本发明涉及生物治疗与生物医药领域，特别涉及一种表达水蛭素的过继免疫细胞及其制备方法和用途。
背景技术：
水蛭素是迄今发现的活性最强的天然凝血酶特异性抑制剂，最初从医用水蛭唾液腺中分离得到，由65～66个氨基酸组成，可直接与凝血酶以l：l(摩尔比)的方式结合形成非共价复合物，从而使凝血酶失去裂解纤维蛋白原的能力，抑制血栓的形成。天然水蛭素存在十种以上变体，主要有简称为hv1、hv2、hv3三种同源性很高的异构体(hirudinvariant)。
目前，国外已有两个重组水蛭素产品批准上市：1.desirudin(商品名：revasc，瑞士novartis产品)；2.lepirudin(商品名：refludan，英国pharmion及美国berlexlaboratories产品)。两者结构上仅在n-端存在微小差异，desirudin为val1-val2，而lepirudin为leu1-tyr2。desirudin用于手术时深度静脉血栓(dvt)的预防与治疗，lepirudin用于肝素诱导的血小板减少性疾病病人的抗凝治疗。此外，水蛭素在防治不稳定性心绞痛、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎及冠状动脉血栓等方面都具有巨大的潜在临床应用价值。
在多种恶性肿瘤患者中存在着血液高凝状态，如肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等。恶性肿瘤患者血液中的高凝状态，不仅能促进体内血栓形成，而且与肿瘤生长、侵袭以及转移明显相关。凝血功能变化可引起肿瘤细胞表型和活性改变，促进肿瘤细胞与血小板、内皮细胞、纤维结合蛋白(fibrinectin)以及vonwillebrandfactor(vwf)的黏附，从而使肿瘤细胞在局部增殖、浸润甚至向其他部位转移。血栓性疾病是仅次于肿瘤转移的恶性肿瘤患者第二大致死因素。对血栓形成高危的肿瘤患者及早进行药物性干预，对于延长患者生存期、降低死亡率有重要意义。研究表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。重组水蛭素通过其抗凝作用，抑制纤维蛋白的形成，能防止肿瘤细胞与血纤维蛋白或血小板凝集，使nk细胞或其他细胞毒效应细胞的活性得以发挥。已证明水蛭素治疗可发挥疗效的肿瘤有纤维肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤和白血病等。水蛭素还可配合化疗和放疗，通过促进肿瘤中的血流改善乏氧状态而增强疗效。
动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素均无明显毒副作用，半致死剂量远大于治疗所需剂量，机体易接受，免疫性弱，不影响血小板、纤维蛋白原水平和血红蛋白含量，不易通过血脑脊液屏障。无论急性、亚急性的毒性试验，水蛭素对呼吸、血压、心率均不影响。
水蛭素作为一种高效、直接、特异的凝血酶抑制剂，具有很强的抗凝、抗血栓以及抗炎等多种药理活性。与肝素等传统的抗凝药物相比，其治疗剂量小、疗效高、不会引起过敏反应。水蛭素有抗原性，但其抗体没有害，反而延长消除半衰期，是一种少见的正效果抗体。因此水蛭素的应用将会不断得到开拓和推广，重组水蛭素将会成为新一代的抗凝、抗栓和抗肿瘤新药。
水蛭素的缺陷之一是临床应用存在一定的出血危险。水蛭素可导致凝血相关参数，如活化部分凝血活酶时间(aptt)、凝血酶时间(tt)和凝血酶原时间(pt)等明显升高，从而可能引起全身或系统性出血风险。为此，国内吴祖泽等通过在水蛭素的氨基末端连接上可被凝血因子ⅺa(fⅺa)和ⅹa(fⅹa)识别并裂解的寡肽。当体内凝血系统被激活发生血栓时，利用血栓发生过程中引发的生物化学变化的特点，使氨基末端被封闭的水蛭素重新回复为水蛭素原形，在可能发生或已发生的血栓的局部发挥特异性抗凝作用，从而降低出血副作用，成为一类新型、安全、有效的抗凝剂。
水蛭素的另一缺陷是半衰期短。水蛭素在体内无降解，以活性成分经肾脏排泄，水蛭素从血浆消除较快。研究表明，水蛭素的抗凝作用完全取决于其血浆水平，因为其不仅在血液转运，而且作用部位也仅在血循环系统。水蛭素给药方式主要为注射给药，维持药效时间仅一个多小时，难以满足慢性高凝状态疾病患者长期抗凝治疗的需要，给需要长期抗凝的患者带来很大的痛苦和不便，因此临床期待着更加方便有效的非注射给药方法。此外，从天然水蛭组织中或基因工程发酵物中提取水蛭素，受到材料来源的限制，纯化产物往往带有杂蛋白的污染，不利于临床经静脉使用。
为解决水蛭素注射剂易经肾排泄半衰期短、对制备纯度要求较高、经常注射患者依从性差等问题，本发明因此而来。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种表达水蛭素的过继免疫细胞及其制备方法和用途，至少能够解决上述问题之一。
为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种表达水蛭素的过继免疫细胞，过继免疫细胞为人源免疫细胞，过继免疫细胞表达的重组水蛭素包括信号肽和水蛭素。
重组水蛭素的氨基末端连接上信号肽，将其编码基因利用基因工程技术转染过继免疫细胞，回输患者后，在肿瘤患者体内持续稳定表达重组水蛭素，发挥“微型细胞药厂”的作用。如此，通过过继免疫细胞作为载体细胞，可在体内长期稳定表达重组水蛭素，有效解决水蛭素半衰期短的弊端。
在一些实施方式中，信号肽为人源分泌信号肽，
在一些实施方式中，水蛭素为水蛭素异构体、水蛭素突变体、水蛭素嵌合体、截短的水蛭肽、基因修饰的水蛭素或水蛭素融合蛋白。
在一些实施方式中，过继免疫细胞为αβt、γδt、nkt、nk、dc、cik、car-t、car-nk、tcr-t中的一种或多种，上述的过继免疫细胞为天然或人工培养的免疫细胞。
在一些实施方式中，水蛭素为水蛭素异构体hv1，重组水蛭素的氨基酸序列为：seqidno.1，基因序列为：seqidno.2；
或者，水蛭素为水蛭素异构体hv2，重组水蛭素的氨基酸序列为：seqidno.3，基因序列为：seqidno.4；
或者，水蛭素为水蛭素异构体hv3，重组水蛭素的氨基酸序列为：seqidno.5，基因序列为：seqidno.6；
或者，水蛭素为水蛭素突变体，将野生型水蛭素(hv-3)肽链的ser32-asn33-gly34-lys35替换为arg32-gly33-asp34-ser35(rgds)，重组水蛭素的氨基酸序列为：seqidno.7，基因序列为：seqidno.8；
或者，水蛭素为水蛭素突变体，将野生型水蛭素(hv-3)肽链的ser32-asn33-gly34-lys35替换为arg32-gly33-asp34-met35(rgdm)，所述重组水蛭素的氨基酸序列为：seqidno.9，基因序列为：seqidno.10；
或者，水蛭素为水蛭素嵌合体，将野生型水蛭素hv-1和hv-3嵌合表达，所述重组水蛭素的氨基酸序列为：seqidno.11，基因序列为：seqidno.12。
或者，所述水蛭素为水蛭素融合蛋白，水蛭素氨基末端连接有可被凝血因子ⅹa识别并裂解的寡肽，所述重组水蛭素的氨基酸序列为：seqidno.13，基因序列为：seqidno.14；
或者，所述水蛭素为水蛭素嵌合体，将野生型水蛭素hv-1和hv-3嵌合表达，嵌合水蛭素氨基末端连接有可被凝血因子ⅹa识别并裂解的寡肽，所述重组水蛭素的氨基酸序列为：seqidno.15，基因序列为：seqidno.16；
或者，所述水蛭素为水蛭素突变体，将野生型水蛭素(hv-3)肽链的ser32-asn33-gly34-lys35替换为arg32-gly33-asp34-met35(rgdm)，水蛭素氨基末端连接有可被凝血因子ⅹa识别并裂解的寡肽，所述重组水蛭素的氨基酸序列为：seqidno.17，基因序列为：seqidno.18；
或者，所述水蛭素为水蛭素异构体hv1，水蛭素氨基末端连接有可被凝血因子ⅹa识别并裂解的寡肽，所述重组水蛭素的氨基酸序列为：seqidno.19，基因序列为：seqidno.20。
在一些实施方式中，重组水蛭素组成性表达或通过偶联诱导表达系统进行诱导表达。
在一些实施方式中，过继免疫细胞表达自杀基因/前药系统。
目前已经了解，水蛭素分子的氨基末端是其核心部分，含三对二硫键(cys6-cys14，cys16-cys28，cys32-cys39)，使氨基末端肽链绕迭成密集形核心环肽结构，与凝血酶的催化活性位点结合；而羧基末端为一无规则伸展的链状结构，其中gln49～gly54有空间和疏水作用，而asp55～pro60富含酸性氨基酸，带有负电荷，易与凝血酶碱性的底物识别位点结合。hv1/hv2的ser32-asp33-gly34-glu35或hv3的ser32-asn33-gly34-lys35为一突出于β-折叠间的loop结构，构象自由，对活性无明显作用。研究发现，hv3的羧基末端(hv354-66)与凝血酶的结合能力比hv1的羧基末端(hv154-65)更强。根据水蛭素的以上特性，将野生型水蛭素hv3肽链的ser32-asn33-gly34-lys35替换为arg32-gly33-asp34-ser35(rgds)。rgd序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成，存在于多种细胞外基质中，可与11种整合素特异性结合。该序列肽能够竞争性抑制包括纤维蛋白在内的各种粘附蛋白与血小板的结合，可达到抑制血小板与纤维蛋白结合的目的。rgd修饰水蛭素(hv3-rgd)具有抗血小板聚集能力。
在一些实施方式中，过继免疫细胞的膜表面表达有靶标分子，靶标分子通过跨膜序列定位在细胞膜表面。方便检测外源基因转染效率、分离纯化重组免疫细胞、体内监测过继免疫细胞的增殖情况和在必要时通过相对应的靶标抗体靶向灭活过继免疫细胞。
在一些实施方式中，靶标分子为cd19的全长或其截短片段，或cd20的全长或其截短片段。
相应地，本发明还提供了上述表达水蛭素的过继免疫细胞的制备方法，包括以下步骤：体外培养人源免疫细胞，制备编码重组水蛭素和膜型分子靶标的基因载体，基因载体由信号肽序列-水蛭素序列和信号肽序列-靶标分子序列-linker序列-跨膜段序列组合而成；将上述编码重组水蛭素和靶标分子的基因载体通过基因转染过继免疫细胞。
相应地，本发明还提供了上述表达水蛭素的过继免疫细胞的用途，表达水蛭素的过继免疫细胞用于抗凝治疗、抗栓治疗、抗肿瘤治疗，用于降血脂保健、抗凝保健、抗栓保健，用于手术时深度静脉血栓的预防与治疗，用于肝素诱导的血小板减少性疾病患者的抗凝治疗，防治不稳定性心绞痛、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎及冠状动脉血栓，防治高血脂、动脉粥样硬化。
本发明的有益效果为：
1、以过继免疫细胞为载体，在体内持续表达重组水蛭素或经过基因修饰的重组水蛭素，可解决水蛭素半衰期短的弊端，无需短时间内反复给药，更加适合需要长期抗凝、抗栓的患者。
2、以过继免疫细胞为载体，在体内持续表达重组水蛭素，可避免反复给药引起过敏或诱导抗体产生。
3、表达重组水蛭素的过继免疫细胞同时膜表达靶标分子，可作为靶标检测外源基因转染效率、分离纯化重组免疫细胞、体内监测过继免疫细胞的增殖情况和在必要时通过相对应的靶标抗体靶向灭活过继免疫细胞，使本技术临床使用更加安全可控。
4、表达重组水蛭素的过继免疫细胞可靶向肿瘤局部表达，改善肿瘤患者高凝状态，溶解微血栓，防止肿瘤转移，促进免疫细胞进入肿瘤内部发挥杀伤功能，可单独应用或临床配合化/放疗使用。
具体实施方式
下面对本发明作详细的说明。
本发明的表达水蛭素的过继免疫细胞，过继免疫细胞为人源免疫细胞，过继免疫细胞表达的重组水蛭素包括信号肽和水蛭素。信号肽为人源信号肽。信号肽可以为人酰胺化酶(apm)信号肽、人il-2信号肽、人il-21信号肽中的一种。
人酰胺化酶(pam)信号肽的氨基酸序列为：
magrvpsllvllvfpsscla，
基因序列为：
atggctggccgcgtccctagcctgctagttctccttgtttttccaagcagctgtttggct。
过继免疫细胞膜表面表达有靶标分子，靶标分子通过跨膜序列定位在细胞膜表面，过继免疫细胞表达的重组水蛭素包括信号肽和水蛭素。水蛭素为水蛭素异构体、水蛭素突变体、水蛭素嵌合体、截短的水蛭肽、基因修饰的水蛭素或水蛭素融合蛋白。
靶标分子为cd19的全长或其截短片段，或cd20的全长或其截短片段。过继免疫细胞为αβt、γδt、nkt、nk、dc、cik、car-t、car-nk、tcr-t中的天然或人工培养的免疫细胞。优选的过继免疫载体细胞为cik、nk、nkt或γδt细胞，可同时发挥肿瘤的非特异性细胞免疫治疗作用。
过继免疫细胞表达的重组水蛭素的水蛭素氨基末端连接有可被凝血因子识别并裂解的寡肽。凝血因子为ⅺa(fⅺa)和ⅹa(fⅹa)。
上述的可被凝血因子识别并裂解的寡肽有多种，例如，epr(基因序列gaacctagg)、iegr(基因序列atcgaaggtcgt)、lgpr(基因序列ttgggtccaaga)、lekrlgpr(基因序列ctcgagaaaagattgggtccaaga)、lekriegr(基因序列ctcgagaaaagaatcgaaggtcgt)。
重组水蛭素可以组成性表达，也可以偶联诱导表达系统进行诱导表达。诱导表达系统为四环素诱导表达系统、蜕皮激素(ecdysone)诱导表达系统、他克莫司(tacrolimus，fk506)/雷帕霉素(rapamycin)诱导系统或ru486诱导系统中的一种。
表达水蛭素的过继免疫细胞还表达自杀基因/前药系统。自杀基因/前药系统为单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊环鸟苷(hsv-tk/gcv)系统、带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶/阿糖甲氧基嘌呤(vzv-tk/ara-m)系统、胞嘧啶脱氨酶/5氟胞嘧啶(cd/5fc)系统、细胞色素p450微粒体酶cyp2b1/环磷酰胺(cyp2b1/cpa)系统；细胞色素p450cyp4b1/氨基蒽(cyp4b1/2aa)系统、脱氧胞苷激酶/阿糖胞苷(dck/ara-c)系统、乌苷-黄嘌呤磷酸核糖基转移酶/6-硫黄嘌呤(gpt/6tx)系统、硝基还原酶/cb1954(ntr/cb1954)系统、嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脱氧核苷(pnp/6-mep-dr)系统、胸腺嘧啶磷酸化酶/5’-脱氧-5-氟尿嘧啶(tp/5’-dfur)系统、羧基肽酶g2/cmda系统(cpg2/cmda)、羧酸酯酶/cpt-11(ce/cpt-11)系统中的一种。
上述的表达水蛭素的过继免疫细胞的制备方法，包括以下步骤：制备编码重组水蛭素和膜型分子靶标的基因载体，基因载体由信号肽序列-水蛭素序列和信号肽序列-靶标分子序列-linker序列-跨膜段序列组合而成；将上述编码重组水蛭素和靶标分子的基因载体通过基因工程技术转染免疫细胞。
基因工程技术为公知技术，所用基因转染系统包括慢病毒转染系统、逆转录病毒转染系统、腺病毒转染系统、腺相关病毒转染系统、睡美人转座子转染系统、质粒电转染系统。优选的，采用睡美人转座子转染系统或电转染系统。以瞬时表达载体，将重组水蛭素基因导入过继免疫细胞，可使其外源基因表达量可控，避免过量表达的风险。
编码重组水蛭素和膜型分子靶标的基因载体的结构为：信号肽-重组水蛭素-ires-信号肽-靶标分子-linker-跨膜段，或者，信号肽-靶标分子-linker-跨膜段-p2a-信号肽-重组水蛭素。
上述的表达水蛭素的过继免疫细胞用于抗凝治疗、抗栓治疗、抗肿瘤治疗，用于降血脂保健、抗凝保健、抗栓保健，用于手术时深度静脉血栓的预防与治疗，用于肝素诱导的血小板减少性疾病患者的抗凝治疗，防治不稳定性心绞痛、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎及冠状动脉血栓。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例的表达水蛭素的过继免疫细胞，其膜表面表达有靶标分子，靶标分子通过跨膜序列定位在细胞膜表面，所述过继免疫细胞表达的重组水蛭素包括信号肽和水蛭素。水蛭素为水蛭素异构体hv1。过继免疫细胞表达的重组水蛭素的结构为：信号肽-hv1，氨基酸序列为：seqidno.1，基因序列为：seqidno.2。
实施例2
本实施例的表达水蛭素的过继免疫细胞，其膜表面表达有靶标分子，靶标分子通过跨膜序列定位在细胞膜表面，所述过继免疫细胞表达的重组水蛭素包括信号肽和水蛭素。水蛭素为水蛭素异构体hv2，过继免疫细胞表达的重组水蛭素的结构为：信号肽-hv2，氨基酸序列为：seqidno.3，基因序列为：seqidno.4
实施例3
本实施例的表达水蛭素的过继免疫细胞，其膜表面表达有靶标分子，靶标分子通过跨膜序列定位在细胞膜表面，所述过继免疫细胞表达的重组水蛭素包括信号肽和水蛭素。水蛭素为水蛭素异构体hv3，过继免疫细胞表达的重组水蛭素的结构为：信号肽-hv3，氨基酸序列为：seqidno.5，基因序列为：seqidno.6。
实施例4
本实施例的表达水蛭素的过继免疫细胞，其膜表面表达有靶标分子，靶标分子通过跨膜序列定位在细胞膜表面，所述过继免疫细胞表达的重组水蛭素包括信号肽和水蛭素。水蛭素为水蛭素突变体，将野生型水蛭素hv3肽链的ser32-asn33-gly34-lys35替换为arg32-gly33-asp34-ser35(rgds)，过继免疫细胞表达的重组水蛭素的结构为：信号肽-hv3-rgds，氨基酸序列为：seqidno.7，基因序列为：seqidno.8。
该重组水蛭素同时具有抗血小板凝聚能力。
实施例5
本实施例的表达水蛭素的过继免疫细胞，其膜表面表达有靶标分子，靶标分子通过跨膜序列定位在细胞膜表面，所述过继免疫细胞表达的重组水蛭素包括信号肽和水蛭素。水蛭素为水蛭素突变体，将野生型水蛭素hv3肽链的ser32-asn33-gly34-lys35替换为arg32-gly33-asp34-met35(rgdm)，过继免疫细胞表达的重组水蛭素的结构为：信号肽-hv3-rgdm，氨基酸序列为：seqidno.9，基因序列为：seqidno.10
该重组水蛭素同时具有抗血小板凝聚能力。
实施例6
本实施例的表达水蛭素的过继免疫细胞，其膜表面表达有靶标分子，靶标分子通过跨膜序列定位在细胞膜表面，所述过继免疫细胞表达的重组水蛭素包括信号肽和水蛭素。水蛭素为水蛭素嵌合体，将野生型水蛭素hv1和hv3嵌合表达，所述重组水蛭素的结构为人酰胺化酶(pam)信号肽-水蛭素hv1-hv3嵌合体，其氨基酸序列为：seqidno.11，基因序列为：seqidno.12。
实施例7
本实施例的水蛭素为水蛭素融合蛋白，水蛭素氨基末端连接有可被凝血因子ⅹa识别并裂解的寡肽，所述重组水蛭素的结构为人酰胺化酶(pam)信号肽-epr-水蛭素hv1，氨基酸序列为：seqidno.13，基因序列为：seqidno.14。
寡肽epr还可以由同等功效的短肽序列替换。
本实施例的重组水蛭素具有可被凝血因子ⅹa识别并裂解的寡肽epr，这样既封闭了水蛭素在正常组织中的活性，降低了全身出血的风险，又可使重组水蛭素在血栓形成部位释放具有生物活性的水蛭素原形，达到抗凝和抗栓的双效目的。
实施例8
本实施例的水蛭素为水蛭素嵌合体，将野生型水蛭素hv1和hv3嵌合表达，嵌合水蛭素氨基末端连接有可被凝血因子ⅹa识别并裂解的寡肽，所述重组水蛭素的结构为人酰胺化酶(pam)信号肽-epr-水蛭素hv1-hv3嵌合体，氨基酸序列为：seqidno.15，基因序列为：seqidno.16
寡肽epr还可以由同等功效的短肽序列替换。
本实施例的重组水蛭素具有可被凝血因子ⅹa识别并裂解的寡肽epr，这样既封闭了水蛭素在正常组织中的活性，降低了全身出血的风险，又可使重组水蛭素在血栓形成部位释放具有生物活性的水蛭素原形，达到抗凝和抗栓的双效目的。
实施例9
本实施例的表达水蛭素的过继免疫细胞，其膜表面表达有靶标分子，靶标分子通过跨膜序列定位在细胞膜表面。水蛭素为水蛭素突变体，将野生型水蛭素hv3肽链的ser32-asn33-gly34-lys35替换为arg32-gly33-asp34-met35(rgdm)，过继免疫细胞表达的重组水蛭素的结构为：信号肽-寡肽epr-hv-3-rgds，氨基酸序列为：seqidno.17，基因序列为：seqidno.18。
寡肽epr还可以由同等功效的短肽序列替换。rgds可被同等功效的短肽序列替换。
本实施例的重组水蛭素具有可被凝血因子ⅹa识别并裂解的寡肽epr，这样既封闭了水蛭素在正常组织中的活性，降低了全身出血的风险，又可使重组水蛭素在血栓形成部位释放具有生物活性的水蛭素原形，达到抗凝和抗栓的双效目的。
实施例10
本实施例的表达水蛭素的过继免疫细胞，其膜表面表达有靶标分子，靶标分子通过跨膜序列定位在细胞膜表面.水蛭素为水蛭素异构体hv1，过继免疫细胞表达的重组水蛭素的结构为：信号肽-寡肽epr-hv1-rgds，氨基酸序列为：seqidno.19，基因序列为：seqidno.20。
寡肽epr还可以由同等功效的短肽序列替换。水蛭素异构体hv1可被hv2、hv3等其它水蛭素异构体替换。
本实施例的重组水蛭素具有可被凝血因子ⅹa识别并裂解的寡肽epr，这样既封闭了水蛭素在正常组织中的活性，降低了全身出血的风险，又可使epr-hv1在血栓形成部位释放具有生物活性的水蛭素原形，达到抗凝和抗栓的双效目的。
实施例11
制备实施例1～10任一表达水蛭素的过继免疫细胞的方法，包括以下步骤：体外培养人源免疫细胞，制备编码重组水蛭素和膜型分子靶标的基因载体，基因载体由信号肽序列-水蛭素序列和信号肽序列-靶标分子序列-linker序列-跨膜段序列组合而成；将上述编码重组水蛭素和靶标分子的基因载体通过基因转染免疫细胞。
基因转染系统采用睡美人转座子转染系统和电转染系统。以瞬时表达载体，将重组水蛭素基因导入过继免疫细胞，可使其外源基因表达量可控，避免过量表达的风险。
编码重组水蛭素和膜型分子靶标的基因载体的结构为：信号肽-水蛭素-ires-信号肽-靶标分子-linker-跨膜段，或者，信号肽-靶标分子-linker-跨膜段-p2a-信号肽-水蛭素。具体的，膜型分子靶标结构：gm-csfr信号肽-δcd20-linker-cd28跨膜段，δcd20为cd20的截短片段，linker的长度为2～15个氨基酸。膜型分子靶标的氨基酸序列为：seqidno.21，基因序列为：seqidno.22。
当重组水蛭素的基因序列在过继免疫细胞表达时，生成两个氨基酸序列：信号肽-水蛭素为一个，信号肽-靶标分子-linker-跨膜段为一个。
本实施例的过继免疫细胞采用cik细胞。具体的，本实施例的表达水蛭素的过继免疫细胞制备方法包括步骤s1～s3，具体如下。
s1、体外培养人源cik细胞，包括步骤a的外周血单个核细胞(pbmc)采集和步骤b的cik细胞培养。
a、pbmc的采集具有以下步骤：
a1、自患者体内抽取外周血50-100ml；
a2、淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化pbmc；
a3、无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90％以上的pbmc。
b、cik细胞的培养：
b1、将pbmc按1～2×106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000u/ml的重组人ifn-γ，37℃，5％co2培养箱中培养；
b2、24h后加入50ng/ml的cd3单克隆抗体和300u/ml的重组人il-2，刺激cik细胞的生长和增殖；
注：此时也可同时加入100u/ml的重组人il-1α。
b3、每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人il-2300u/ml；
b4、在培养的第14d，收获cik细胞。
其中，细胞培养基中还可添加5％～20％的自体血清。
s2、制备重组基因载体。
c、本实施列采用重组水蛭素异构体hv1，重组水蛭素hv1的氨基酸序列为：seqidno.1，基因序列为：seqidno.2。化学合成基因片段，n端添加nheⅰ限制性酶切位点，c端添加ecorⅰ限制性酶切位点。
d、本实施列采用靶标分子结构为：gm-csfr信号肽-δcd20-linker2-cd28跨膜段，其氨基酸序列为：seqidno.17，基因序列为seqidno.18。化学合成基因片段，n端添加bamhⅰ限制性酶切位点，c端添加notⅰ限制性酶切位点。
e、应用基因工程技术制备编码重组水蛭素和膜型分子靶标的基因载体，将信号肽序列-重组水蛭素序列和信号肽序列-靶标分子序列-linker序列-跨膜段序列两段基因分别克隆入pires质粒的两个克隆位点。所用基因工程技术为公知技术，简述如下：
按照已有的方法建立标准的限制性内切酶消化体系，然后利用nheⅰ和ecorⅰ处理pires质粒，回收大片段；利用相同的限制性内切酶nheⅰ和ecorⅰ处理并回收重组水蛭素异构体hv1基因片段，然后与上述酶切好的载体pires大片段相连，构建出重组水蛭素表达质粒pires-hv1；转化大肠杆菌dh5α后，筛选出阳性克隆并扩增。
纯化pires-hv1质粒，然后利用bamhⅰ和notⅰ处理pires-hv1质粒，回收大片段；利用相同的限制性内切酶bamhⅰ和notⅰ处理并回收重组gm-csfr信号肽-δcd20-linker2-cd28跨膜段基因片段，然后与上述酶切好的pires-hv1载体大片段相连，构建出同时表达重组水蛭素和膜型分子靶标cd20的双表达质粒pires-hv1/cd20。转化大肠杆菌dh5α后，筛选出阳性克隆并扩增，纯化pires-hv1/cd20质粒。
s3、纯化经步骤s2得到的pires-hv1/cd20重组质粒，用该重组载体以质粒电转染方法转染步骤s1得到的cik细胞，之后进行细胞培养36h以上，得到表达重组水蛭素的cik细胞，经流式细胞仪检测获得转染率，根据临床需要计算所需阳性细胞数量，回输肿瘤患者。
该表达重组水蛭素的cik细胞，用于抗凝治疗、抗栓治疗、抗肿瘤治疗，用于降血脂保健、抗凝保健、抗栓保健，用于手术时深度静脉血栓的预防与治疗，用于肝素诱导的血小板减少性疾病患者的抗凝治疗，防治不稳定性心绞痛、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎及冠状动脉血栓，防治高血脂、动脉粥样硬化。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110>何向锋
<120>表达水蛭素的过继免疫细胞及其制备方法和用途
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