本发明涉及干细胞培养
技术领域：
，尤其涉及一种细胞培养基及在脐带间充质干细胞培养中的应用。
背景技术：
：脐带间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出mscs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓mscs，免疫原性比骨髓mscs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。目前，对脐带间充质干细胞的培养体系主要应用含动物血清(如胎牛血清)的培养基，血清中含有细胞生长所需的生长因子、激素、载体蛋白、贴壁因子、微量元素以及其他营养物质，可以促进细胞生长，但含有血清的培养基存在携带病原体，利用动物血清培养的干细胞，其内部结构会发生何种变化尚未可知，为避免含动物血清培养中病毒等病原体污染和异种血清所致的过敏反应，目前有报道开发了不含有血清的培养基以培养干细胞，然而所得效果却不甚理想。因此，进一步开发适用于脐带干细胞的不含血清的培养基十分必要。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种细胞培养基及在脐带间充质干细胞培养中的应用，本发明提供的培养基中不包含动物血清，采用本发明提供的培养基培养获得的脐带间充质干细胞干性保持良好，细胞周期短，增殖能力强。本发明提供的细胞培养基包括基础培养基、egf、neaa、谷氨酰胺和条件培养基；所述条件培养基为以dmem/f12基础培养基培养脐带间充质间充质干细胞后所得上清液。一些实施例中，本发明采用的条件培养基的制备方法为：将p3代脐带间充质间充质干细胞复苏后接种入dmem/f12基础培养基于5％co2、37℃、饱和湿度为95％的co2培养箱中培养；每24h收集培养上清后，再补充新的dmem/f12基础培养基；共收集3次。具体的，本发明采用的条件培养基的制备方法包括：步骤1：取p3代脐带间充质间充质干细胞，，接种于15cm培养皿内，将间充质干细胞转移至5％co2、37℃、饱和湿度为95％的co2培养箱中复苏。当间充质干细胞汇合度达80％～90％时；以细胞清洗液清洗细胞2次；步骤2：每个培养皿内加入20mldmem/f12基础培养基，将间充质干细胞转移至5％co2、37℃、饱和湿度为95％的co2培养箱中培养；步骤3：24h后，收集培养上清于收集瓶内，每个培养皿内加入20ml新的dmem/f12基础培养基；步骤4：再24h后，收集培养上清于收集瓶内，每个培养皿内加入20ml新的dmem/f12基础培养基；步骤5：再24h后，收集培养上清于收集瓶内；合并3次收集的培养上清液，获得条件培养基。在本发明中，条件培养基的体积分数为25％～55％。一些实施例中，条件培养基的体积分数为25％～35％；另一些实施例中，条件培养基的体积分数为35％～45％；另一些实施例中，条件培养基的体积分数为45％～50％；另一些实施例中，条件培养基的体积分数为50％～55％。表皮细胞生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)能促进上皮细胞、成纤维细胞的增值；增强表皮细胞的活力；延缓表皮细胞的老化。高活性的egf才能促进皮肤细胞的分裂和生长，此外它还能刺激细胞外一些大分子(如透明质酸和胶原白等)的合成与分泌。在本发明中，egf的浓度为4.5ng/ml～5.5ng/ml。非必需氨基酸(non-essentialaminoacid，neaa)，包含7种细胞培养所需非必需氨基酸，即天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸。非必需氨基酸的添加能够增加细胞的繁殖力，延长细胞的生存时间。neaa可为自行配置也可为市场购得，本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。本发明采用的neaa为购自sigma的100×neaa。本发明中，neaa的体积分数为1％。谷氨酰胺，学名2-氨基-4-氨甲酰基丁酸，英文glutamine(gln)。谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，l-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。谷氨酰胺可为自行配置也可为市场购得，本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。本发明采用的谷氨酰胺为购自sigma的100×谷氨酰胺。在本发明中，谷氨酰胺的体积分数为1％。在本发明中，基础培养基为dmem/f12培养基。一些实施例中，本发明提供的细胞培养基包括：一些实施例中，本发明提供的细胞培养基包括：一些实施例中，本发明提供的细胞培养基包括：一些实施例中，本发明提供的细胞培养基包括：本发明提供的细胞培养基能够促进脐带间充质干细胞的增殖能力，且能够有效保持干细胞的干性。实验表明，采用本发明提供的细胞培养基对脐带间充质干细胞进行培养本发明提供的细胞培养基在培养脐带间充质干细胞中的应用。所述脐带间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。本发明还提供了一种培养脐带间充质干细胞的方法，以本发明提供的细胞培养基培养脐带间充质干细胞，培养至贴壁细胞汇合度达80％～90％，传代。在本发明中，培养的条件为37℃，co2体积分数5％，培养时间为48h～72h。在本发明中，传代以质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化细胞后，按照1×105个/ml的密度接种至本发明提供的培养基进行培养。本发明在基础培养基中添加、egf、neaa、谷氨酰胺和条件培养基，各组分共同对牙髓干细胞的生长起到了良好的促进作用。实验表明，采用本发明提供的培养基培养脐带间充质干细胞，能够缩短细胞周期，提高细胞增殖能力，提高干细胞的纯度和干性，且该培养基不含胎牛血清等动物源成分，通过该培养基获得的干细胞适合于临床应用。具体实施方式本发明提供了一种细胞培养基及在脐带间充质干细胞培养中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1～41)、制备条件培养基：步骤1：取p3代脐带间充质间充质干细胞，，接种于15cm培养皿内，将间充质干细胞转移至5％co2、37℃、饱和湿度为95％的co2培养箱中复苏。当间充质干细胞汇合度达80％～90％时；以细胞清洗液清洗细胞2次；步骤2：每个培养皿内加入20mldmem/f12基础培养基，将间充质干细胞转移至5％co2、37℃、饱和湿度为95％的co2培养箱中培养；步骤3：24h后，收集培养上清于收集瓶内，每个培养皿内加入20ml新的dmem/f12基础培养基；步骤4：再24h后，收集培养上清于收集瓶内，每个培养皿内加入20ml新的dmem/f12基础培养基；步骤5：再24h后，收集培养上清于收集瓶内；合并3次收集的培养上清液，获得条件培养基。2)、按照表1配方配置培养基。表1实施例1～43)、培养基质量检测对实施例1～4制得的培养基进行微生物检测和内毒素检测检测。其中，微生物检测(细菌、真菌)根据2015年版中华人民共和国药典第4部通则1100进行检测；内毒素检测根据2015年版中华人民共和国药典第4部通则1143进行检测。检测结果：实施例1～4制得的培养基在细菌、真菌和内毒素的检测中，均呈阴性。说明了该培养基的质量合格。4)、细胞培养效果检测将p2代脐带间充质干细胞分别接种于实施例1～4制得的培养基，接种密度为1×105个/ml，培养的条件为37℃，co2体积分数5％，饱和湿度培养至汇合度100％，然后观测细胞干性，细胞活率。结果如表2：表2细胞培养结果组别流式检测结果形态汇合度100％所需时间细胞活率实施例1合格一般3～4天96.91％实施例2合格较好3天96.96％实施例3合格最好2～2.5天97.21％实施例4合格最好2～2.5天97.15％所述流式合格是指cd73+≥95％，cd90+≥95％，cd105+≥95％、hla-dr+≤2％、cd45+≤2％、cd34+≤2％、cd11b+≤2％、cd19+≤2％；形态是指细胞形态是否为梭形，形状是否均一。结果显示，以本发明提供的培养基培养脐带间充质干细胞，所得细胞干性保持良好，形态符合脐带间充质干细胞形态，汇合度达到100％所需时间不足4天，细胞活率高于96％。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12