一种对逆转录酶抑制剂耐药的HIV‑1毒株及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物基因工程领域，具体涉及一种对逆转录酶抑制剂耐药的hiv-1毒株及其制备方法和应用。

背景技术：

人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,hiv)是引起人类获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome，aids)的病原体，自1981年美国首次诊断出艾滋病以来，艾滋病在全球范围内迅速传播，截至2015年11月，我国累计报告艾滋病病毒(hiv)感染者和aids病人580409例。

hiv基因组由两条相同的正链rna组成，每条rna长约9.2-9.8kb，包括如下9个基因：(1)gag基因(编码约500个氨基酸组成的聚合前体蛋白，经蛋白酶水解形成p17，p24、p7、p6等核蛋白，使rna不受外界核酸酶破坏)；(2)pol基因(编码聚合酶前体蛋白，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶h，均为病毒增殖所必需)；(3)env基因(编码约863个氨基酸的前体蛋白并糖基化成gp160，并切割形成gp120和gp41)；(4)tat基因(编码蛋白可与ltr结合，以增加病毒所有基因转录率，也能在转录后促进病毒mrna的翻译)；(5)rev基因(产物是一种顺式激活因子，能对env和gag中顺式作用抑制序去抑制作用，增强gag和env基因的表达，以合成相应的病毒结构蛋白)；(6)nef基因(编码蛋白p27对hiv基因的表达有负调控作用)；(7)vif基因(可以介导机体细胞内的天然抗病毒蛋白apobec3g的降解，影响游离hiv感染性、病毒体的产生和体内传播)；(8)vpu基因(为hiv-1所特有，可以介导机体细胞内的天然抗病毒蛋白tetherin的降解，为hiv的有效复制所必需)；(9)vpr基因(编码蛋白是一种弱的转录激活物，具有致凋亡和细胞周期改变功能，在病毒体内繁殖周期中起一定作用)。

1996年高效抗反转录病毒联合治疗(haart)的出现和应用成为艾滋病(aids)抗病毒治疗史上具有里程碑意义的重大事件。临床观察表明，抗病毒治疗对减轻病情、提高病人生活质量、延长生命具有很好的作用。目前已经应用于临床的药物包括核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、融合抑制剂、整合酶抑制剂和ccr5受体拮抗剂六类。

非核苷类逆转录酶抑制剂包括奈韦拉平(nevirapine,nvp)、依非韦伦(efavirdine,efv)、地拉韦定(delavirdine)依曲伟林(etravirine)、英特莱(intelence)、利匹韦林(ripivirine)等。目前，我国常用的非核苷类抑制剂主要是nvp和efv。nvp一般作为药代动力学增强剂，与其他药物配伍，提高血药浓度，减少单一突变对药物活性的影响。

非核苷类逆转录酶抑制剂nvp适合儿童，成人等，是一线抗病毒治疗的主要药物，但是不能单独使用。目前全国接受抗病毒治疗的人数有471140人，其中接近1/3的治疗人群使用nvp。

我国从2003年开始在全国范围内逐步实施免费的艾滋病抗病毒治疗，现免费提供的抗艾滋病药物有七种，包括核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂三类。nvp是其中免费提供的非核苷类逆转录酶抑制剂。我国2012年发布的第三版《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册》对于成人和青少年的艾滋病患者推荐的治疗方案包括奈拉伟平。

由于合成工艺比较困难，以及药物的结构等问题。中国对非核苷类抑制剂的仿制相对落后，我国面临必须填补非核苷类抑制剂生产空白的现状，为hiv感染者提供更多的抗病毒治疗选择。根据新药研发的有关规定，新型抗hiv药物上市前必须评价其耐药性，即使用非核苷类抑制剂耐药的hiv毒株检测其抗病毒效果，再进行临床观察。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种对逆转录酶抑制剂耐药的hiv-1毒株及其制备方法和应用，本发明构建的毒株具有良好的耐药性和传代稳定性，可应用于抗hiv药物的筛选。

为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

一种对逆转录酶抑制剂耐药的hiv-1毒株，基因组中编码逆转录酶是蛋白质序列为seqidno:4所示的蛋白质；基因组中编码逆转录酶的基因是dna序列为seqidno:3所示的dna分子。

一种上所述对逆转录酶抑制剂耐药的hiv-1毒株的制备方法，将野生型hiv病毒的基因组中编码逆转录酶自n末端第181位氨基酸残基的密码子从酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子、第188位氨基酸残基的密码子从酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子得到dna序列如seqidno:3所示的dna分子；再将该dna分子插入表达载体的多克隆位点得到重组质粒；最后将重组质粒导入离体的哺乳动物细胞并培养制得。

上述将第181位氨基酸残基的密码子从酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子的方法是将野生型hiv病毒的基因组中编码逆转录酶的基因的开放阅读框自5’末端第542位核苷酸的碱基a突变为g。

上述将第188位氨基酸残基的密码子从酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子的方法是将野生型hiv病毒的基因组中编码逆转录酶的基因的开放阅读框自5’末端第563位核苷酸的碱基a突变为g。

上述哺乳动物细胞为293t细胞。

上述哺乳动物细胞的培养方法是在将哺乳动物细胞在37℃下培养18-48h。

上述野生型hiv病毒为野生型的hiv-1b亚型病毒。

上述野生型的hiv-1b亚型病毒具体为野生型的hiv-189.6病毒。

上述的对逆转录酶抑制剂耐药的hiv-1毒株在筛选抗hiv病毒的药物中的应用。

相比于现有技术，本发明的优势在于：

本发明提供一种对逆转录酶抑制剂耐药的hiv-1毒株及其制备方法和应用，是将野生型hiv病毒的基因组中编码逆转录酶自n末端第181位氨基酸残基的密码子由酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子、第188位氨基酸残基的密码子由酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子得到的重组病毒。本发明构建的毒株对奈拉伟平(nvp)具有良好的耐药性，该毒株对奈拉伟平(nvp)的半数抑制浓度(ic50)＞2048μm，具有传代稳定性，可以体外模拟病人由于使用此逆转录酶抑制剂所产生的耐药性，可应用于抗艾滋病药物的筛选，对于抗hiv药物的筛选具有重大价值，进而对艾滋病的治疗具有深远影响。

附图说明

图1为本发明的耐药毒株的逆转录酶dna人工序列。

图2为本发明的耐药毒株的逆转录酶蛋白质人工序列。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

一种对逆转录酶抑制剂耐药的hiv-1毒株，其基因组中编码逆转录酶是蛋白质序列为seqidno:4所示的蛋白质；基因组中编码逆转录酶的基因是dna序列为seqidno:3所示的dna分子。

一种上所述对逆转录酶抑制剂耐药的hiv-1毒株的制备方法，如图1和2所示，将野生型的hiv-189.6病毒的基因组中编码逆转录酶自n末端第181位氨基酸残基的密码子从酪氨酸(y)的密码子突变为半胱氨酸(c)的密码子、第188位氨基酸残基的密码子从酪氨酸(y)的密码子突变为半胱氨酸(c)的密码子得到dna序列如seqidno:3所示的dna分子；再将该dna分子插入表达载体的多克隆位点得到重组质粒；最后将重组质粒导入离体的293t细胞，并将293t细胞在37℃下培养18-48h。野生毒株的逆转录酶蛋白质序列为seqidno:2所示的蛋白质，野生毒株的逆转录酶的dna序列为seqidno:1所示的dna分子。

上述将第181位氨基酸残基的密码子从酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子的方法是将野生型hiv病毒的基因组中编码逆转录酶的基因的开放阅读框自5’末端第542位核苷酸的碱基a突变为g。

上述将第188位氨基酸残基的密码子从酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子的方法是将野生型hiv病毒的基因组中编码逆转录酶的基因的开放阅读框自5’末端第563位核苷酸的碱基a突变为g。

上述的对逆转录酶抑制剂耐药的hiv-1毒株在筛选抗hiv病毒的药物中应用。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中所用的pbs缓冲液均为ph7.2，0.01m的pbs缓冲液。

mt-4细胞(人t淋巴细胞系)：参考文献：haradas,koyanagiy,yamamoton.infectionofhtlv-iii/lavinhtlv-i-carryingcellsmt-2andmt-4andapplicationinaplaqueassay.science1985；229:563-566。

奈拉伟平(nvp)：由雅培公司所生产的逆转录酶抑制剂，药物名称是“奈韦拉平片”，每片的药物含量为“200mg”。

实施例1

hiv耐药株的构建

1、用dmem培养基(含100μg/ml青霉素和100u/ml链霉素)重悬293t细胞，得到4×105个细胞/ml的细胞悬液。

2、将细胞悬液加入6孔培养板，每孔2ml，37℃培养24小时，然后弃除上清，用pbs缓冲液洗涤两次。

3、借助lipofectamine2000(按说明书操作)，将重组质粒丁转染步骤2的细胞(每孔转染4微克重组质粒)，37℃培养36小时，收集培养上清。

4、将步骤3得到的培养上清进行p24抗原测定(p24试剂盒：vironostika＠hiv-1antigenmicroelisasystem,生产商：biomerieux,产地：法国)，结果为阳性，该培养上清即为即为hiv耐药株病毒液，分装后-80℃保存。

实施例2

突变病毒株的病毒感染力鉴定

将实施例1得到hiv耐药株病毒液和实施例1的步骤3得到的hiv野生株病毒液分别进行如下鉴定：

1、在96孔板中每孔加入100μl含体积百分比为10％的fbs的rpmi1640培养液。

2、吸取25μl待测病毒液于第1列孔中，混匀，然后吸取25μl混合液置于下一列孔中，依次稀释11次，每个稀释度设置4个复孔，设置最后一列不加入病毒液的孔作为对照孔。

3、每孔中加入100μlmt-4细胞液(mt-4细胞液是用含体积百分比为10％的fbs的rpmi1640培养液悬浮mt-4细胞得到的，100μlmt-4细胞液中含有10000个细胞)。37℃培养3天，取培养上清。

4、取荧光检测96孔板(品牌：greiner；生产商：greinerbio-one；产地：德国；产品目录号：655086)，每孔加入100μl步骤3得到的培养上清和100μltzm-bl细胞液(tzm-bl细胞液是用含体积百分比为10％的fbs的dmem培养液悬浮tzm-bl细胞得到的，100μltzm-bl细胞液中含有10000个细胞)，37℃培养1天，使用荧光素酶检测试剂盒(英文名：luciferaseassaysystem；品牌：promega；生产商：promegacorporation；产地：美国；产品目录号：e1501)检测病毒感染情况。

tcid50(tissuecultureinfectivedose,半数组织培养感染剂量)指引起50％细胞发生感染(cytopathiceffect,cpe)的病毒量。

hiv耐药株病毒液的病毒感染力为238932tcid50/ml。

hiv野生株病毒液的病毒感染力为297986tcid50/ml。

hiv耐药株的病毒感染力较hiv野生株更强。

实施例3

突变病毒株的耐药性鉴定

将实施例1的步骤2得到hiv耐药株病毒液和实施例1的步骤3得到的hiv野生株病毒液分别进行如下鉴定：

1、在96孔板中每孔加入100μl含体积百分比为10％的fbs的rpmi1640培养液。

2、使用rpmi1640培养液稀释nvp，使nvp的浓度为10μm。

3、吸取25μl药物溶液于第1列孔中，混匀，然后吸取25μl混合液置于下一列孔中，依次稀释11次，每个稀释度设置4个复孔，设置最后一列不加入药物的孔作为对照孔。

4、取新的96孔板(用于细胞培养)，每孔中加入100μlmt-4细胞液(mt-4细胞液是用含体积百分比为10％的fbs的rpmi1640培养液悬浮mt-4细胞得到的，100μlmt-4细胞液中含有10000个细胞)。

5、用pbs缓冲液调整待测病毒液的浓度，得到病毒量为4000tcid50/ml的病毒稀释液。

6、在步骤4的细胞培养板中每孔加入50μl步骤5的病毒稀释液，然后分别每孔加入50μl步骤3配置的依次稀释的药物，37℃培养3天，取培养上清。

7、同实施例2的步骤4。

8、计算50％细胞出现cpe时的药物浓度，即ic50值。

hiv耐药株病毒液的ic50值为0.06127μm。

hiv野生株病毒液的ic50值为0.002899μm。

耐药倍数＝hiv耐药株病毒液的ic50值/hiv野生株病毒液的ic50值＝21.13。

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<110>广西医科大学

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