一种中温α‑淀粉酶及其基因和应用的制作方法

本发明涉及生物工程领域，具体地，涉及基因的克隆和重组dna技术，尤其是一种中温α-淀粉酶及其基因和应用。

背景技术：

α-淀粉酶是一种能水解淀粉的内切酶，为糖苷水解酶类的第13家族。其能水解淀粉内部的α-1,4糖苷键，产生还原糖、低聚糖、麦芽糖和糊精等。α-淀粉酶来源广泛，微生物发酵，动、植物提取均可获得。目前工业上α-淀粉酶的大规模生产主要以微生物发酵进行。枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米曲霉菌、黑曲霉菌等均可用来生产α-淀粉酶。α-淀粉酶作为一种重要的工业酶制剂，应用十分广泛，例如食品，发酵，纺织，造纸业，制药业以及化学药品工业等，甚至在临床、医学、分析化学等领域都有重要应用。

用于工业生产α-淀粉酶的菌株长期以来都是人工诱变或自然突变的高产菌株。我国对于α-淀粉酶生产菌株的选育和研究做了大量工作，从1965年开始就应用解淀粉芽孢杆菌bf7658生产α-淀粉酶。高定华等利用x射线、γ射线以及激光等诱变bf7658，使酶活提高到500-600u/ml[高定华：食品与发酵工业.1986]；邬显章等利用硫酸二乙酯、5-氟尿嘧啶和亚硝基胍等诱变bf7658变异株，获得产酶达477u/ml的高产菌株[邬显章：生物工程学报.1985]。而随着生物技术的不断发展，人们开始利用基因工程来获得α-淀粉酶的高产菌株。自八十年代以来，国内外用于α-淀粉酶生产的基因工程菌相关研究进展迅速。相较于国外，虽然我国酶制剂工业快速发展，但是仍然存在一定差距。

中温α-淀粉酶是一种适用范围比较广泛的α-淀粉酶，其最适反应温度为50-70℃。目前中温α-淀粉酶市场需求量比较大，但是现有中温α-淀粉酶生产菌株的生产水平有待提高，亟待研发出中温α-淀粉酶的高效表达菌株。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种中温α-淀粉酶及其基因、工程菌(重组菌株)和制备方法。

本发明的另一目的是提供一种制备上述中温α-淀粉酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述中温α-淀粉酶及基因工程菌的应用。

本发明从解淀粉芽孢杆菌crvab100(bacillusamyloliquefaciens)中分离得到一种新的中温α-淀粉酶。

本发明提供了一种中温α-淀粉酶，其氨基酸序列如seqidno.1所示：

本发明的中温α-淀粉酶，具有良好的热稳定性以及ph稳定性。其最适温度为60℃，在50-70℃之间剩余酶活达到80％以上，甚至在80℃保温1h后仍有60％的剩余酶活；其最适ph值为6.0，在ph值5.0-6.5时，相对酶活达到将近80％。

本发明提供了编码上述中温α-淀粉酶。具体地，该基因的基因组序列如seqidno.2所示：

本发明通过pcr的方法分离克隆了所述中温α-淀粉酶的编码基因，dna全序列分析结果表明，中温α-淀粉酶的编码基因全长1452bp。将中温α-淀粉酶的编码基因经序列比对后发现与genbankaccessionnumber为am409180的α-淀粉酶基因相似度达99％，为一新的中温α-淀粉酶。

本发明还提供了包含上述中温α-淀粉酶基因的重组载体，优选为包含权利要求2或3所述中温α-淀粉酶基因的质粒pwb980。所述重组质粒pwb980还含有kan抗性基因、p43启动子序列、spsacb信号肽序列、枯草芽孢杆菌终止子序列；本发明所述中温α-淀粉酶基因位于重组质粒pwb980的spsacb信号肽序列和枯草芽孢杆菌终止子序列之间。

本发明还提供了包含上述中温α-淀粉酶基因的重组菌株，优选所述重组菌株为枯草芽孢杆菌，例如，通过改造枯草芽孢杆菌168(b.subtilis)获得的、含上述中温α-淀粉酶基因重组菌株zkb(b.subtilis)。本发明的制备上述基因工程菌的方法，除了将含中温α-淀粉酶基因的重组质粒(例如，pwb980)导入宿主细胞外，还包括将宿主细胞的基因lytc、spbc、xpf、apre、npre与spo0a敲除，以及将宿主细胞的基因prsa与groesl过量表达。

本发明还提供了一种制备上述的中温α-淀粉酶方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株使其发酵，诱导重组中温α-淀粉酶表达；

3)回收并纯化所表达的中温α-淀粉酶。

其中，优选所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌，优选将重组表达质粒转化枯草芽孢杆菌，得到重组菌株。

所述发酵培养基为液体培养基，主要成分包括：20-40g/l的玉米粉，20-40g/l的玉米淀粉，30-50g/l的豆饼粉，0.5-3g/l的氯化钙，7-9g/l的磷酸氢二钠。

所述发酵温度为36.5℃-38℃，优选37℃。

本发明还提供了上述中温α-淀粉酶的应用。优选地，提供上述中温α-淀粉酶在饲料、食品、医药等工业领域中的应用。

本发明中的中温α-淀粉酶，具有良好的热稳定性以及ph稳定性。其最适温度为60℃，在50-70℃之间剩余酶活达到80％以上，甚至在80℃保温1h后仍有60％的剩余酶活；其最适ph值为6.0，在ph值5.0-6.5时，相对酶活达到将近80％。可应用于饲料、食品、医药等工业领域。

本发明运用基因工程技术构建了含有中温α-淀粉酶基因的重组质粒，并在枯草芽孢杆菌中实现了中温α-淀粉酶的高效表达。构建的中温α-淀粉酶重组菌株具有较高的应用价值，具有很高的产中温α-淀粉酶的能力，在同等发酵条件下，较野生菌酶活提高了90％。

附图说明

图1为本发明实施例1中温α-淀粉酶基因的pcr扩增电泳图，其中：1、为中温α-淀粉酶基因片段，2、为dna分子量标准。

图2为本发明实施例2中基因敲除原理图。

图3为本发明重组质粒pwb980-amy结构示意图。

图4为本发明重组中温α-淀粉酶最适温度。

图5为本发明重组中温α-淀粉酶热稳定性。

图6为本发明重组中温α-淀粉酶最适ph值。

图7为本发明重组中温α-淀粉酶ph稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体

表达载体pwb980购自于invitrogen公司；枯草芽孢杆菌株168购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)。

2、酶类及其它生化试剂

酶类及其它生化试剂：内切酶购自takara公司，连接酶购自invitrogen公司。p-nitrophenyl-a-l-arabionfuranoside(pnpaf)购自sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1、中温α-淀粉酶基因的获得。

解淀粉芽孢杆菌crvab100是在面粉厂附近采集的土壤样品中分离得到。具体为将土壤样品溶于无菌水中，经富集培养后取合适稀释梯度涂布于含1％玉米淀粉的平板上，根据平板上透明圈的大小筛选得到。

提取解淀粉芽孢杆菌crvab100(bacillusamyloliquefaciens)基因组dna：

(1)取0.5-2ml培养菌液，10000rpm，离心30s，尽可能的吸取上清，收集菌体；

(2)ep管中加200μl缓冲液rb重悬，10000rpm离心30s，弃上清；

(3)对于革兰氏阳性菌：加入120μl溶菌酶，颠倒混匀，37℃水浴30-60min；

(4)12000rpm离心2min，弃上清后将细胞振荡或者吹打重悬于180μl缓冲液rb中；

(5)加rnasea(25mg/ml)溶液20μl，振荡混匀，室温放置5-10min；

(6)加结合液cb800μl，再加入100μl异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能出现絮状沉淀；

(7)将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱ac中，吸附柱放入收集管中，13000rpm离心30-60s，弃掉废液；

(8)加抑制物去除液ir500μl，12000rpm离心30s，弃废液；

(9)加入700μl漂洗液wb，12000rpm，离心30s，弃掉废液；

(10)加入500μl漂洗液wb，12000rpm，离心30s，弃掉废液；

(11)将吸附柱ac放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，一面漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；

(12)取出吸附柱ac，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液eb，室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min；

(13)得到的dna于-20℃保存。

以上述基因组dna为模板进行pcr扩增中温α-淀粉酶基因。扩增引物为：上游引物：5’-gcaactcaagcttttgccgtaaatggcacgctgatgcag-3’；下游引物：5’-tgtgctgaagctagcttatttctgaacataaatggagacggacc-3’。pcr扩增得到约1500bp大小的dna片段，该片段回收后与peasy-t3载体进行连接后送测序。经过基因测序得到1452bp的基因片段(seqidno.1)，经序列比对后发现与genbankaccessionnumber为am409180的α-淀粉酶基因相似度达99％。

实施例2、宿主菌株枯草芽孢杆菌b.subtiliszkb的构建

所述枯草芽孢杆菌为b.subtilis168改造菌株。包括基因lytc、spbc、xpf、apre、npre、spo0a的敲除，基因prsa、groesl的过量表达。

基因敲除采用ara3的方法(shenghaoliu,keijiendo,katsutoshiara,katsuyaozakiandnaotakeogasawara.introductionofmarker-freedeletionsinbacillussubtilisusingtheararrepressorandthearapromoter.microbiology(2008),154,2562–2570)。其原理图如图2。(1)将para-spe重组到枯草芽孢杆菌基因组上。(2)将重组片段up-dn-cat-arar-g转化待敲除菌体(片段up和片段dn分别为待敲除基因g的上游片段和下游片段)，用氯霉素抗性来筛选转化子。(3)将(2)中的转化子进行影印，挑取有氯霉素抗性而没有壮观霉素抗性的转化子，挑取单菌落至装有5mllb的试管，37℃、200r/min震荡培养14h使菌体自身基因组发生重组，取2μl菌液涂布于壮观霉素抗性平板。在para-spe中，壮观霉素基因的表达受阿拉伯糖操纵子的启动子(para)的调控，而para受arar蛋白的阻遏调控，因此只有敲除arar基因，壮观霉素抗性基因才得以表达。(4)通过菌落pcr验证转化子。

以基因xpf为例，其余基因均以其方式进行敲除实验。(1)分别以引物xpf-up-f\r

(5’-gtcattgtggaacataccggtattgg-3’\5’-tctatgatcctcctcatttttggcaaataaaaaac-3’)、xpf-f\r

(5’-ccagtccgcacgaaaactgaatgaataaatgcaagacttactatttgaatataaacg-3’\5’-ggcaagtgatcgattcatttcttcctg-3’)、xpf-dn-f\r

(5’-ttttttatttgccaaaaatgaggaggatcatagatgaaagcttgtcatacgtttgccac-3’\5’-gttgaactaatgggtgctttagttgaagaattgatctggaaacaaatcaaaatataagg-3’)和cr-f\r

(5’-tcttcaactaaagcacccattagttc-3’\5’-ttattcattcagttttcgtgcggac-3’)通过pcr方法扩增出基因片段up(xpf基因上游片段)、xpf、dn(xpf基因下游片段)和cat-arar(氯霉素抗性基因和arar蛋白基因合成片段)，通过凝胶电泳回收基因片段。(2)通过融合pcr方法扩增出重组片段up-dn-cr-g。(3)融合pcr产物转化枯草芽孢杆菌。通过氯霉素抗性筛选转化子。(4)将(3)中的转化子进行影印，挑取有氯霉素抗性而没有壮观霉素抗性的转化子，挑取单菌落至装有5mllb的试管，37℃、200r/min震荡培养14h使菌体自身基因组发生重组，取2μl菌液涂布于壮观霉素抗性平板。(5)挑取转化子单菌落以xpf-yz-f\r

(5’-gagcagcctacgagcttaaccatag-3’\5’-gttttctccgctttttgtttggcaag-3’)为引物进行菌落pcr验证。

基因过量表达。分别扩增基因prsa以及groels与载体pdl片段连接后转化大肠杆菌，选取阳性转化子提取质粒，质粒线性化后转化枯草芽孢杆菌。由于质粒pdl上有枯草芽孢杆菌基因组上amye基因的同源片段，因此通过同源重组将基因prsa以及groels整合到枯草芽孢杆菌基因组，实现其过量表达。

通过上述技术手段，最终获得宿主菌株枯草芽孢杆菌b.subtiliszkb。

实施例3、中温α-淀粉酶表达载体pwb980-amy的构建

以枯草表达质粒pwb980为模板进行pcr扩增载体片段。扩增引物为：上游引物：5’-catttatgttcagaaataagctagcttcagcacaattccaag-3’；下游引物为：5’-cagcgtgccatttacggcaaaagcttgagttgcgcctcc-3’。pcr扩增得到约3738bp大小的载体dna片段，片段回收后与上述中温α-淀粉酶基因片段进行多聚物融合pcr(youc,zhangxz,zhangyh(2012)simplecloningviadirecttransformationofpcrproduct(dnamultimer)toescherichiacoliandbacillussubtilis.applenvironmicrobiol78:1593–1595)，融合产物转化枯草芽孢杆菌b.subtilis168感受态细胞，涂布在含卡那霉素(25μg/ml)的lb平板上，挑选阳性转化子，提取质粒测序验证，确定成功获得重组质粒pwb980-amy。

实施例4、表达载体pwb980-amy转化枯草芽孢杆菌b.subtiliszkb。

枯草芽孢杆菌b.subtiliszkb感受态细胞制备方法如下所述：

(1)接种枯草芽孢杆菌(b.subtiliszkb)于5mllb培养基中，过夜培养。

(2)取2.5ml过夜培养物接入40ml(lb+0.5m山梨醇)中，37℃，200rpm振荡培养至od600为0.85-0.95之间。

(3)将菌液冰水浴10min，然后5000g，4℃离心5min，收集菌体。

(4)用50ml预冷的电转培养基(0.5m山梨醇，0.5m甘露醇，10％葡萄糖)重悬菌体，5000g，4℃离心5min，去上清，如此漂洗4次。

(5)将洗涤后的菌体重悬于1ml电转培养基中，分装于ep管，每管分装60μl。

转化条件如下所述：

(1)将50ng质粒dna(1-8μl)加入到60μl感受态细胞中，冰上孵育2min，加入预冷的电转杯(1mm)中，电击。电转化参数设置：2.0kv、1mm、电击1次。

(2)电击完毕立即加入1ml复苏培养基(lb+0.5m山梨醇+0.38m甘露醇)

(3)37℃摇床振荡培养3h，培养物涂布在lb平板上，37℃培养24-36h，挑取阳性转化子，获得重组枯草芽孢杆菌b.subtiliszkb/pwb980-amy。

实施例5、重组枯草芽孢杆菌b.subtiliszkb/pwb980-amy获取中温α-淀粉酶的方法。

将实施例3中获得的重组枯草芽孢杆菌b.subtiliszkb/pwb980-amy和解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefacienscrvab100(野生菌)划线活化。活化培养基为lb平板。挑取单菌落至装有25mllb的250ml摇瓶中，37℃，220rpm震荡培养16-18小时，培养物作为种子液。

将上述种子液按照2％(v/v)接种量接种于装有50ml发酵培养基的500摇瓶中，37℃，220rpm振荡培养，发酵76h。

上述发酵培养基成分为：玉米粉含20g/l的玉米粉，20g/l的玉米淀粉，30g/l的豆饼粉，0.5g/l的氯化钙，8g/l的磷酸氢二钠，其余为水。

取上述摇瓶发酵液，12000rpm离心10min去除沉淀，测量上清液中的酶活。酶活力单位定义：1g固体酶粉或1ml液体酶，于60℃、ph6.0条件，1h液化1g可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以u/g或u/ml表示(中华人民共和国国家标准，gb8275-2009)。

结果表明，发酵72小时，重组枯草芽孢杆菌b.subtiliszkb/pwb980-amy的酶活达到831u/ml，而野生菌酶活为436u/ml，重组枯草芽孢杆菌b.subtiliszkb/pwb980-amy的酶活比野生菌提高近90％。

实施例6、重组中温α-淀粉酶的酶学性质分析。

(1)温度对本发明中温α-淀粉酶酶活力的影响

①最适温度的测定：在ph6.0条件下，在不同温度下测定酶活，最高酶活力定为100％。结果表明(图4)，重组中温α-淀粉酶的最适温度为60℃，在50-70℃之间相对酶活为80％以上。

②热稳定性的测定：重组中温α-淀粉酶分别在不同温度下保温2h，每隔20min在ph6.0条件下测定其残余酶活力，未保温的酶活力定为100％。结果表明(图5)，重组中温α-淀粉酶在50-70℃条件下保温2h，剩余酶活在80％以上，甚至在80℃保温1h后仍有60％的剩余酶活，说明该酶具有良好的热稳定性。

(2)ph对本发明中温α-淀粉酶酶活力的影响

①最适ph的测定：在60℃条件下，在不同ph下测定酶活，最高酶活力定为100％。结果表明(图6)，重组中温α-淀粉酶最适ph为6.0，在ph5.5-6.5之间相对酶活达到80％以上。

②ph稳定性的测定：将重组酶在不同ph条件下在60℃保温1h，测定其剩余酶活力，相应ph下未保温的酶活力定为100％。结果表明(图7)，重组中温α-淀粉酶在ph5.5-6.5范围内剩余酶活力达到80％以上，说明该酶具有良好的ph耐受性。

当然，本发明还可以有多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明的公开做出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明的权利要求的保护范围。

<110>北京科为博生物科技有限公司

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