无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株和利用其的药物组合物的制作方法

本申请是分案申请，原申请的申请日为2012年5月17日，中国申请号为201280029877.2，国际申请号为pct/kr2012/003920，发明名称为“无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株和利用其的药物组合物”。本发明提供无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株和其多种应用。发明背景目前超过2,000种沙门氏菌菌株通常被分成宿主特异性血清型和对动物和人致病的非宿主特异性血清型。适应禽的病原体之中代表性的是鸡沙门氏菌（salmonellagallinarum，sg）和鸡瘟沙门氏菌（salmonellapullorum，sp），其已知分别引起禽伤寒和鸡白痢。这些沙门氏菌引起的禽疾病在发达国家以低频率发生，但是已使发展中国家的禽养殖遭受巨大的经济损失。血清学上，鸡沙门氏菌菌株具有相同的菌体抗原（o-抗原）结构和被分类为非运动型的，因为它们没有鞭毛。通过污染的饲料或污染的环境进入宿主动物之后，沙门氏菌经过胃肠道，并通过与淋巴集结细胞的微褶细胞（m）相互作用而侵入肠上皮细胞和穿入肠膜。沙门氏菌由m细胞输送给邻近肠膜中的巨噬细胞，然后沙门氏菌感染发展成全身性疾病。iii型分泌系统（ttss）是革兰氏阴性细菌中发现的蛋白附器，其由针状蛋白络合物结构组成，毒力效应蛋白通过其从细菌细胞质直接进入宿主细胞质（motaljetal.,annmed.(2005)；37(4):234-249）。iii型分泌系统对沙门氏菌的致病性的递送是必要的（schlumbergermcetal.,curropinmicrobiol.(2006)；9(1):46-54）。当附着和侵入宿主细胞时，野生型沙门氏菌利用ttss，然后在巨噬细胞的吞噬期间存活和通过血流循环遍及身体，引起全身感染。因此，没有正常的ttss运转，沙门氏菌感染不能进行。沙门氏菌致病岛-1（在下文中称作“spi-1”）是编码iii型分泌系统和毒力效应蛋白的沙门氏菌染色体的分散区域，iii型分泌系统和毒力效应蛋白对感染早期侵入肠上皮细胞是必需的（kimbroughtgetal.,microbesinfect,(2002)；4(1):75-82）。沙门氏菌致病岛-2（在下文中称作“spi-2”）也是编码iii型分泌系统和效应蛋白的沙门氏菌染色体的分散区域，ii型分泌系统和效应蛋白参与跨上皮细胞易位之后肠免疫器官或免疫器官如脾和肝中巨噬细胞的吞噬期间的存活和增殖（watermansretal.,cellmicrobiol,(2003)；5(8):501～511,abrahamsgl,cellmicrobiol,(2006)；8(5):728-737）。将spi-1和spi-2内的基因和它们的功能概括在下面的表1中。【表1】除了这些iii型分泌系统，存在于沙门氏菌的毒性质粒中的鞭毛基因（faehi）（edwardsraetal.,pnas(2000)；97(3):1258-1262）和毒性因子（spvrabcd操纵子）也牵涉沙门氏菌的毒力（guligpaetal.,molmicrobiol(1993)；7(6):825-830）。沙门氏菌引起的禽疾病难于控制，因为它们以多种方式传播包括卵传播和饲料或环境传染，并在用抗生素的传染后治疗之后显示高的复发率。因此，通过利用疫苗以及消毒养殖场和饲料对防止疾病发作是重要的。在养禽业中，许多努力已投入活疫苗（减毒鸡沙门氏菌菌株-sg9s、sg9r）和死疫苗的应用中（凝胶疫苗、油疫苗等）以防止鸡伤寒发作。然而，疫苗的效果随着使用的疫苗浓度、接种的禽的状况和鸡舍环境而变化。这些疫苗的效力被报道显著低于其它疾病疫苗的效力。用抗生素的治疗，虽然降低产生的损害，但是将感染的禽转变成慢性携带者（参见：incidenceandpreventionofhensalmonellosis,thenationalveterinaryresearch&quarantineservice,korea）。因此，正需求优于常规疫苗或抗生素的控制沙门氏菌的新方法。许多科学家最近已注意噬菌体，其特异地感染和裂解细菌并且对人安全，作为潜在的抗生素替代物。存在许多关于噬菌体用于预防或治疗沙门氏菌疾病（atterburyrjetal.,applenvironmicrobiol,(2007)；73(14):4543-4549）和用作消毒剂或洗涤剂以防止食物腐败的报道（pct1998-08944、pct1995-31562、ep1990-202169、pct1990-03122）和关于用于诊断的噬菌体展示技术的报道（rippsetal.,japplmicrobiol,(2006)；100(3):488-499）。通过剔除或修饰spi-2基因簇内的一个或两个基因而制备的沙门氏菌疫苗最近已被公开（us6923957、us7211264、us7887816）。对于工业应用，噬菌体在已接种进大规模培养的宿主细胞的噬菌体增殖期间通过将噬菌体后代从裂解的宿主细胞分离而产生。然而，关于对致病菌特异的噬菌体，它们的裂解物可含有正被去除的致病性宿主细胞、和/或毒性物质如宿主的致病性蛋白。这种可能性成为在致病性宿主细胞基础上产生的噬菌体的安全性的巨大危险因素。许多细菌在它们的染色体上具有溶源性噬菌体；然而，由于作为祖先残留物的许多突变的积累，大多数噬菌体是隐藏的和不能产生后代。虽然无活性，但是溶源性噬菌体可有助于宿主感染之后沙门氏菌的存活能力，因为它们含有裂解性和溶源性生长必需的基因，并且这些基因中的一些编码致病因子。然而，这些基因可能经历与新近感染动物的其它相似噬菌体的病毒基因组的同源重组，因此通常产生修饰的噬菌体。关于通常的鼠伤寒沙门氏菌，它具有fels-1、fels-2、gifsy-1和gifsy-2原噬菌体和两个隐蔽噬菌体。相比之下，鸡沙门氏菌可用作噬菌体产生宿主，因为鸡沙门氏菌既不具有原噬菌体也不具有隐蔽噬菌体，然后产生的噬菌体通常不通过重组遗传修饰（edwardsraetal,trendsmicrobiol,(2002)；10(2):94-99）。为了最小化后代产生期间的毒性残留物和噬菌体突变的机会，本发明人设计了鸡沙门氏菌的毒性基因簇可被灭活用于产生噬菌体的概念。不存在先前的情况，其中将已通过灭活毒性基因簇而从毒性细菌转化的无毒细菌用作噬菌体宿主细胞。除了噬菌体的产生，将通过灭活毒性基因簇而丧失毒力的沙门氏菌自身用于开发用于控制沙门氏菌的减毒活疫苗或应用于生物产业，保证显著的附加值。在本发明中，将通过灭活主要沙门氏菌毒性基因簇（spi-1、spi-2、spvrabcd和faehi操纵子）中至少一个而获得的无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株用作噬菌体-产生宿主细胞和应用于多种应用。技术实现要素：技术问题在上面描述的事实的基础上，本着解决在噬菌体产生过程中后代噬菌体的重组修饰和毒性细菌残留物的问题的目的，本发明人通过灭活四个主要的鸡沙门氏菌基因簇（spi-1、spi-2、spvrabcd和faehi操纵子）中至少一个而开发了用作噬菌体-产生宿主细胞的无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株。此外，本发明人通过测量鸡沙门氏菌侵入禽上皮细胞的效率而初步证实了减少的毒性，并通过测量用无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株感染的母鸡的死亡率而再证实。另一方面，通过野生型和无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株之间噬菌体生产力的比较，本发明人证实噬菌体-产生宿主、药物组合物和饲料添加剂用于预防或治疗禽沙门氏菌病。因此本发明的主要目的是提供修饰的鸡沙门氏菌菌株，其中spi-2基因簇被灭活；修饰的鸡沙门氏菌菌株，其中spi-1和spi-2基因簇均被灭活；和无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株，其中四个主要毒性基因簇（spi-1、spi-2、spvrabcd和faehi操纵子）中至少一个已被灭活。本发明的另一个目的提供无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株在沙门氏菌特异性噬菌体的产生中的应用或利用无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株产生噬菌体的方法。根据本发明的无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株可用于无残余毒性的沙门氏菌特异性裂解噬菌体的大规模产生和应用于具有高的工业实用性价值和保证显著附加值的抗生素替代物的新概念的开发。本发明的另一个目的是提供药物组合物，其包括无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株作为活性成份，优选活疫苗和饲料添加剂。spi-1基因簇编码iii型分泌系统蛋白，其保持在细胞表面上，充当抗原，而spi-2基因簇编码通过上皮细胞之后参与在吞噬体中存活的蛋白。因此，单独spi-2基因簇的灭活，spi-1基因簇保持不变，留下对引起免疫应答的抗体产生必需的抗原，但是不允许沙门氏菌在吞噬期间存活，因此不引起全身性疾病。因此，spi-2基因簇-灭活的鸡沙门氏菌菌株可用作活疫苗。问题的解决方案为了实现以上目的，本发明的一个方面提供无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株，其显著降低致病性。通过灭活毒性基因簇沙门氏菌致病岛-1、沙门氏菌致病岛-2、spvrabcd和faehi中至少一个使修饰的鸡沙门氏菌菌株无毒。如本文所用，术语“沙门氏菌的毒性基因簇”指涉及鸡沙门氏菌毒性的四个基因簇，包括编码iii型分泌系统的结构蛋白和毒性效应蛋白的沙门氏菌致病岛-1（在下文中称作“spi-1”）操纵子、编码iii型分泌系统的结构蛋白和毒性效应蛋白的沙门氏菌致病岛-2（在下文中称作“spi-2”）操纵子、编码禽沙门氏菌特异性毒性质粒上致病性活性蛋白的spvrabcd操纵子和编码菌毛的faehi操纵子。只要在鸡沙门氏菌中有功能地起作用，可使用任何基因簇。如本文所用，术语“基因簇”指染色体或质粒上通常对相同产物负责的相邻基因群。一个簇中的基因在共同调节基因的调节之下。细菌中基因的灭活可利用多种方法来完成。例如，通过基因表达信号结构的遗传修饰（突变）或还通过本领域已知的反义rna技术而无需过多实验。基因表达的信号结构是，例如，阻遏基因、激活基因、操纵基因、启动子、衰减子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子，但是不受限制（jensenandhammer,biotechnologyandbioengineering58:191195(1998),carrierandkeasling,biotechnologyprogress15:5864(1999),franchandgerdes,currentopinioninmicrobiology3:159164(2000),knippers（"moleculargenetics",第六版,1995）或winnacker（"genesandclones",1990），其每篇的内容通过引用被并入本文）。同样，可使用rna干扰机制（rna干扰：rnai），其通过引入由有义链和反义链组成的双链rna（dsrna）诱导靶基因mrna分解，有义链包括靶基因的mrna和其同源序列，反义链包括互补序列。此外，利用转座子——其可运动到单细胞基因组内的另一个位置——的方法可用于通过转座子介导的突变灭活基因以阻断靶基因的功能。导致基因簇的酶蛋白催化性质的改变或减少的突变从现有技术已知（qiuandgoodman（journalofbiologicalchemistry272:86118617(1997)）、yanoetal.,（proceedingsofthenationalacademyofsciences,usa95:55115515(1998)）、和wenteandschachmann（journalofbiologicalchemistry266:2083320839(1991)）。概括描述可在已知的遗传学和分子生物学课本，如例如hagemann所著的课本（"generalgenetics",1986)中找到，其每个的内容通过引用被并入本文。优选，基因簇灭活利用选自以下的方法来实现：基因中单个或多个核苷酸的修饰、单个或多个基因的剔除、外源基因插入基因、所有基因簇的剔除、抑制序列插入基因簇的启动子、启动子突变、抑制基因簇调节序列的表达的插入、针对基因簇中单个或多个核苷酸的rnai的引入、转座子介导的突变和其组合。上面描述的方法可通常被本领域技术人员理解和如所描述的进行（sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual,thirdedition（coldspringharborpress2001)）。例如，基因内活性位点的单个或多个核苷酸可被修饰以降低表达的蛋白的活性。可选地，可将抗生素抗性基因或其它基因（或多个）插入目的基因以阻止完整蛋白的表达。最优选的方法是从基因组剔除基因簇的全部序列（russellcbetal.,j.bacteriol.(1989)；171:2609-2613,hamiltoncmetal.,j.bacteriol.(1989)；171:4617-4622,linkajetal.,j.bacteriol.(1997)；179:6228-6237）。在本发明中，剔除目的基因簇的全部序列以有效地确保基因灭活。为此，可采用利用λred重组酶的一步剔除法——被称作剔除基因簇的方法，由datsenkkaetal.开发（datsenkokaetal.,pnas,(2000)；97(12):6640-6645）。关于将被剔除的毒性基因的信息，参考ncbi公开的鸡沙门氏菌染色体（肠炎沙门氏菌亚种肠炎血清型鸡种（salmonellaentericasubsp.entericaserovargallinarumstr.）287/91,nc011274）内毒性基因序列获得spi-1和spi-2的核苷酸序列。对于faehi操纵子序列，参考鸡沙门氏菌毒性质粒基因序列（鸡沙门氏菌毒性质粒小菌毛亚基基因，af005899）。对于spvrabcd操纵子，参考鼠伤寒沙门氏菌（salmonellatyphimurium）lt2的相同名称的基因序列——其与鸡沙门氏菌高度同源，因为其序列没有在ncbi中公开。鸡沙门氏菌spvrabcd操纵子的测序也参考鼠伤寒沙门氏菌的对应基因的序列来进行。沙门氏菌毒性基因簇的实例包括鸡沙门氏菌287/91的spi-1基因簇（seqidno：1）、spi-2基因簇（seqidno：2）、spvrabcd操纵子（seqidno：3）和faehi操纵子（seqidno：4）。为了制备已变得无毒的菌株，剔除至少一个毒性基因簇。本发明包括鸡沙门氏菌菌株，其中只有spi-2基因簇被灭活（sg3-d2）；鸡沙门氏菌菌株，其中spi-1和spi-2基因簇均被整体地灭活（sg3-d1d2）和鸡沙门氏菌菌株，其中所有四个毒性基因簇（spi-1、spi-2、spvrabcd和faehi）被整体地灭活（sg3-d4）。sg3-d2被保藏在登录号kccm11009p下，sg3-d1d2在登录号kccm11010p下，和sg3-d4在登录号kccm11011p下。对基因簇个别基因的独立剔除的研究已被报道（hapfelmeiersetal.,jimmunol,(2005)；174(3):1675-1685、brummesetal.,vetmicrobiol,(2007)；124(3-4):274-285、desintsetal.,infectimmun,jul(2009)；2866-2875），但是通过整体地灭活两个或多个全部基因簇开发的无毒沙门氏菌菌株尚未在本发明人的研究之前被公开。当只有spi-2基因簇被灭活时将鸡沙门氏菌菌株命名为鸡沙门氏菌sg2293-d2，当spi-1和spi-2均被整体地灭活时命名为sg2293-d1d2。另外，在灭活所有spi-1、spi-2、spvrabcd和faehi灭活之后将其命名为时sg2293-d4。术语“sg2293-d2”和“sg3-d2”、“sg2293-d1d2”和“sg3-d1d2”、和“sg2293-d4”和“sg3-d4”在本文可以可互换地使用。为了查明其毒性，测定根据本发明通过灭活毒性基因簇而制备的菌株侵入禽上皮细胞的效率和感染进禽之后的疾病爆发和死亡率（%）。优选，允许毒性基因簇已被灭活的鸡沙门氏菌菌株侵入禽上皮细胞以便可测量侵入效率。同样，将菌株注射进褐壳蛋层（brownegglayers）以测量死亡率。根据其另一个方面，本发明提供用于产生沙门氏菌特异性裂解噬菌体的无毒修饰的沙门氏菌菌株和利用其产生噬菌体的方法。将φcj1（us20100135962）——沙门氏菌特异性噬菌体——用于考查无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株的噬菌体生产率。噬菌体显示对鸡沙门氏菌和鸡瘟沙门氏菌的特异性杀菌活性，属于长尾病毒科（siphoviridae）b1家族的形态型组，被表征为等长的壳体和长的非收缩性尾，和具有61kb的总基因组大小和38kda和49kda大小的主要结构蛋白。产生根据本发明的噬菌体的方法包括在培养基中培养无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株、将噬菌体接种到培养基中和回收噬菌体。从这一点上，噬菌体可利用板简单地产生或利用肉汤大规模地产生。在利用板产生的情况中，当细菌进入对数期时，将噬菌体以合适的比接种到细菌中，与顶部琼脂混合和倒入板上。当噬菌斑出现时，收集顶部琼脂部分并离心，之后过滤上清液以提供噬菌体原液。对于作为肉汤的大量产生，以与板产生相同的方式制备噬菌体和细菌的混合物，并在新鲜肉汤而不是顶部琼脂中温育5小时。根据其另一个方面，本发明提供用于禽伤寒的预防或治疗的药物组合物，包括作为活性成份的无毒沙门氏菌菌株，并优选与无毒沙门氏菌菌株一起配制的用于禽伤寒的预防或治疗的疫苗。组合物或疫苗可任选地包括药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指不破坏活性成份的生物活性和性质和不刺激对象的载体或稀释剂。期望用于口服给药的制剂可以是以下形式：片剂、含片、锭剂、水性或油状悬浮液、粉剂、颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊、糖浆、酏剂等。关于口服形式如片剂和胶囊，活性成份可以与以下一起配制：粘合剂如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉；结合物如纤维素或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉或甘薯淀粉、或润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠或聚乙二醇蜡。关于胶囊，它们可进一步包括液体载体如脂肪油。可将本发明的组合物配制成用于非口服给药的制剂，如皮下注射剂、静脉内注射剂或皮内注射剂。为了这，可将本发明的组合物与稳定剂或缓冲剂在水中混合以制备溶液或悬浮液，然后将其配制成单位剂量如安瓿或玻璃瓶。如本文所用，术语“疫苗”指通过在注射进身体之后诱导抗体形成而提高对特定疾病免疫性的生物制剂，含有抗原，例如，引起疾病的微生物的死的或减毒形式的制剂。疫苗可从杀死的病原体来制备。还存在活疫苗，但是其毒性减弱。本发明的无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株具有与野生型相同的抗原蛋白，但是与野生型相比毒性大大降低，以便它们可用作预防禽伤寒的活疫苗。仍然根据其另两一个方面，本发明提供含有无毒修饰的鸡沙门氏菌的饲料，和优选含有无毒修饰的鸡沙门氏菌的饲料添加剂。当应用于禽时，本发明的饲料添加剂充当预防禽伤寒的活疫苗。当无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株是饲料添加剂或处于饲料添加剂的形式时，本发明的饲料可通过混合饲料与无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株来制备。在饲料中，无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株可处于液体或干燥状态。干燥状态可通过多种干燥方法来实现，包括，但不限于气流干燥、自然干燥、喷雾干燥和冷冻干燥。除了本发明的无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株，本发明的饲料可进一步包括用于提高饲料保存的通常添加剂。包括本发明的无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株的饲料可以是植物性物质如谷类、坚果、食品加工的副产物、粟、纤维、药物副产物、植物油、淀粉、含油种子膳食和谷类残留物或动物有机物质如蛋白质、矿物质、脂肪、矿物油、单细胞蛋白、浮游动物和剩余食物等包括本发明的无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株的饲料添加剂的实例包括，但是不限于用于防止质量变差和提高效用的各种剂，如粘合剂、乳化剂、防腐剂、氨基酸、维生素、酶、益生菌剂、调味剂、非蛋白氮化合物、硅酸盐、缓冲剂、着色剂、提取剂、寡糖等。同样，混合剂可在饲料添加剂的范围内。仍然根据其另一个方面，本发明提供利用药物组合物治疗鸡沙门氏菌传染病禽伤寒的方法。本发明的组合物可以以用于动物的药物制剂的形式，或通过与饲料或水混合而给予动物。优选，在施用前将其以饲料添加剂的形式与饲料混合。只要允许本发明的组合物到达目的组织或细胞，可以采用任何给药途径，如非口服、动脉内、皮内、经皮、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、口服或鼻内途径。本发明治疗方法包括以药学有效量给予本发明的组合物。对本领域技术人员来说将是明显的是，合适的总日剂量可由主治医师在医学判断的范围内确定。针对任何特定患者的特定治疗有效剂量水平可根据许多种因素而变化，包括期望的反应的种类和程度、特定的组合物、包括根据预期应用的任何其它剂的使用、患者的年龄、重量、总体健康、性别和饮食、给予时间、给药途径和组合物的排泄速度；与特定组合物组合或同时使用的其它药物的治疗持续时间；和化学领域熟知的类似因素。通常，组合物可以以104至108cfu的日剂量一次给予或以分开的剂量方式给予。有益效果将根据本发明的通过灭活毒性基因制备的无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株用作以工业规模有效生产沙门氏菌特异性裂解噬菌体的宿主细胞，具有节约成本的优势。无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株简化噬菌体生产之后用于去除毒性的纯化过程，因此大大减少生产成本和解决产品的安全性问题。此外，修饰的菌株可用作活疫苗，其保证较常规疫苗更高的免疫效应和安全性。附图简述本发明的以上和其它目的、特征和其它优势将通过阅读以下详细描述结合附图而被更清楚地理解，其中：图1是显示禽沙门氏菌的毒性基因（沙门氏菌致病岛-1、沙门氏菌致病岛-2、spvrabcd和faehi）和对应灭活毒性基因的引物位点的示意图；和图2是显示毒性基因灭活的鸡沙门氏菌菌株（sg3-d1、sg3-d2、sg3-d1d2和sg3-d4）连同对照野生型鸡沙门氏菌sg2293）、鸡沙门氏菌活疫苗（sg9r）和非致病的大肠杆菌（mg1655）体外侵入禽上皮细胞效率的图。侵入效率被表示为细胞内微生物计数除以培养基内微生物计数的百分数。以每孔8.0×107cfu的浓度使用微生物。实施发明的最佳方式在下文中，本发明将参考实施例被更详细地描述。然而，这些实施例只是示例性的，本发明不期望受这些实施例的限制。发明方式实施例1：通过鸡沙门氏菌毒性基因的比较来筛选将被灭活的靶基因制备无毒禽沙门氏菌菌株的第一步骤是筛选将被灭活的靶毒性基因。将沙门氏菌致病岛-1（spi-1）和沙门氏菌致病岛-2（spi-2）——其均是沙门氏菌致病性传递必需的三型分泌系统基因簇；和spvrabcd和faehi——其均是毒性质粒上的基因，确定为靶基因，和在ncbi数据库中检索靶基因核苷酸序列（肠炎沙门氏菌亚种肠炎血清型鸡种287/91，nc011274）。由于鸡沙门氏菌spvrabcd的核苷酸序列尚未被公开，所以参考具有与鸡沙门氏菌高度核苷酸序列同源性的鼠伤寒沙门氏菌（鼠伤寒沙门氏菌lt2质粒pslt,nc003277）的相同名称基因的核苷酸序列来合成引物。关于faehi操纵子，其核苷酸序列信息获自鸡沙门氏菌毒性质粒小菌毛亚基基因（af005899）。实施例2：通过鸡沙门氏菌毒性基因的灭活和通过灭活位点的整合来制备无毒修饰菌株2-1.鸡沙门氏菌毒性基因的灭活为了剔除如实施例1中所确定的野生型鸡沙门氏菌（sgscno.2293）的ttss相关毒性基因，使用datsenkokaetal.,（datsenkokaetal,pnas,(2000)；97(12):6640-6645）开发的利用λred重组酶的一步剔除法。将pkd3的氯霉素抗性基因用作识别插入进染色体靶位点的抗生素标记。利用表2的一对引物spi-1-p1（seqidno：5）和spi-1-p2（seqidno：6）——其对应avra的50bp的5侧翼区和invh基因的50bp的3侧翼区，其中包括从avra至invh的spi-1是剔除的靶，和一对pkd3的氯霉素抗性基因，进行聚合酶链反应（在下文中称作“pcr”）[sambrooketal,molecularcloning,alaboratorymanual(1989),coldspringharborlaboratories]，以pkd3作为模板。获得的pcr产物是约1100bp长的基因片段。在这一点上，使用pcrhl预混合试剂盒（bioneer）和进行在94℃变性30sec、在55℃退火30sec和在72℃延伸1min的30个循环。将pcr产物在0.8%琼脂糖凝胶上通过电泳分离和以期望的带大小洗脱。根据datsenkokaetal.的方法，将1100bp长基因片段引入pkd46-转化的感受态野生型鸡沙门氏菌，然后将其涂布在含有氯霉素（30mg/l）的lb板上。关于得到的转化体，其基因通过利用一对引物spi-1-p3（seqidno：7）和spi-1-p4（seqidno：8）——其对应距剔除靶基因的两个末端约1kb的区域——的pcr来考查。因此获得的pcr产物长3100bp，指示spi-1基因簇被灭活。将产生的菌株在37℃——去除pkd46载体的条件——温育以选择不能在含有氨苄青霉素（100mg/l）的lb板上生长的菌株。随后，将插入灭活基因簇的抗生素标记通过用pcp20转化来去除。抗生素标记的去除通过利用引物spi-1-p3和spi-1-p4的pcr来鉴定。产生的pcr产物长2000bp，也指示灭活。然后，将现在不含抗生素标记的菌株在42℃（去除pcp20的条件）培养以选择不能在含有氨苄青霉素的lb板上生长的菌株。将因此获得的spi-1基因簇灭活的菌株命名为sg3-d1（鸡沙门氏菌sg2293::△spi-1）。2009年7月2日将sg3-d1菌株以登录号kccm11009p保藏在韩国首尔seodamun-gu,yurimb/dhongje-dong韩国微生物保藏中心。也将spi-2、spvrabcd和faehi基因簇以与spi-1基因簇相同的方式灭活。将产生的基因簇灭活的菌株分别命名为sg3-d2（鸡沙门氏菌sg2293::△spi-2，登录号kccm11009p）、sg3-ds（鸡沙门氏菌sg2293::△spv）和sg3-df（鸡沙门氏菌sg2293::△fae）。将用于剔除基因和用于鉴定基因剔除的引物概括在下面的表2中。【表2】2-2.iii型分泌系统相关毒性基因灭活的整合为了整体地灭活一个菌株中的基因簇，将sg3-d1菌株随后利用与实施例2-1相似的方法进行spi-2、spvrabcd和faehi基因簇的灭活。首先，利用引物spi-2-p1（seqidno：9）和spi-2-p2（seqidno：10）进行pcr用于灭活spi-2簇基因的目的，pkd4充当模板，产生1600bp基因片段。将该pcr产物引入sg3-d1菌株，其中pkd46载体保留（实施例1-2），之后将细菌涂布在含有卡那霉素（50mg/l）的lb板上。关于产生的转化体，其基因通过利用一对引物spi-2-p3（seqidno：11）和spi-2-p4（seqidno：12）——对应剔除靶基因的两个侧翼区——的pcr来考查。因此获得的pcr产物长3600bp，指示spi-2基因簇被灭活。将产生的菌株在37℃——去除pkd46载体的条件——培养以选择不能在含有氨苄青霉素（100mg/l）的lb板上生长的菌株。随后，将插入灭活基因簇的抗生素标记通过用pcp20转化来去除。抗生素标记的去除通过利用在spi-1的情况中的引物spi-1-p3&spi-1-p4和在spi-2的情况中的引物spi-2-p3&spi-2-p4的pcr来鉴定。产生的pcr产物长2000bp，也指示已发生灭活。然后，将不含抗生素标记菌株在42℃（去除pcp20的条件）培养以选择不能在含有氨苄青霉素的lb板上生长的菌株。将因此获得的spi-1和spi-2基因簇灭活的菌株命名为sg3-d1d2（鸡沙门氏菌sg2293::△spi-1△spi-2，登录号kccm11010p）。2009年7月2日将sg3-d1d2菌株以登录号kccm11010p保藏在韩国首尔seodamun-gu,yurimb/dhongje-dong韩国微生物保藏中心。在sg-d1d2菌株中，将spvrabcd和faehi基因簇进一步灭活。为此，将spvrabcd基因簇（将pkd4的卡那霉素抗性基因用作抗生素标记）以与实施例1-2中spi-1灭活相同的方式灭活，而faehi基因簇（将pkd3的氯霉素抗性基因用作抗生素标记）的灭活以与spi-1灭活的菌株中spi-2灭活相同的方式进行。关于产生的转化体，将它们的基因通过利用用于spvrabcd剔除的引物组spv-p3（seqidno：15）和spv-p4（seqidno：16）和用于faehi剔除的引物组fae-p3（seqidno：19）和fae-p4（seqidno：20）——其对应距各自的剔除靶基因的两个末端1kb的区域——的pcr来考查。因此获得的pcr产物分别长3600bp、3100bp，指示spvrabcd和faehi基因簇被灭活。将产生的菌株在37℃——去除pkd46载体的条件——培养以选择不能在含有氨苄青霉素（100mg/l）的lb板上生长的菌株。将其中所有四个基因簇spi-1、spi-2、spvrabcd和faehi被整体灭活的鸡沙门氏菌菌株命名为sg3-d4（鸡沙门氏菌sg2293::△spi-1△spi-2△spvrabcd△faehi）和于2009年7月2日以登录号kccm11011p保藏在韩国首尔seodamun-gu,yurimb/dhongje-dong韩国微生物保藏中心。2-3.鸡沙门氏菌spvrabcd操纵子的测序没有任何地方已经公开关于鸡沙门氏菌（sgscno.2293）的spvrabcd的遗传信息。其核苷酸序列在本发明中被分析。为了这，如下面表3所概括地合成引物。【表3】spv-s1（seqidno：21）ggtcaattaaatccactcagaaspv-s2（seqidno：22）acgggagacaccagattatcspv-s3（seqidno：23）ttcagtaaagtggcgtgagcspv-s4（seqidno：24）ccaggtggagttatctctgcspv-s5（seqidno：25）actgtcgggcaaaggtattcspv-s6（seqidno：26）tttctggttactgcatgacagspv-s7（seqidno：27）tccagaggtacagatcggcspv-s8（seqidno：28）gaaggaatacactactataggspv-s9（seqidno：29）gtgtcagcagttgcatcatcspv-s10（seqidno：30）agtgaccgatatggagaaggspv-s11（seqidno：31）aagcctgtctctgcatttcgspv-s12（seqidno：32）aaccgttatgacattaagaggspv-s13（seqidno：33）taaggctctctattaacttacspv-s14（seqidno：34）aaccgcttctggctgtagcspv-s15（seqidno：35）ccgtaacaatgacattatcctc分析结果在seqidno：3中给出。实施例3：通过测量进入禽上皮细胞的侵入效率而对毒性基因簇灭活的鸡沙门氏菌sg3-d4无毒性的测定鸡沙门氏菌和鸡瘟沙门氏菌——由于缺少能动的鞭毛，其是独特的沙门氏菌种类——特异地感染禽细胞和可侵入其它动物细胞，但是效率非常低。在该实施例中，体外细胞侵入试验（hendersonscetal,infectimmun,(1999)；67(7):3580-3586）在md.lee,乔治亚大学提供的禽上皮细胞系bat（budgerigarabdominaltumor）上进行。期望基于降低水平的ttss相关蛋白，通过上面描述的基因剔除法形成的修饰的鸡沙门氏菌菌株sg3-d1d2和sg3-d4以非常低的效率侵入宿主细胞。最近的关于致病微生物感染机制的研究综述显示，甚至当只有spi-1的特定基因剔除时，沙门氏菌菌株才显示进入上皮细胞的侵入效率降低（lostrohcpetal,microbesinfect,(2001)；3(14-15):1281-1291）。在本发明中，通过测量禽修饰的沙门氏菌菌株侵入禽上皮细胞系bat的效率证明ttss相关基因剔除导致毒性降低。将进入禽上皮细胞的侵入效率在24孔板上以一式三份进行测量，并给出三个测量的平均值。将bat细胞系在37℃在补充10%胎牛血清、1mm谷氨酰胺、100iu/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem中在5%co2的条件下培养。将bat细胞系以2.5×105细胞/孔的密度接种进24孔板和在37℃在5%co2培养箱中温育1-2天，形成单层细胞。细胞分布和温育一天之后，将培养基换成不含抗生素的dmem。为了比较侵入效率，利用野生型鸡沙门氏菌sg3（sgsc#：2293）、毒性基因簇灭活的鸡沙门氏菌菌株sg3-d1、sg3-d2、sg3-d1d2和sg3-d4以及sg9r——其是商业上可获得的活疫苗，非致病的大肠杆菌mg1655充当对照。最初的种子培养之后，将所有的测试细菌在主lb培养基中旺盛地温育4-5小时和将培养物稀释到od600=1.0。向在不含抗生素的培养基中温育的200μl动物细胞，加入200μl各种稀释的培养物，以便将细菌以每孔2.0×108cfu/ml的浓度等分。将板在37℃在5%co2气氛中培养一小时以允许细菌穿透上皮细胞。此后，将培养基吸出和将板用1×pbs洗以去除剩下的微生物。然后，将上皮细胞于37℃在存在50μg/ml庆大霉素的情况下在5%co2培养箱中温育2小时，以清除残留在细胞外部的微生物。将抗生素通过用1×pbs洗来去除。为了考查成功穿透进上皮细胞的微生物，将动物细胞在500μl0.1%tritonx-100裂解15-30min。将细胞裂解物涂布在lb板上和在37℃温育过夜以便已生长的微生物可被计数。为了计算侵入效率，也温育200μlod600=1.0的微生物培养物。侵入效率（%）=侵入细胞的微生物的计数/培养基内微生物的计数（od600=1.0）×100计算通过毒性基因簇灭活而制备的四个转化的鸡沙门氏菌菌株的bat细胞侵入效率。它们之中，修饰的菌株——其中只有负责细胞侵入机制的spi-1基因簇被灭活——与野生型相比侵入效率降低84%。发现spi-1和spi-2均剔除的sg3-d1d2修饰的菌株和所有四个基因簇都剔除的sg3-d4修饰的菌株的细胞侵入效率与野生型鸡沙门氏菌（sg3）相比分别降低大约89%和91%。本发明的修饰的菌株与商业上可获得的活疫苗nobilissg9r相比还显著降低侵入能力。这些数据显示ttss相关基因簇的灭活降低鸡沙门氏菌的毒性（参见表4和图2）。【表4】（sg3100%＝实际0.36%侵入效率）修饰的鸡沙门氏菌菌株sg3-d4的无毒性通过显示进入禽上皮细胞非常低的侵入效率的体外试验得到证实，并在动物试验中再次证实，结果在实施例4中给出。实施例4：通过测量鸡死亡率而进行的鸡沙门氏菌sg3-d4无毒性的测定委托首尔国立大学兽医科学研究院进行该测定。将一周龄的褐壳蛋层（hy-line鸡）分成许多组，一组10个，用病原体感染之前将这些组分入各自的鸡舍中。孵出之后不对试验动物使用疫苗程序。离体试验中利用五种禽沙门氏菌菌株，包括野生型鸡沙门氏菌sg3（sgsc#：2293）、毒性基因簇灭活的鸡沙门氏菌sg3-d2和sg3-d4（通过体外侵入试验鉴定毒性降低）、商业上可获得活疫苗nobilissg9r和非致病的大肠杆菌mg1655。最初的种子培养之后，将五个菌株在主lb培养基中旺盛地温育4-5小时到od600=1.0，和将细胞培养物中每个的浓度调节到1.0×108cfu/ml。将细菌以调节的剂量皮下注射进鸡，然后针对死亡率监测鸡两周。随后，对鸡进行活体解剖以考查损害和分离细菌。病原体（1.0×108cfu/ml）人工感染之后的两周，观察用修饰的鸡沙门氏菌（sg3）感染的鸡和显示典型的外部综合征如低运动性、蓝色腹泻和低饲料摄取，并且看起来快死了。死亡率不高，但是尸体剖检在几乎所有鸡中显示损害。相比之下，观察到用修饰的鸡沙门氏菌菌株（sg3-d4）感染的鸡组活跃地运动并没有死，虽然它们中的一些在两周期间具有腹泻。同样，尸体剖检中发现它们几乎没有损害。因此，再次证明本发明的修饰的鸡沙门氏菌菌株已大大降低毒性。观察到用修饰的sg3-d2菌株——其中负责最初侵入宿主细胞的基因保持完整而参与全身感染和吞噬之后存活的spi-2基因被灭活——或用修饰的sg3-ds菌株——其中已知参与致病性的spv基因被灭活——感染的鸡组具有低的死亡率或没有死亡率（%）。因此，甚至单基因簇的灭活对致病性的降低都有很大影响（参见表5）。【表5】在用野生型鸡沙门氏菌（sg3）感染的鸡组中，根据尸体剖检发现，肝和脾肿大和衰弱，具有显著频率的青褐色或蓝绿色肝损害。然而，象商业上可获得活疫苗nobilissg9r或非致病的大肠杆菌mg1655一样，发现本发明的毒性基因簇灭活的菌株（sg3-d1d2和sg3-d4）几乎没有损害，和显示对鸡无害。实施例5：对修饰的鸡沙门氏菌菌株特异的фcj1噬菌体生产率的比较最后，无毒沙门氏菌菌株的开发将应用于产生沙门氏菌特异性裂解噬菌体。在实施例3和4中，证明实施例2中制备的修饰的沙门氏菌菌株已大大减弱了毒性。最后，将фcj1（韩国专利申请号10-2008-121500/us20100135962）——其特异地感染禽沙门氏菌——用于考查野生型和修饰的鸡沙门氏菌菌株之间的噬菌体生产率差异。将禽特异性噬菌体фcj1大规模培养，野生型鸡沙门氏菌菌株（sg3）或修饰的菌株充当宿主细胞。为了这，将每个细菌菌株在烧瓶的50mllb肉汤中振摇培养到0.5的od600（2.5×1010菌落形成单位（cfu））。将фcj1以1.25×109pfu（噬斑形成单位）接种以形成0.05的moi（感染复数），和允许在37℃保持20min，之后在37℃另外温育4小时。将氯仿以终体积2%的量加入和振动20min。上清液通过0.2μm过滤器之后，计算фcj1的滴度。将фcj1以6×1011pfu/ml的滴度从野生型菌株（sg3）产生和以8×1010pfu/ml的滴度从修饰的鸡沙门氏菌菌株（sg3-d4）产生。这些数据显示，通过灭活毒性基因簇制备的修饰的菌株对用噬菌体感染没有问题和可用作产生噬菌体的宿主细胞（参见表6）。此外，利用修饰的菌株作为宿主细胞产生фcj2（us20100158870）和фcj3（us20100166709）——其均由相同的申请人开发的。发现宿主细胞允许以大约2×1010pfu/ml的滴度产生фcj2和以大约5×109pfu/ml的滴度产生фcj3。象фcj1一样，将фcj2和фcj3从本发明修饰的菌株产生，与野生型没有显著差异。【表6】如迄今所描述的，根据本发明通过灭活毒性基因制备的无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株用作宿主细胞，用于以工业规模有效地生产沙门氏菌特异性裂解噬菌体，具有节约成本的优势。无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株简化噬菌体产生之后用于去除毒性的纯化过程，因此大大减少生产成本和解决产品的安全性问题。此外，无毒修饰的菌株可用作活疫苗，其较常规疫苗保证更高的免疫效应和安全性。虽然本发明的优选实施方式已为了说明的目的而被公开，本领域技术人员将理解，各种修改、添加和替换是可能的而不背离如所附权利要求中所公开的本发明的范围和精神。关于用于专利程序的微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约国际表格1适用第6.4(d)条时，该日期是获得国际保藏机构状态的日期；于布达佩斯条约之外进行的保藏在获得国际保藏机构状态后转变为布达佩斯条约下的保藏时，该日期是国际保藏机构收到该微生物的日期。bp/4表单页关于用于专利程序的微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约国际表格1适用第6.4(d)条时，该日期是获得国际保藏机构状态的日期；于布达佩斯条约之外进行的保藏在获得国际保藏机构状态后转变为布达佩斯条约下的保藏时，该日期是国际保藏机构收到该微生物的日期。bp/4表单页关于用于专利程序的微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约国际表格1适用第6.4(d)条时，该日期是获得国际保藏机构状态的日期；于布达佩斯条约之外进行的保藏在获得国际保藏机构状态后转变为布达佩斯条约下的保藏时，该日期是国际保藏机构收到该微生物的日期。bp/4表单页序列表<110>cj第一制糖株式会社<120>无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株和利用其的药物组合物<130>opa09048-cn-div1<150>us61/487,137<151>2011-05-17<150>us13/274,854<151>2011-10-17<160>35<170>kopatentin1.71<210>1<211>34934<212>dna<213>人工序列<220><223>沙门氏菌致病岛-1<400>1ttacgatttaagtaaagacttatattcagctatcctttttttatgagcggatatagagag60ttttttatcgtttagcataacggcattgttatcgaatcgctcataaagcgtttcattctt120tttgtttactatactgcttcccgccgccggattggcctccacatattcatttaatcgttg180tacgccttgagtatgtttgtaaaaactcaccggcagataacggtctgctttatcggacgg240gagaaaaggttcttcaccacacagacgttcacaaatattatcttcatgaatttttactaa300gttcataaattcaagctgaagttttttggcgagcgccaggctaaaaataccgcattcaga360agagcttcgttgaatgtccagctcgaccatagcaaaataacaatcaggcagttgttcacg420ttcaagagctgctttggtcctcaacgccagtaaagcaggtccaaaagcgctacacgctgc480tggttcgaacaaaatcaccgatgtctttccgtccataactctaaaatcgacgactgaaat540atggatacctgaacttcccatatttacgagaaatcgggcagattcaacgccttccattct600ggtctcctttatagaggaaacaagctcatggactgacataacaaatttaagatttaactc660tggatacttcttattggcctgtgcaacaagaaaaggcatcatttcgagatcggtttcctc720gtaactgatatgaatccagctgccatctataatttcactttccagacgctcaacaataca780ggtcaatgcttcggtgtttagctccccgctgacgtcaggctgaggcgataaactcgcccc840catattacgagtcgtaggacttagcatacttttccctccacatgatagctcctgcaccga900aaatatcatctttaacttttcagattcaatatattgcctgcaaaaatatgcctcaatgat960tgagccaggctaccaaccacctccggatgattatatataagaattactactcaaaaaatc1020ttttttataataaaagctcaacacatggtcataaatgataaaaaatattttaattcattc1080ctaccgcaatcggtaacgcgcaattatcgtcaggtacagcagggttatgtgcaaaagcag1140tgcgctgtaaatgcgcgtctagtttcagtccccggaacagcgatagcggtgaagagtcca1200tccccaaacgatacataaccttcttacgataaatactgacggtttttgttcccagaccaa1260attttttcgccagttcaattgccggatgtccggaggataataatatcagcagcgcatatt1320tcgcctgcgtgacaccgggaggtagattccaccaggcgtattgattgatattaaacaata1380cctcttccggcgtctcgccggcattaaaagcatacgtagcagccacggttttcttttgtg1440gcctgtggcagaaacgcagccaggcttccggaagacggagcttctctcgctccgagcgga1500tagcgcaggatagttcgtcttttaaaacataatccataacgccaaaatattgcagcacac1560agcgatcgatataatacaagcgatctgccactaccaaaactttacggttctgcaaccgcg1620tcagcaacgcatgaaaaagataaacatgctcatgcgggttcaaagctaaaatcagcccgg1680cgtccggcatatcggatagagaatgcaaaagtgcggttaatgagttacacgttttaacgc1740acttttccggatatttttgcttaaaaatagactgaagggcataacaattagtccagttaa1800taccgtatataattacatttctcatttatttatccttttttgaaaactgaccacagcttc1860ggtaatgatttttcttcctgggcgactactgcgcaagtagataacgccttcttactacaa1920aggtaataagaccagatacgttattacatgcgcaatgtcgttaccgaaatgaattccttt1980tacaaatctgataatgattaaatttactgttttactttactgtaatctcttagagtacaa2040cgattgcccggcgcctggtggccatgtatgtctgacaatgaacgctttcgattccctttc2100attaactacatatcactggtgtagcgatactgaaatatacactacgattaaaaaaatatt2160tggtatctgtaacgcaaacagatagtaacgtttaaaataatttcacaaatcaatggttca2220tcgtacgcataaagctaagcggtgtaatcttaaaatgccgtttaaaaatagcgataaaat2280aagaaggcgtatcatagccacacatcgtcgcgacttgtgaaatatttccagcccccatac2340gtaataattttatagcctgattcatacgagcatctaggtatattttgctaaaactcacct2400cttcagcggccagttttcgcttcagacttgatacgctcataaacagctttcccgccacct2460cagcctgtgaccatttgcgggtgagatcgctgataataatgttataaactttctcttttg2520tcgtaatttttattgctcgctcaaggaaatcaaacccaccgggcttacgtacaaatgccg2580atataagatacatcaatgagaaatatgaataatcatgatcatcaatactcacattactac2640aaacccgtggacatgccacaccatgcaaaatagagtcaaaagtatcactcatccctggca2700acaagtccgcatgaaaaaaatactttggtttcgtttttaatgatagctctcgatcattat2760agtttcttgtactgtaaaaaactttgtagaatttttg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