自闭症生物标志物及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及自闭症生物标志物及其应用。

背景技术：

自闭症(asd，autismspectrumdisorders)或称孤独症或者孤独症谱系障碍，是广泛性发育障碍的一种亚型，以男性多见，起病于婴幼儿期，主要表现为不同程度的言语发育障碍、人际交往障碍、兴趣狭窄和行为方式刻板，约有3/4的患者伴有明显的精神发育迟滞。据美国疾病监控与预防中心(cdc)数据，2015年其发病率1/45(即2.24％)。我国尚缺乏全国性流行病调查数据，若以1/100估算，预估我国asds患者将超过1000万。

自闭症(asd)作为一种儿童精神疾病严重影响患儿的社会功能，给患儿家庭和社会带来沉重负担，但是目前自闭症通常根据量表进行评估，没有血液诊断方法和有效的治疗方案，这样诊断将依靠主观经验判断，不仅不能对自闭症的发病提供有效预警，而且诊断准确率很低。因此研究自闭症发病机理和可以体现其严重程度的生物标志物，并及时针对病因进行干预与治疗是治疗疾病、减轻社会负担的关键因素。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供了自闭症生物标志物；本发明还提供了用于诊断自闭症的试剂盒；本发明进一步还提供一种筛选易患自闭症的生物样品的系统。

本发明第一方面提供了自闭症生物标志物，包括肠道细菌的丰度和/或总数。

本发明第二方面提供了检测上述生物标志物的试剂组合在制备用于诊断自闭症的试剂盒中的用途。

本发明第三方面提供了一种自闭症诊断试剂盒，包括适用于检测所述的生物标志物的试剂组合；

在一优选例中，所述适用于检测权利要求1所述的生物标志物的试剂组合包括北京康为世纪的型号为cw2092s的stoolgen粪便dna提取试剂盒；

在一优选例中，所述适用于检测权利要求1所述的生物标志物的试剂组合还包括美国赛默飞世尔公司提供的试剂盒和美国illumina公司生产的truseqdna建库试剂盒；

在一优选例中，还包括分析所述生物标志物在体内是否异常的工具。

本发明第四方面提供了所述的生物标志物或所述的试剂盒在筛选易患自闭症的生物样品的系统中的应用。

本发明第五方面提供了一种筛选易患自闭症的生物样品的系统，包括：

核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品和对照样品中提取核酸样本；

核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的序列；以及

判断装置，所述判断装置与所述测序装置相连，基于所述核酸样本的序列对生物样品和对照样品中肠道菌群所含的权利要求1的自闭症生物标志物进行分析，根据分析结果判断所述生物样品是否易患自闭症。

在一优选例中，所述核酸序列确定装置进一步包括：

文库构建单元，所述文库构建单元用于基于所述核酸样本，构建所述核酸的文库；以及

测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，对所述文库进行测序，以便确定所述核酸样本的序列，

在一优选例中，所述文库构建单元进一步包括：

pcr扩增模块，所述pcr扩增模块中设置特异性引物，以便利用所述特异性引物，对所述核酸样本进行扩增。

在本文中，术语“生物标志物”应做广义理解，其包括任何能够反映异常状态的任何可检测生物指标，可以包含基因标志物，物种标志物(种标志物/属标志物)以及功能标志物(ko/og标志物)，其具有非常广泛的用途，可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次发现自闭症的致病与肠道细菌的丰度和/或总数有关，因此将肠道细菌的丰度和/或总数作为自闭症的检测标志物，这样自闭症的诊断将不依靠主观经验判断，不仅可以对自闭症的发病提供有效预警，而且可对其进行确诊，克服了自闭症的诊断较大程度的依赖于主观经验判断的缺陷，极大提高了诊断准确率。

附图说明

图1是第一期发现阶段自闭症组和对照组菌群丰度对比图，纵轴均取log10后的数据结果，每个点代表一个样品，**代表p值＜0.01，t检验。

图2是第一期发现阶段自闭症组和对照组菌群种类(细菌数量)对比图，纵轴均取log10后的数据结果，每个点代表一个样品，**代表p值＜0.01，t检验。

图3是第二期验证阶段自闭症组和对照组菌群丰度对比图，纵轴均取log10后的数据结果，每个点代表一个样品。***代表p值＜0.001，t检验。

图4是第二期验证阶段自闭症组和对照组菌群种类(细菌数量)对比图，纵轴均取log10后的数据结果，每个点代表一个样品。*代表p值＜0.05，t检验。

具体实施方式

除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。

下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw，molecularcloning：alaboratorymanual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例运用鸟枪法宏基因组测序来检测分析健康人群和自闭症患者的粪便样本，继而进行统计检验对比，以确定与自闭症患者群相关的生物标志物。具体步骤如下：

1.样品来源

自闭症组：来自深圳市儿童医院心理科及言语治疗科门诊自闭症患儿，收集时间为2015年7～12月。纳入标准：①根据国际最新诊断标准，即《美国精神障碍诊断与统计手册第5版》(diagnosticandstatisticalmanualofmentaldisorders，5thedition，dsm-5)，诊断为asd”需要非常多支持”的患儿；②年龄＜14岁；③性别不限。排除标准：①患有其他精神疾病(如精神分裂症等)；②患有其他神经发育障碍疾病；③患有遗传代谢性疾病；④患有严重神经疾病以及颅脑损伤史等重大躯体疾病史。

对照组：来自深圳市儿童医院儿保科体检儿童。纳入标准：①无精神疾病，身体健康；②与患者组年龄及性别匹配。排除标准同患者组。所有入组儿童家长对本研究知情并签署知情同意书。

本研究经深圳市儿童医院伦理委员会批准。

本研究分两期：发现阶段和验证阶段。

第一期为发现阶段，共收集22例自闭症患儿，男18例，女4例；年龄2～6岁，平均(2±1)岁。共收集15名对照儿童，男8名，女7名；年龄1～6岁，平均(2±1)岁。两组性别(fisher精确检验p＞0.05)、年龄(student’sttest，p＞0.05)差异无统计学意义。

第二期为验证阶段，收集22例自闭症患儿，男18例，女3例；年龄2～6岁，平均(2±1)岁。共收集16名对照儿童，男9名，女7名；年龄1～6岁，平均(2±1)岁。两组性别(fisher精确检验p＞0.05)、年龄(student’sttest，p＞0.05)差异无统计学意义。

2.粪便采集与前期处理

参与者自行将粪便排在指定的粪便采集盆，然后准备医用一次性粪便采样管，戴手套，采集粪便，采集中断，避免因疏忽造成的污染，一旦发现污染，应重新采样，采集完成后迅速冷冻保存于-80℃冰箱。收集相关基础信息，包括：姓名、性别、年龄、身高、体重、患病史、家庭住址、父母联系方式等详实的《健康情况信息表》；《饮食及生活习惯调查表》需重点收集的资料包括饮食习惯，是否母乳喂养，父母生活习惯、健康状况及吸烟史，家庭所处氛围，近期抗生素，酸奶，益生菌使用等。

粪便标本收集完后，采用北京康为世纪的型号为cw2092s的stoolgen粪便dna提取试剂盒按照其说明书进行基因组dna的提取。

3.宏基因组建库和测序

取2ul已提取的dna样品进行定量，所用的试剂盒为美国赛默飞世尔公司提供的试剂盒(qubitdsdnabrassaykit)。利用美国illumina公司生产的truseqdna建库试剂盒进行建库，文库插入片段大小为200-500bp，该试剂盒连接在美国贝克曼库尔特公司生产的自动化spri工作站上。每个文库构建完成后，采用美国安捷伦科技公司生产的agilent2100生物分析仪进行质控(qc，qualitycontrol)。通过qc后，即文库浓度需在3ng/μl以上，该文库用于后期测序，测序所用的平台为illuminahiseq2500测序平台，测序方式为150bp双端测序。每个样本测得1g以上的数据。

4.生物信息分析和统计

首先，过滤掉一些质量差或含有接头的序列。其次，所有测定的序列均对照人类基因组序列(参考hg19)以剔除人为污染的序列。再次，采用megan软件(即megan5)(http：//ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan5/下载)v5的默认参数，对鸟枪法宏基因组测序数据进行菌群分类(taxonomic)及功能(functional)profile分析，得到的taxonomicprofile结果为每一个样本中注释到界(superkingdom)门(phylum)纲(class)目(order)科(family)属(genus)种(species)的细菌丰度。

然后，通过t检验法分析疾病组和对照组的细菌总数和丰度是否差异显著。

结果及分析：

在第一期发现阶段，自闭症患者肠道细菌的丰度显著低于对照组(如图1所示)，而且自闭症患者肠道细菌的总数也显著低于对照组(如图2所示)，由此可见，自闭症患者肠道菌群多态性显著低于对照组。

在第二期验证阶段，自闭症患者肠道细菌的丰度显著低于对照组(如图3所示)，而且自闭症患者肠道细菌的总数也显著低于对照组(如图4所示)，由此可见，自闭症患者肠道菌群多态性显著低于对照组。

综上，自闭症患者肠道菌群多态性显著低于对照组，肠道菌群细菌的丰度和细菌的总数可以做为自闭症患者的一个标志物。