核苷酸多态性检测用试剂盒及检测方法
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gacctcagcatcgacaagaaaagctgcgtgatgatg36
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gtcgatgctgaggtcattgaaagtggactcggaca35
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cacctgaccatcgatctggctattgtgaatggtgtt36
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atcgatggtcaggtgattttcccactatcattgatta37
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