禽白血病病毒混合感染中单一病毒的纯化方法与流程

本发明属于病毒纯化技术领域，尤其涉及一种禽白血病病毒混合感染中单一病毒的纯化方法。

背景技术：

禽白血病病毒(avianleukosisvirus，alv)是反转录病毒科、白血病/肉瘤病毒群。1868年roloff报道了一例“淋巴肉瘤”，这是第一篇关于禽白血病的报道。随后，alv在各地均有相关报道，宿主范围逐渐扩大，从肉鸡传播到蛋鸡以及地方品种鸡，临床肿瘤表现也愈发明显，给养禽业造成了较大的经济损失。

alv分为a、b、c、d、e、j、k共7个亚群，其中a、b、j亚群在临床易分离到，k亚群为近期发现的新亚群。alv可引起机体免疫抑制，降低疫苗免疫的成功率，严重影响生产性能。近年来，alv混合感染有增多趋势，大多存在两个亚群甚至三个亚群的混合感染。这就需要对禽白血病病毒的流行趋势和遗传变化机制进行研究，而获得单一亚型病毒是研究的基础与前提。临床中，鸡群会出现不同亚群的alv混合感染的情况，因此病毒的纯化是亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种禽白血病病毒混合感染中单一病毒的纯化方法，以便于从禽白血病病毒混合感染中获得单一亚型病毒，为禽白血病病毒分子生物学特征及其致病性的研究提供技术支持。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：禽白血病病毒混合感染中单一病毒的纯化方法，通过测定混合感染病毒的tcid50进行终点稀释，采用稀释后的病毒液接种df-1细胞，收集上清与细胞培养物并用分型鉴定引物与ifa的对其进行鉴定，从而获得单一亚型的禽白血病病毒。

分型鉴定引物包括alv-a引物对、alv-b引物对、alv-j引物对，它们分别具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.6的碱基序列。

上述禽白血病病毒混合感染中单一病毒的纯化方法，按以下步骤操作进行：

(1)获得混合感染病毒在df-1增殖3代，第3代通过接种df-1细胞，随后通过检测alv-p27抗原并按照reed-muench方法测得病毒tcid50；

(2)病毒液以测定tcid50进行终点稀释，稀释后病毒液以24孔板复孔作用于单层df-1细胞2h，随后换液维持培养至9天；

(3)收集细胞培养物上清并分别编号保存于-80℃，细胞培养物收集抽取dna并用分型引物鉴定；

(4)鉴定为单一亚型病毒感染的对应孔细胞上清接种df-1细胞增殖3代进行ifa分型鉴定(，鉴定为单一亚型的病毒进行下一步研究。)

步骤(1)检测alv-p27抗原采用idexxalv-p27试剂盒。

步骤(2)稀释采用的稀释液为gibco生产dmem。

步骤(2)维持培养采用的培养液为含1％fbs的dmem。

针对目前禽白血病病毒不同亚型混合感染的趋势增多的情况，发明人建立了一种白血病病毒混合感染中单一病毒的纯化方法，通过测定混合感染病毒的tcid50进行终点稀释，采用稀释后的病毒液接种df-1细胞，收集上清与细胞培养物并用分型鉴定引物与ifa的对其进行鉴定，从而获得单一亚型的禽白血病病毒。该法对实验条件要求简单，具有很高的实际应用价值。实验结果证明，本发明可以成功的对不同亚型混合感染的alv进行纯化，可为禽白血病病毒分子生物学特征及其致病性的研究提供技术支持。

附图说明

图1是使用分型引物对纯化后细胞培养物pcr鉴定的结果图，图中：m是dl2000dnamaker；1是alv-a扩增结果；2是alv-b扩增结果；3是alv-j扩增结果；4是阴性对照。

图2是免疫荧光方法检测的结果图，图中：a是毒株gx14mm6-2m在df-1细胞中针对a亚型单抗ifa结果；b是毒株gx15mm6-2-mix在df-1细胞中针对b亚型单抗ifa结果；c是毒株gx15mm6-2-mix在df-1细胞中针对j亚型单抗ifa结果；d是阴性对照结果。

具体实施方式

1.1毒株

混合感染a、b、j亚型的禽白血病病毒来自中国分离株gx15mm6-2-mix株(申请人实验室保存)。

1.2方法

1.2.1引物设计

引物参照文献设计，alv的分型引物见表1，并由上海华大生物工程有限公司合成。

表1引物序列

1.2.2毒株gx15mm6-2mix的复苏

以毒株gx15mm6-2mix接种df-1细胞，37℃继续孵育1h，1h后弃上清液，更换为含有1％胎牛血清的dmem培养基，在37℃，5％co2条件下培养9天；然后收集细胞培养物放在-80℃备用。

1.2.3毒株gx15mm6-2mix的tcid50测定

将复苏的混合感染毒株gx15mm6-2mix在df-1增殖3代，第3代通过接种df-1细胞，随后将第3代收集的病毒液按照稀释度为10^-1-10^-10进行倍比稀释，并重复作用8排，9天后收集上清通过检测alv-p27抗原(idexxalv-p27试剂盒)按照reed-muench方法测得病毒tcid50。

1.2.4毒株gx15mm6-2mix的终点稀释

根据测定的tcid50确定终点稀释倍数，使其每0.1ml病毒液中含有1个病毒。稀释(稀释液为gibco生产dmem)后的病毒液重复作用于24孔细胞板，37℃吸附1h后弃上清液，更换为含有1％胎牛血清的dmem培养基，在37℃，5％co2条件下培养9天。收集细胞上清，连续传3代后，收集细胞培养物，按试剂盒说明书提取dna分别进行a、b、j亚型的pcr检测。

alv-a/alv-b的pcr反应程序为94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，50℃退火45秒，72℃延伸2分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。alv-j的pcr反应程序为94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸2分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr产物。

1.2.5分型鉴定

对鉴定为单一亚型病毒感染的对应孔细胞上清接种df-1细胞增殖3代，后对其细胞培养物抽提dna，并用alv-a/b/j分型鉴定引物对其进行pcr分型鉴定(pcr程序同1.2.4)。后对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果判断a、b、j亚型混合感染毒株gx15mm6-2-mix是否纯化成功(结果见图1)。

结果表明，毒株gx15mm6-2-mix中的alv-j纯化成功。

将上述在37℃，5％co2条件下培养7天后的细胞孔，用pbs洗涤3次，每次5min；然后采用乙醇∶丙酮＝2∶3在4℃条件下固定细胞5min，pbs洗涤3次，每次5min。将alv-a/b/j单抗按1∶250稀释，分别加至试验组和空白对照组不同细胞孔中，每孔150μl，在37℃湿盒中孵育3h，pbs洗涤3次，每次5min。加入fitc标记的兔抗鼠荧光抗体，按1∶300稀释，每孔150μl，在37℃湿盒中继续孵育1h。pbs洗涤3次后在倒置荧光显微镜下观察(结果见图2)。结果表明抗alv-a和alv-b单克隆抗体呈阴性反应，抗alv-j单克隆抗体呈阳性反应，感染组df-1细胞胞浆中可见明显的绿色荧光，而阴性对照组中未见绿色荧光。

结果表明，将毒株gx15mm6-2-mix中的alv-j纯化成功。

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