用于检测新型竹鼠源阿卡斑病毒的RT‑PCR引物及其试剂盒的制作方法

文档序号：11672797阅读：470来源：国知局

本发明属于阿卡斑病毒检测领域，尤其涉及用于检测新型竹鼠源阿卡斑病毒的rt-pcr引物及其试剂盒。

背景技术：

阿卡斑病又名赤羽病，主要引起牛、羊等流产、早产、死胎、新生胎儿关节弯曲及积水性无脑症等。阿卡病给畜牧业造成严重的经济损失，世界动物卫生组织(oie)将其列为法定报告动物疫病，我国《进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》将其列为二类动物疫病。

新型竹鼠源阿卡斑病是国内外首次报道的在自然环境下引起大规模的成年竹鼠死亡的病例。迄今，国内外没有任何关于该病毒的基因参考序列。2013年11-12月广西柳州三江、2014年4-5月广西桂林及2016年6-8月广西柳城3个不同地区县市先后分别在人工养殖的竹鼠群中暴发一种怪病。据不完全统计，有11个竹鼠养殖场(三江3个场，桂林5个场，柳城3个场)共计3万多只竹鼠受影响。该病临床特征是在单侧或双侧后腿麻痹、拖行，颤抖、转圈、幼年竹鼠出现神经症状，抽搐、四肢僵直，口鼻、耳朵、眼眶、前后肢等少毛或无毛的部位皮肤出现红疹，部分足掌龟裂。发病竹鼠，食欲下降或不食，出现症状后1-3天内发生死亡。因其都表现出后腿拖行现象，且为烈性发病，在广西俗称为“拖垃圾病”。剖检可见大脑充血、出血，肺有出血点、出血斑，肝质脆、色浅，脾肿大、部分梗死，肾有出血点。幼年和成年竹鼠均发病，发病率20-30％，但死亡率几乎100％。流行病学调查发现，竹鼠养殖场之间存在相互引种外，大多数发病场之间无明显其他联系。细菌分离结果显示除大肠杆菌外，未见其他有意义的致病菌。rt-pcr或pcr检测痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、狂犬病病毒、仙台病毒常见大鼠病毒均为阴性。经申请人课题组诊断排除了其他细菌和病毒病，通过病毒宏基因组学、rt-pcr扩增和细胞分离培养证实该病为阿卡斑病毒感染。研究结果发现该毒株对竹鼠属于强毒力。

随着我国特种动物养殖业的迅速发展，竹鼠养殖业得以不断壮大，而目前国内外在新型竹鼠源阿卡斑病毒性疾病领域的研究和报道还处于空白状态，没有任何参考文献和序列报道，临床上针对新型竹鼠源阿卡斑病毒病的防治也处于空白状态。因此，急需一种快速检测新型竹鼠源阿卡斑病毒病的方法，来对发病竹鼠进行及时诊治。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种特异、敏感、快速、简便的用于检测新型竹鼠源阿卡斑病毒的rt-pcr引物及其试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

用于检测新型竹鼠源阿卡斑病毒的rt-pcr引物，包括引物akvm1和引物akvm2，它们分别具有以下碱基序列：

引物akvm15′-atgattattacaattctcaacat-3′，

引物akvm25′-gctaaaaggatgaattggt-3′。

用于检测新型竹鼠源阿卡斑病毒的rt-pcr试剂盒，该试剂盒含有引物akvm1和引物akvm2，它们分别具有以下碱基序列：

引物akvm15′-atgattattacaattctcaacat-3′，

引物akvm25′-gctaaaaggatgaattggt-3′。

引物akvm1和引物akvm2的摩尔比为1∶1。

引物akvm1和引物akvm2的浓度均为10μm。

该试剂盒还含有以下试剂：rna提取试剂、pcr扩增试剂、新型竹鼠源阿卡斑病毒阳性对照和阴性对照。

rna提取试剂为axygen体液病毒dna/rna小量试剂盒，pcr扩增试剂为一步法rt-pcr试剂盒。

新型竹鼠源阿卡斑病毒阳性对照为新型竹鼠源阿卡斑病毒糖蛋白m基因片段cdna的质粒，阴性对照为新型竹鼠源阿卡斑病毒阴性的昆明小鼠血清。

针对新型竹鼠源阿卡斑病毒检测和诊断的缺乏有效可靠技术的问题，发明人设计并制备了用于检测新型竹鼠源阿卡斑病毒的pcr引物，包括引物akvm1和引物akvm2，它们分别具有序列表中seq.id.no.1和seq.id.no.2的碱基序列。据此，发明人还制备了相应的rt-pcr试剂盒并建立相应的pcr检测方法，该试剂盒含有引物akvm1和引物akvm2、rna提取试剂、pcr扩增试剂、新型竹鼠源阿卡斑病毒阳性对照和阴性对照。实验表明，本发明具有特异、敏感、快速、简便的特点，弥补了目前临床上检测该病毒的技术空缺，可作为养殖场、基层实验室等场所开展快速检测的良好方法。

附图说明

图1是本发明pcr检测方法退火温度检测结果图，图中：1.ddh20；2.53℃；3.57℃；4.60℃；m：dl2000dna分子质量标准。

图2是本发明pcr检测方法特异性试验结果图，图中：1.新型竹鼠源阿卡斑病毒；2.ddh2o；3.竹鼠内源性反转录病毒；4.新型竹鼠源阿卡斑病毒；5.竹鼠细小病毒；6.竹鼠乳酸脱氢酶升高病毒；m：dl2000dna分子质量标准。

图3是本发明pcr检测方法敏感性试验结果图，图中：1.cdna浓度为23ng/μl；2-5.10^-1～10^-4倍比稀释模板；m：dl2000dna分子质量标准。

图4是本发明pcr检测方法的临床检测结果图，图中：1.正常竹鼠脑组织对照；2.ddh2o；3-8.分别为发病竹鼠的脑、心、肝、脾、肺、肾；m：dl2000dna分子质量标准。

具体实施方式

实施例1引物设计

根据前期病毒宏基因组学测序结果得到的新型竹鼠源阿卡斑病毒全基因序列(该病毒包含小(s)基因片段(编码核蛋白)、中(m)基因片段(编码糖蛋白)、大(l)基因片段(编码转录酶和复制酶)，其序列分别为seq.id.no.7、seq.id.no.8、seq.id.no.9)的保守区域设计引物，得到一对位于核蛋白基因的引物akvs1和akvs2以及一对位于糖蛋白基因的引物akvm1和akvm2，送深圳华大基因合成，用depc处理水溶解，-20℃保存。

表1引物序列

分别用引物akvs1和akvs2及akvm1和akvm2扩增新型竹鼠源阿卡斑病毒阳性样品，初步筛选引物的特异性及稳定性，结果发现：引物akvs1和akvs2能扩增出非特异目的条带，且非特异条带非常明显，已影响结果判定。故被淘汰。

实施例2rt-pcr反应体系与反应程序的建立

1、rna模板制备

均匀剪取发病竹鼠的心、肝、脾、肺、肾等组织与抽滤除菌dmem按体积比1∶5的比例研磨制成病料悬液，分装到1.5mlep管内，经3次冻融后，将病料悬液8000rpm4℃离心5min，取上清200μl，同时等量吸取阳性对照与阴性对照(见实施例6)并编号。按照axygen体液病毒dna/rna小量试剂盒提取模板rna，产物直接用于rt-pcr反应或置于-80℃保存。

2、rt-pcr扩增反应

按pcr反应体系(见表2)配制反应混合物放入takarart-pcr仪，rt-pcr反应程序：反转录反应：50℃30min；预变性：94℃4min；变性：94℃30sec；退火：57℃45sec；延伸：72℃1min；共进行35个循环；延伸：72℃5min。反应结束后，取rt-pcr产物5μl点样于1％琼脂糖凝胶加样孔内(含0.5μg/ml溴化乙锭)电泳进行鉴定，如电泳结果在816bp处出现扩增条带，同时阴、阳性成立，即表明待检样品中有新型竹鼠源阿卡斑病毒。

表2rt-pcr反应液组份

实施例3pcr检测方法退火温度确定

用提取好的样品rna做模板，设置不同的退火温度，然后其他条件均设置成相同进行rt-pcr，rt-pcr完成后取产物5μl点样于1％琼脂糖凝胶加样孔内(含0.5μg/ml溴化乙锭)。电泳后的凝胶于紫外分析仪下观察结果，已确定其最佳退火温度，结果显示退火温度从53℃-60℃，pcr产物结果均很特异(图1)，最终确定本检测方法的退火温度设为57℃。

实施例4特异性实验

用前述已建立的pcr方法，分别提取新型竹鼠源阿卡斑病毒、竹鼠圆环病毒、竹鼠细小病毒、竹鼠内源性反转录病毒、竹鼠乳酸脱氢酶升高病毒核酸。按表2的体系配制反应液，按照实施例2的方法进行特异性试验。结果显示只有竹鼠源阿卡斑病毒能进行特异性扩增，其它病毒不能扩增出目的条带(图2)。结果表明，本发明检测方法具有很高的特异性。

实施例5灵敏度实验

用蛋白质核酸测定仪测定了模板cdna浓度为23ng/μl，对模板cdna进行10倍倍比稀释然后进行pcr，35个pcr循环后，检测该方法的敏感性，最终测定该方法的最低检测量为23pg(图3)。

实施例6试剂盒组装

根据以上实施例的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。

1、引物为akvm1和akvm2，浓度均为10μm。

2、rna提取试剂：使用总rna纯化试剂为axygen体液病毒dna/rna小量试剂盒。

3、pcr扩增试剂：天根生物公司生产的病毒检测用一步法rt-pcr试剂盒(目录号：sd102)。

4、新型竹鼠源阿卡斑病毒阳性对照和阴性对照

阳性对照：将需扩增的糖蛋白基因的目的序列(seq.id.no.5)经rt-pcr扩增并克隆进pmd-18t，构成并测序验证100％同源，最后制备目的片段重组质粒pmd-m1，在含氨苄青霉素的lb细菌培养液中进行培养，收获菌液提取质粒作为阳性对照。

阴性对照：无菌采集的阿卡斑病毒阴性的昆明小鼠血清。

实施例7临床应用

对临床上疑似新型竹鼠源阿卡斑病毒的病鼠进行解剖采样检测，使用前述试剂盒按照本发明的pcr检测方法进行。结果显示，临床检测样品扩增出816bp的特异性带，为新型竹鼠源阿卡斑病毒阳性(图4)。

sequencelisting

<110>广西壮族自治区兽医研究所

<120>用于检测新型竹鼠源阿卡斑病毒的引物及其试剂盒

<130>用于检测新型竹鼠源阿卡斑病毒的引物及其试剂盒

<160>9

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