一种青稞β‑葡聚糖的制备工艺及其结构序列的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种青稞β-葡聚糖的制备工艺及其结构序列。

背景技术：

青稞，大麦属，是青藏高原地区人民的主食之一，也是家畜饲料和工业原料作物。据监测，青稞中β-葡聚糖的含量是所有谷物中含量最高的农作物。谷物中的β-葡聚糖是由吡喃型葡萄糖通过β-(1→3)或者β-(1→4)糖苷键连接而成的线型多糖。近年来，青稞β-葡聚糖在食品科学领域受到很大关注，β-葡聚糖的许多重要的生理学功能和生理活性逐渐被人认知，据报道，青稞β-葡聚糖可以作为固有免疫和获得性免疫的调节剂，具有良好的降血糖降血脂功能，并在抗氧化、抗肿瘤等方面也显示出良好的应用前景。由于行业中对青稞β-葡聚糖的结构、活性研究较为有限，因而其在行业中的应用也较为低端，多数将青稞打粉后制作面食、面饼等普通食品，未能充分发挥其降糖降血脂等作用。虽然目前已经发现β-葡聚糖具有显著的降血脂和降血糖作用，但由于其序列结构复杂，绝大多数降血脂降血糖活性片段及其作用机理未能明确，阻碍了它们被开发成防治高血脂和糖尿病新药的进程。

目前，也有一些关于谷物中β-葡聚糖的制备方法的专利或者文献的公开，但是大多数方法一般是仅对其中β-葡聚糖进行粗提，得到样品纯度较低，色泽较差或者制备过程需借助色谱，如离子交换（deae等）或者分子筛（sephadex-g200等）对样品进行纯化，过程较为复杂，不适宜大批量制备进而工业化。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种青稞β-葡聚糖的制备工艺和青稞β-葡聚糖的结构序列，解决难以提取纯度较高的青稞β-葡聚糖、青稞β-葡聚糖序列复杂、其药用性能不明确等的问题。

本发明的技术方案是：

提供一种青稞β-葡聚糖的制备工艺，该方法包括如下步骤：

（1）青稞粉碎：将青稞磨成粉后，过40-80目筛，制得青稞粉；

（2）灭酶：在所述青稞粉中加入高浓度乙醇，加热回流；

(3)提取并除淀粉：在经步骤(2)加工后所得的青稞粉中加入水，调整ph值至7-11，然后加入高温淀粉酶，混合均匀后于85-90℃条件下搅拌回流1-10h；

（4）除蛋白：调整步骤(3)所得的溶液的ph值至2-4.5，静置后蛋白沉淀析出，离心去除沉淀，制得提取液；

（5）制备粗多糖：对所述提取液浓缩1-5倍后加入硫酸铵，静置后粗多糖沉淀析出，离心后收集沉淀，得青稞β-葡聚糖粗品；

（6）除小分子：将所述青稞β-葡聚糖粗品加水复溶，然后去除小分子杂质，制得青稞β-葡聚糖溶液；

（7）干燥：将所述青稞β-葡聚糖溶液进行干燥，得到精制的青稞β-葡聚糖。

进一步的，步骤(2)中所述料液比为1g:1ml-1g:20ml，所述乙醇的浓度>80%，所述加热回流时间为1-5小时。

进一步的，步骤(3)中所述青稞粉与水的料水比为1g:5ml-1g:50ml，所述ph值采用20%的na2co3调整，所述高温淀粉酶与所述青稞粉的比为10u：1g至1000u：1g。

进一步的，步骤(5)中所述硫酸铵与浓缩后的提取液的料液比为1g:2ml-1g:8ml。

进一步的，步骤(6)中所述去除小分子杂质采用超滤膜过滤的方式，所述超滤膜为有机或者无机膜，所述超滤膜截留分子量为1000–5000da。

进一步的，步骤(7)中所述干燥的方式为喷雾、带式、烘箱或冷冻中的任意一种。

本发明的另一技术方案是：

提供一种上述工艺所制备的青稞β-葡聚糖，所述青稞β-葡聚糖的结构中含有重复单元glc1→3glc1→4glc/glc1→3glc1→4glc1→4glc。

进一步的，所述青稞β-葡聚糖的结构中具有β-(1→3)和β-(1→4)两种连接方式的直链葡聚糖。

进一步的，所述青稞β-葡聚糖的结构中dp3n、dp3n+1和dp3n+2组成一个周期循环，其中，所述dp3n具有两种序列连接，分别为[glc1→4glc1→4glc]n和[glc1→3glc1→4glc]n；所述dp3n+1是每一个周期中丰度最高的寡糖，其表述为[glc1→3glc1→4glc]n→4glc；所述dp3n+2是每一个周期中含量较少的寡糖，其为均一的β-(1→4)连接葡萄糖片段。

进一步的，所述青稞β-葡聚糖中β-(1→3)与β-(1→4)糖苷键的比值为1:2至1:5。

本发明所述青稞β-葡聚糖的具体优点如下：

（1）该青稞β-葡聚糖的制备工艺简单，适合大规模生产；

（2）利用本发明所述的工艺制备的青稞β-葡聚糖纯度高；

（3）该青稞β-葡聚糖结构明确；

（4）该青稞β-葡聚糖具有良好的降血糖降血脂功能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中，

图1为本发明中所述的一种青稞β-葡聚糖的制备工艺所制备的青稞β-葡聚糖的核磁共振谱图；

图2为本发明中β-葡聚糖单糖组成以及各标准品对比图；

图3为本发明中β-葡聚糖部分酶解产物中寡糖的分离分析图；

图4是本发明中6h、12h以及24h酶解产物中寡糖pad色谱图及其对应的提取离子流色谱图(eic)；

图5是本发明中dp2-dp4的二级质谱图；

图6是本发明中dp5-dp7的二级质谱图；

表1是本发明中青稞β-葡聚糖的¹³cnmr峰位归属；

表2是本发明中青稞β-葡聚糖对高脂血症小鼠血浆中血脂的影响(n=10)；

表3是本发明中青稞β-葡聚糖对高脂血症小鼠肝脂以及肝重系数的影响(n=10)；

表4是本发明中青稞β-葡聚糖对高脂血症小鼠肝组织mda含量，sod和gsh-px活性的影响(n=10)；

表5是本发明中青稞β-葡聚糖对高血糖小鼠空腹血糖的影响(n=10)；

表6是本发明中青稞β-葡聚糖对高血糖小鼠口服葡萄糖耐量的影响(n=10)；

表7是本发明中青稞β-葡聚糖对高血糖小鼠糖原的影响(n=10)。

具体实施方式

本发明提供一种青稞β-葡聚糖的制备工艺，包括以下步骤：

（1）青稞粉碎：将青稞磨成粉后，过40-80目筛，制得青稞粉；

（2）灭酶：在所述青稞粉中加入高浓度乙醇，加热回流；

(3)提取并除淀粉：在经步骤(2)加工后所得的青稞粉中加入水，调整ph值至7-11，然后加入高温淀粉酶，混合均匀后于85-90℃条件下搅拌回流1-10h；

（4）除蛋白：调整步骤(3)所得的溶液的ph值至2-4.5，静置后蛋白沉淀析出，离心去除沉淀，制得提取液；

（5）制备粗多糖：对所述提取液浓缩1-5倍后加入硫酸铵，静置后粗多糖沉淀析出，离心后收集沉淀，得青稞β-葡聚糖粗品；

（6）除小分子：将所述青稞β-葡聚糖粗品加水复溶，然后去除小分子杂质，制得青稞β-葡聚糖溶液；

（7）干燥：将所述青稞β-葡聚糖溶液进行干燥，得到精制的青稞β-葡聚糖。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

一种青稞β-葡聚糖的制备工艺，包括：

步骤一：将青稞磨成粉后，过40-80目筛，制得青稞粉；

步骤二：在所述青稞粉中加入高浓度乙醇，加热回流；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：将青稞粉中加入高浓度乙醇，加热回流。料液比为1:1-1:20(g:ml)；乙醇浓度>80%；回流时间1-5小时。该过程的目的在于除去脂溶性物质、色素，并且抑制内源性β-葡聚糖酶或生物酶在提取过程中降解目标产物。

步骤三：在青稞粉中加入水，调整ph值至7-11，然后加入高温淀粉酶，混合均匀后于85-90℃条件下搅拌回流1-10h；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：按照1:5到1:50的料水比在处理后的青稞粉中加水，采用20%na2co3调整ph到7-11，并按照活力单位(u)与乙醇处理后青稞粉质量(g)比为10：1至1000：1加入高温淀粉酶，混合均匀后于85-90℃条件下搅拌回流1-10h。

步骤四：调整所得的溶液的ph值至2-4.5，静置后蛋白沉淀析出，离心去除沉淀，制得提取液；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：调整溶液ph至2-4.5，静置后蛋白(淀粉酶以及青稞中固有蛋白)沉淀析出，离心去除沉淀。

步骤五：对所述提取液浓缩1-5倍后加入硫酸铵，静置后粗多糖沉淀析出，离心后收集沉淀，得青稞β-葡聚糖粗品；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：对提取液浓缩1-5倍后加入硫酸铵，硫酸铵质量(g)与浓缩后的提取液(ml)料液比为1:2-1:8，静置后粗多糖沉淀析出，离心后收集沉淀。该步骤是根据不同多糖在不同盐溶液中溶解度不同，使β-葡聚糖在硫酸铵溶液中沉淀，而提取液中的阿拉伯木聚糖会在加入硫酸铵条件下不会析出，达到纯化β-葡聚糖的目的。

步骤六：将所述青稞β-葡聚糖粗品加水复溶，然后去除小分子杂质，制得青稞β-葡聚糖溶液；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：将β-葡聚糖粗品加水复溶后，采用超滤膜过滤的方式取去除小分子杂质。这个过程中选用截留分子量为1000–5000da的有机或者无机膜。

步骤七：将所述青稞β-葡聚糖溶液进行干燥，得到精制的青稞β-葡聚糖。

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：将经过膜处理的溶液，以喷雾或带式或烘箱或冷冻等方式进行干燥，得到精制β-葡聚糖产品。

上述工艺所制得的具有降血糖降血脂功能的青稞β-葡聚糖的结构特征为含有重复单元glc1→3glc1→4glc/glc1→3glc1→4glc1→4glc，且他们之间存在多个结构序列均一但不同长度的β-(1→4)连接的葡萄糖片段。根据核磁共振结果，在上述条件下提取制备的样品为具有β-(1→3)和β-(1→4)两种连接方式的直链葡聚糖。根据hpaec-pad-ms/ms分析结果，组成该β-葡聚糖的片段存在一定重复规律，即不同聚合度的寡糖之间存在一定规律，dp3n，dp3n+1，dp3n+2，可组成一个周期循环，其中，dp3n具有两种序列连接，它们是分别为[glc1→4glc1→4glc]n和[glc1→3glc1→4glc]n；dp3n+1是每一个周期中丰度最高的寡糖，它可以表述为[glc1→3glc1→4glc]n→4glc；dp3n+2含量较少，它为均一的β-(1→4)连接的葡萄糖片段。此外，制备所得葡聚糖中β-(1→3)与β-(1→4)糖苷键的比值确定为1:2至1:5。该青稞β-葡聚糖有较好的防治高血脂和糖尿病活性，并有潜在成药性。

取上述工艺所得β-葡聚糖进行体内降血脂和降血糖试验，具体实验条件以及实验结果如下：

1）降血脂实验：通过预防给药的方式，进行判定，采取上午灌胃给药(根据体重200mg/kg)，下午灌食高脂乳剂(乳剂由15%猪油和1.5%胆固醇等辅料制备而成)，在连续灌胃21天以后，发现该β-葡聚糖相对与模型组可以显著降低实验组小鼠的总胆固醇(tc)(*p<0.05)，低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)(*p<0.05)，以及改善小鼠体内游离脂肪酸(ffa)(*p<0.05)的含量，具体机理可能是β-葡聚糖可以抑制肝肠循环过程中胆汁酸的重新收，从而促进肝脏中ldl-c转化为胆酸，从而达到降血脂的目的。

2）降血糖实验：向建模组小鼠根据体重110mg/kg注射链脲佐菌素，特异性损伤小鼠胰腺，建立i型糖尿病模型，对实验组小鼠体重采取灌胃给药(200mg/kg)的方式给予β-葡聚糖。在连续灌胃给药10天之后，β-葡聚糖与模型组对比可以显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖(*p<0.05)，改善小鼠口服葡萄糖耐量(*p<0.05)，促进肝糖原的合成(*p<0.05)以及肌糖原的合成(*p<0.05)，具体机理可能是β-葡聚糖通过保护小鼠胰岛细胞，增加胰岛素的分泌，促进肌糖原和肝糖原的合成，达到降低血糖的目的。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。

首先，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

其次，本发明利用结构示意图等进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，示意图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是实例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间。

实施例一

本实施案例按如下步骤展示一种青稞β-葡聚糖的制备工艺：

将青稞连带麸皮磨粉，过60目筛；将青稞粉收集后，称取30g青稞粉，加入150ml80%乙醇溶液，置于75℃回流2h。离心，除去乙醇溶液和色素，将沉淀置于干燥箱烘干。加水搅拌，按照料水比为1:15，向30g青稞粉中加入450ml水溶液，使用20%na2co3调整ph至10，并加入4.5ml(约135u)耐高温淀粉酶，在90℃(85-95℃均可)条件下搅拌回流2h，4500r/min，15min，收集上清液；冷却至室温，4500r/min，15min，分离后收集上清液，再加入适量耐高温淀粉酶，85℃保持1-2h，选用0.1mol/l碘液作为指示剂，直至碘液不再变色，确认淀粉降解为单糖或寡糖；冷却至室温后，用hcl调整溶液ph至2-4.5，搅拌，静置，沉淀蛋白；4500r/min，15min，离心得上清液，调整ph至7.0，旋转蒸发，将体积浓缩至1/3，并于每50ml浓缩液中加入14.5g(nh4)2so4固体，边加边搅拌，使硫酸铵溶液充分溶解后，置于4℃，静置，过夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入100ml纯水，充分加热溶解；冷却至室温，缓慢加入3倍体积的无水乙醇，充分搅拌后，置于4℃，静置，过夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入100ml纯水，边加热边搅拌，直至沉淀完全溶解；采用孔径为3500da的卷式有机膜进行脱盐处理，每隔1h换水，透析24h，用0.5mbacl2进行监测，直至样品溶液与bacl2溶液混合时不再产生白色沉淀；12000r/min，15min，去除溶液中可能存在的不溶性小颗粒，收集上清液，将溶液浓缩为原来体积的1/5，冷冻干燥，得到1gβ-葡聚糖产品。

1、青稞β-葡聚糖的结构表征

对实施例1中所得的产品分别进行核磁共振分析、单糖组成分析和序列分析。

（1）核磁共振分析

¹³c-nmr分析结果所得谱图如图1所示，根据已有知识，异头碳的化学位移大于103ppm的，则糖苷键类型为β型，可初步确定该糖链为β型。除此之外，根据文献中已有的凝胶多糖(curdlan，由单一的β-(1→3)糖苷键连接而成的葡聚糖)的常规¹³c-nmr峰位归属以及纤维素(cellulose，由单一的β-(1→4)糖苷键连接而成的葡聚糖)的固态¹³c-nmr峰位归属特征，可对青稞β-葡聚糖的谱图进行有效地归属。其中，104.03ppm与103.20ppm处的共振峰分别归属为β-(1→3)-d-glc的异头碳c-1以及β-(1→4)-d-glc的异头碳c-1，β-(1→3)-d-glc的c-3共振峰出现在87.71ppm处，将73.38，71.04，76.70以及61.24ppm的共振峰分别归属为β-(1→3)-d-glc的c-2，c-4，c-5andc-6，68.72，将72.63，80.74，75.37以及60.69ppm处的共振峰分别归属为c-2，c-3，c-4，c-5以及c-6，具体见下表1。

表1青稞β-葡聚糖的¹³c-nmr峰位归属

（2）单糖组成分析

通过hpaec-pad的方式对实施例1中制备所得青稞β-葡聚糖进行单糖组成分析。在分析之前，采用2m三氟乙酸(tfa)对实施例1中制备所得样品进行降解，降解12h后，通过旋转蒸发的方式，将具有强腐蚀作用的tfa去除。分别配制阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖以木糖标准品溶液及其混合液，采用hpeac-pad对降解样品以及标准品溶液进行分离分析，分析柱为carbopacpa-1column(4×250mm，dionex，sunnyvale，ca)，并选取15mmnaoh溶液为流动相，以1ml/min进行等度洗脱。根据降解后的样品和标准单糖的pad色谱图对比，样品降解后只有葡萄糖被检测到，葡萄糖色谱峰的纯度超过95%。因此可确定制备所得β-葡聚糖纯度较高(>95%)。如图2所示。

（3）序列结构分析

为了研究青稞β-葡聚糖的序列结构特征，将β-葡聚糖溶于10mmpbs缓冲溶液中，样品浓度3mg/ml，加入1uβ-葡聚糖酶，置于37℃恒温水浴培养箱；分别于6h，12h，24h采集样品；采集后溶液煮沸，使酶失活，并离心(15000r/min，10min)去除变性蛋白。采用离子色谱同时串联pad和q-tof质谱仪的方式，对不同时间酶解产物进行分离分析。分析柱为carbopacpa-200column(3×250mm，dionex，sunnyvale，ca)，流动相a为100mmnaoh，流动相b为1mnaoac以及100mmnaoh溶液，以0.8ml/min流速进行梯度洗脱，其中，b相在0-35min内由0%洗脱至35%。

β-葡聚糖部分酶解产物中寡糖的分离分析流程具体见图3，由于流动相中存在高浓度的非挥发性盐，不可直接进入质谱，因此需经具有在线脱盐功能的阳离子交换柱处理；图4，分别为6h、12h以及24h酶解产物的pad色谱图与其对应的提取离子流色谱图(eic)，如图所示，eic与pad谱图结果可互相对应，在脱盐过程中，可导致样品的扩散，因而，eic中峰型比pad谱图中峰型宽。其次，对图中各峰进行归属，根据图中6h酶解产物的分析结果可发现，不同聚合度的寡糖分布存在一定规律，dp3n，dp3n+1，dp3n+2，可组成一个周期循环，其中，dp3n具有两种序列连接，dp3n+1是每一个周期中丰度最高的寡糖，dp3n+2含量较少。

对聚合度为dp2-7的寡糖分别进行二级质谱分析，结果如图5(a、b、c、d)及图6(a、b、c、d)。图5a为二糖二级质谱结果，b1(m/z161)/c1(m/z179)是典型的糖苷键断裂，据报道，^2,4a2(m/z221)/^2,5a2(m/z263)是1,4糖苷键连接二糖的特殊离子峰，因此该二糖的连接方式可以确认为glc1→4glc。图5b和5c分别为dp3(a)以及dp3(b)的二级质谱结果。在dp3(a)的二级质谱图中，除了典型的b和c糖苷键断裂以外，还有^2,5a2(m/z263)和^2,5a3(m/z425)断裂方式的存在，因此，可以确定dp3(a)的两个糖苷键连接方式均为1，4连接。根据dp3(b)二级质谱图可知，在二级质谱轰击过程中，第二个糖环上未发生任何跨环断裂，而这一特征可证明1→3糖苷键的存在，第三个糖环上出现了^2,4a3(m/z383)/^2,5a3(m/z425)/^0,2a3(m/z443)的断裂方式，证明了1→4糖苷键的存在。因此，dp3(a)和dp3(b)的序列结构可分别确认为glc1→4glc1→4glc以及glc1→3glc1→4glc。图5d为dp4二级质谱结果，由于^2,5a3(m/z425)和^2,5a4(m/z587)的存在，可确认，从非还原端处开始的第二个和第三个糖苷键均为1,4糖苷键;由于该谱图中未找到第二个糖环上的任何跨环断裂的碎片离子峰，因而该四糖中第一个糖苷键可确定为1,3糖苷键。dp4的序列结构确认为glc1→3glc1→4glc1→4glc。同理可得，图6(a、b、c、d)中dp5，dp6(a)，dp6(b)，dp7的序列结构可分别确定为：

glc1→4glc1→4glc1→4glc1→4glc，

glc1→4glc1→4glc1→4glc1→4glc1→4glc，

glc1→3glc1→4glc1→4glc1→3glc1→4glc，

glc1→3glc1→4glc1→4glc1→3glc1→4glc1→4glc。

综上所述，实施例1中制备所得的青稞β-葡聚糖具有如下结构特征：存在重复单元glc1→3glc1→4glc/glc1→3glc1→4glc1→4glc，且存在多个β-(1→4)连接的片段。根据核磁共振结果，在上述条件下提取制备的样品为具有β-(1→3)和β-(1→4)两种连接方式的直链葡聚糖。根据hpaec-pad-ms/ms分析结果，组成该β-葡聚糖的片段存在一定重复规律，即，dp3n，dp3n+1，dp3n+2，可组成一个周期循环，其中，dp3n存在两种序列连接，它们是分别为[glc1→4glc1→4glc]n和[glc1→3glc1→4glc]n；dp3n+1是每一个周期中丰度最高的寡糖，它可以表述为[glc1→3glc1→4glc]n→4glc；dp3n+2含量较少，它为均一的β-(1→4)连接的葡萄糖片段。此外，制备所得葡聚糖中β-(1→3)与β-(1→4)糖苷键的比值确定为1:3。

2、青稞β-葡聚糖的降血脂功能评价

对实施例1中制备所得青稞β-葡聚糖进行降血脂体内活性评价。

选取40只雄性昆明小鼠，体重18-22g，通过预防给药的方式，进行判定，采取上午灌胃给药(根据体重200mg/kg)，下午灌食高脂乳剂(乳剂由15%猪油和1.5%胆固醇等辅料制备而成)的方式，连续灌胃21天，最后，眼球取血后处死。提取小鼠肝脏组织，称重，按照不同试剂盒要求测定这40只小鼠体内总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、小鼠肝脏中总胆固醇、甘油三酯和肝重系数指标以及游离脂肪酸(ffa)的结果以及肝脏内多种酶活性进行评价。试验中分为空白组、模型组、实验组和阳性药对照组，其中阳性药为辛伐他汀(20mg/kg)。具体结果见表2、表3、表4。

表2青稞β-葡聚糖对高脂血症小鼠血脂的影响(n=10)

注:与正常组比较，^##p˂0.01，^#p˂0.05；与模型组比较**p˂0.01，*p˂0.05。

表3青稞β-葡聚糖对高脂血症小鼠肝脂以及肝重系数的影响(n=10)

注:与正常组比较，^##p˂0.01，^#p˂0.05；与模型组比较**p˂0.01，*p˂0.05。

表4青稞β-葡聚糖对高脂血症小鼠肝组织mda含量，sod和gsh-px活性的影响(n=10)

注:与正常组比较，^##p˂0.01，^#p˂0.05；与模型组比较**p˂0.01，*p˂0.05。

表2、表3、表4中，与正常组小鼠对比，模型组小鼠体内多项参数存在显著差异，具有统计学意义(^##p˂0.01或^#p˂0.05)，说明模型建立成功。表2中，实验组小鼠与模型组对比，血清中tc、ldl-c以及hdl-c等指标均有显著改善，且存在显著差异，存在统计学意义(**p˂0.01或*p˂0.05)，表3和表4中，实验组小鼠与模型组相比，实验组小鼠肝脏系数具有显著改善(**p˂0.01)，且肝脏内sod以及gsh-px活性增加，机体抗氧化能力增强。

高血脂小鼠体内实验结果表明，青稞β-葡聚糖可以有效降低血清中tc、ldl-c和ffa的浓度,并且可以适当增加小鼠血清中hdl-c,此外，青稞β-葡聚糖可以有效地增加实验组小鼠体内抗氧化酶活性，因而可确定，采用该工艺生产的青稞β-葡聚糖具有良好的降血脂作用以及抗氧化作用。

3、青稞β-葡聚糖的降血糖活性评价

对实施例1中制备所得青稞β-葡聚糖进行降血糖体内活性评价试验。

选用雄性昆明小鼠，体重18-22g，适应性培养后随机分为两组，空白组和建模组，向建模组小鼠根据体重110mg/kg注射链脲佐菌素，特异性损伤小鼠胰腺，建立i型糖尿病模型，并将建模成功的小鼠随机分为三组：模型组、阳性对照组以及实验组。对实验组小鼠体重采取灌胃给药(200mg/kg)的方式给予β-葡聚糖，分别于0day、10day、20day、30day取血，测量空腹血糖浓度，并于培养第30天后，禁食，分别取0h、0.5h、2h测定口服葡萄糖耐受量，并于眼球取血后处死，提取小鼠肝脏组织和肌肉组织，称重，按照不同试剂盒要求测定这40只小鼠空腹血糖浓度、肝糖原、肌糖原、口服葡萄糖耐受量(ogtt)进行测量。试验中共设置4组，分别为空白组、模型组、实验组和阳性药对照组，其中,阳性药为二甲双胍(20mg/kg)。具体结果见表5、表6、表7。

表5青稞β-葡聚糖对高血糖小鼠空腹血糖的影响(n=10)

注:与正常组比较，^##p˂0.01，^#p˂0.05；与模型组比较**p˂0.01，*p˂0.05。

表6青稞β-葡聚糖对高血糖小鼠口服葡萄糖耐量的影响(n=10)

注:与正常组比较，^##p˂0.01，^#p˂0.05；与模型组比较**p˂0.01，*p˂0.05。

表7青稞β-葡聚糖对高血糖小鼠糖原的影响(n=10)

注:与正常组比较，^##p˂0.01，^#p˂0.05;与模型组比较**p˂0.01，*p˂0.05.

表5、表6、表7中，与正常组小鼠对比，模型组小鼠体内多项参数存在显著差异，具有统计学意义(^##p˂0.01或^#p˂0.05)，说明模型建立成功。表5中，与模型组小鼠相比，实验组小鼠空腹血糖浓度得到有效控制(**p˂0.01)，血糖耐受量得到有效改善(**p˂0.01)；表6中，实验组小鼠体内的肌糖原和肝糖原含量显著增多(**p˂0.01).

动物实验结果表明，青稞β-葡聚糖可以有效地降低高血糖小鼠的空腹血糖，改善口服血糖耐受量，促进肝糖原以及肌糖原的合成，从而可以进一步确认，采用该工艺制备的β-葡聚糖具有良好的降血糖的作用。

根据上述数据，可以判断采取该工艺制备的青稞β-葡聚糖具有较好的降血脂以及降血糖活性。

实施例二

本实施案例按如下步骤展示一种青稞β-葡聚糖的制备工艺：

将青稞连带麸皮磨粉，过40目筛；将青稞粉收集后，称取80g青稞粉，加入400ml80%乙醇溶液，置于75℃回流2h。离心，除去乙醇溶液和色素，将沉淀置于干燥箱烘干。加水搅拌，按照料水比为1:20，向80g青稞粉中加入1600ml水溶液，使用20%na2co3调整ph至10，并加入12ml(约359u)耐高温淀粉酶，在85℃条件下搅拌回流2h，4500r/min，15min，收集上清液；冷却至室温，4500r/min，15min，分离后收集上清液，再加入适量耐高温淀粉酶，85℃保持1-2h，选用0.1mol/l碘液作为指示剂，直至碘液不再变色，确认淀粉降解为单糖或寡糖；冷却至室温后，用hcl调整溶液ph至3，搅拌，静置，沉淀蛋白；4500r/min，15min，离心得上清液，调整ph至7.0，旋转蒸发，将体积浓缩至1/3，并于每50ml浓缩液中加入16.5g(nh4)2so4固体，边加边搅拌，使硫酸铵溶液充分溶解后，置于4℃，静置，过夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入250ml纯水，充分加热溶解；冷却至室温，缓慢加入3倍体积的无水乙醇，充分搅拌后，置于4℃，静置，过夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入250ml纯水，边加热边搅拌，直至沉淀完全溶解；采用孔径为3500da的卷式有机膜进行脱盐处理，每隔1h换水，透析24h，用0.5mbacl2进行监测，直至样品溶液与bacl2溶液混合时不再产生白色沉淀；12000r/min，15min，去除溶液中可能存在的不溶性小颗粒，收集上清液，将溶液浓缩为原来体积的1/5，冷冻干燥，得到3.5gβ-葡聚糖产品。

实施例三

本实施案例按如下步骤展示一种青稞β-葡聚糖的制备工艺：

将青稞连带麸皮磨粉，过40目筛；将青稞粉收集后，称取120g青稞粉，加入600ml80%乙醇溶液，置于75℃回流2h。离心，除去乙醇溶液和色素，将沉淀置于干燥箱烘干。加水搅拌，按照料水比为1:15，向120g青稞粉中加入1800ml水溶液，使用20%na2co3调整ph至10，并加入14ml(约408u)耐高温淀粉酶，在90℃条件下搅拌回流2h，4500r/min，15min，收集上清液；冷却至室温，4500r/min，15min，分离后收集上清液，再加入适量耐高温淀粉酶，85℃保持1-2h，选用0.1mol/l碘液作为指示剂，直至碘液不再变色，确认淀粉降解为单糖或寡糖；冷却至室温后，用hcl调整溶液ph至2.5，搅拌，静置，沉淀蛋白；4500r/min，15min，离心得上清液，调整ph至7.0，旋转蒸发，将体积浓缩至1/3，并于每50ml浓缩液中加入12.5g(nh4)2so4固体，边加边搅拌，使硫酸铵溶液充分溶解后，置于4℃，静置，过夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入400ml纯水，充分加热溶解；冷却至室温，缓慢加入3倍体积的无水乙醇，充分搅拌后，置于4℃，静置，过夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入400ml纯水，边加热边搅拌，直至沉淀完全溶解；采用孔径为3500da的卷式有机膜进行脱盐处理，每隔1h换水，透析24h，用0.5mbacl2进行监测，直至样品溶液与bacl2溶液混合时不再产生白色沉淀；12000r/min，15min，去除溶液中可能存在的不溶性小颗粒，收集上清液，将溶液浓缩为原来体积的1/5，冷冻干燥，得到4.8gβ-葡聚糖产品。

实施例四

本实施案例按如下步骤展示一种青稞β-葡聚糖的制备工艺：

将青稞连带麸皮磨粉，过60目筛；将青稞粉收集后，称取140g青稞粉，加入840ml80%乙醇溶液，置于75℃回流2h。离心，除去乙醇溶液和色素，将沉淀置于干燥箱烘干。加水搅拌，按照料水比为1:10，向140g青稞粉中加入1400ml水溶液，使用20%na2co3调整ph至10，并加入19ml(约600u)耐高温淀粉酶，在85℃条件下搅拌回流2h，4500r/min，15min，收集上清液；冷却至室温，4500r/min，15min，分离后收集上清液，再加入适量耐高温淀粉酶，85℃保持1-2h，选用0.1mol/l碘液作为指示剂，直至碘液不再变色，确认淀粉降解为单糖或寡糖；冷却至室温后，用hcl调整溶液ph至3，搅拌，静置，沉淀蛋白；4500r/min，15min，离心得上清液，调整ph至7.0，旋转蒸发，将体积浓缩至1/3，并于每50ml浓缩液中加入16.5g(nh4)2so4固体，边加边搅拌，使硫酸铵溶液充分溶解后，置于4℃，静置，过夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入500ml纯水，充分加热溶解；冷却至室温，缓慢加入3倍体积的无水乙醇，充分搅拌后，置于4℃，静置，过夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入500ml纯水，边加热边搅拌，直至沉淀完全溶解；采用孔径为3500da的卷式有机膜进行脱盐处理，每隔1h换水，透析24h，用0.5mbacl2进行监测，直至样品溶液与bacl2溶液混合时不再产生白色沉淀；12000r/min，15min，去除溶液中可能存在的不溶性小颗粒，收集上清液，将溶液浓缩为原来体积的1/5，冷冻干燥，得到5.2gβ-葡聚糖产品。

实施例五

本实施案例按如下步骤展示一种青稞β-葡聚糖的制备工艺：

将青稞连带麸皮磨粉，过60目筛；将青稞粉收集后，称取200g青稞粉，加入1000ml80%乙醇溶液，置于75℃回流2h。离心，除去乙醇溶液和色素，将沉淀置于干燥箱烘干。加水搅拌，按照料水比为1:15，向200g青稞粉中加入3000ml水溶液，使用20%na2co3调整ph至10，并加入24ml（约750u）耐高温淀粉酶，在85℃条件下搅拌回流2h，4500r/min，15min，收集上清液；冷却至室温，4500r/min，15min，分离后收集上清液，再加入适量耐高温淀粉酶，85℃保持1-2h，选用0.1mol/l碘液作为指示剂，直至碘液不再变色，确认淀粉降解为单糖或寡糖；冷却至室温后，用hcl调整溶液ph至3，搅拌，静置，沉淀蛋白；4500r/min，15min，离心得上清液，调整ph至7.0，旋转蒸发，将体积浓缩至1/3，并于每50ml浓缩液中加入16.5g(nh4)2so4固体，边加边搅拌，使硫酸铵溶液充分溶解后，置于4℃，静置，过夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入600ml纯水，充分加热溶解；冷却至室温，缓慢加入3倍体积的无水乙醇，充分搅拌后，置于4℃，静置，过夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入600ml纯水，边加热边搅拌，直至沉淀完全溶解；采用孔径为3500da的卷式有机膜进行脱盐处理，每隔1h换水，透析24h，用0.5mbacl2进行监测，直至样品溶液与bacl2溶液混合时不再产生白色沉淀；12000r/min，15min，去除溶液中可能存在的不溶性小颗粒，收集上清液，将溶液浓缩为原来体积的1/5，冷冻干燥，得到12.3gβ-葡聚糖产品。

综上所述，本发明公开了一种青稞β-葡聚糖的制备工艺，通过高效溶出、硫酸铵沉淀、超滤膜过滤等关键工艺的改进，使得β-葡聚糖有较高的纯度，纯度达到95%以上，且色泽较好；得率较高，每100g干燥青稞粉中可提取3-10gβ-葡聚糖；结构序列明确；以及具有良好的降血脂以及降血糖活性，可以用于高血脂以及糖尿病的治疗，为开发治疗高血脂以及糖尿病的新药打下基础，积极推动高血脂以及糖尿病天然药物活性成分的研究开发。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。