本发明涉及一种采用全细胞转化生产阿斯巴甜的方法，属于生物工程领域。
背景技术：
阿斯巴甜是一种新型高效的甜味剂，为jamesm.schlatter于1965年发现。阿斯巴甜的甜味大约是蔗糖200倍，热量仅为蔗糖的1/200，具有清凉感，和其他的甜味剂比较而言具有味质佳，安全性高等优点，因此，在甜味剂的添加方面具有很广的应用范围。
阿斯巴甜是一种人工合成的甜味剂，在自然界中尚未发现。阿斯巴甜的合成方法分为化学合成法和生物合成法。化学合成法是较早使用的方法，它是以l-天冬氨酸、l-苯丙氨酸为主要原料，通过氨基保护、內酐、缩合、水解、酯化、中和等反应步骤来完成的。在化学法的合成中具有很大的弊端，需要对天冬氨酸的氨基和β-羧基进行保护，并且还需要对α-羧基进行活化处理，反应的过程中伴随着少量的β位副产物以及由化学反应条件导致的少量消旋作用产生的d型副产物，由于d型阿斯巴甜具有苦味，所以在后期还需要对副产物进行分离。
阿斯巴甜的生物合成法相对于化学合成法专一性强、反应转化率高且条件温和，因此越来越多的研究者开始对此进行研究。生物合成法主要是酶法，即使用蛋白酶，将l-asp(氨基已保护或未保护)与l-phe·ome缩合在一起，其余反应操作与化学合成法一样。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种高效生产阿斯巴甜的方法，即构建含有来源于蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)wq9-2(cctccno：2010010)的耐有机溶剂蛋白酶wq9-2基因的重组质粒，转化大肠杆菌构建全细胞催化剂，以此菌株高效转化苄氧羰基天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯生产阿斯巴甜，从而解决了工业化阿斯巴甜生产高成本、低得率、污染严重的问题。
为此，本发明首先提供了一种重组大肠杆菌，是将来源于蜡样芽孢杆菌wq9-2的蛋白酶基因与载体pet-20b(+)连接，构建重组质粒，转化大肠杆菌bl21(de3)得到。
本发明还提供培养所述重组大肠杆菌使之产蛋白酶的方法，是在3lnbs发酵罐中进行，以1％接种量接种到1.8l发酵培养基中，搅拌转速、通气量和温度分别为400rpm、1.0vvm和28℃，当od600达到0.6，加入0.4mmiptg诱导wq9-2蛋白酶基因表达。
所用种子培养基：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，nacl1g，蒸馏水定容至100ml。
所用发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4ml。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100ml灭菌的17mmol/lkh2po4和72mmol/lk2hpo4的溶液(2.31g的kh2po4和12.54g的k2hpo4溶于水中，终体积为100ml，高压灭菌)。
本发明还提供应用所述重组大肠杆菌生产阿斯巴甜的方法，是收集发酵培养得到的重组大肠杆菌菌体作为全细胞催化剂，在ph值为4-8的缓冲体系中，添加摩尔比为1:2～1:6的苄氧羰基天冬氨酸：苯丙氨酸甲酯，苄氧羰基天冬氨酸的添加量为40～50mm，菌体添加量为18～20.0g湿菌体/l。
在本发明的一种实施方式中，全细胞转化体系为：苄氧羰基天冬氨酸50mm，苯丙氨酸甲酯300mm，湿菌体全细胞催化剂20.0g/l，反应在20mmtris-hcl(ph8.0)中进行，37℃，200rpm转化24h。
在本发明的一种实施方式中，全细胞转化体系ph值8。
在本发明的一种实施方式中，苄氧羰基天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯的反应体系摩尔比为1:6。
在本发明的一种实施方式中，所述收集发酵培养得到的重组大肠杆菌菌体作为全细胞催化剂，是在发酵过程中添加iptg诱导5h后，8000rpm低温离心10min，收集菌体，用20mmtris-hcl(ph8.0)缓冲液洗两遍菌体得到全细胞催化剂。
本发明采用基因工程法构建含有来自于bacilluscereuswq9-2(cctccno：2010010)的耐有机溶剂蛋白酶wq9-2基因的重组质粒，并进一步构建重组大肠杆菌用作全细胞催化剂，高效催化苄氧羰基保护的天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯合成阿斯巴甜前体苄氧羰基保护的阿斯巴甜。
具体实施方式
材料与方法
种子培养基：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，nacl1g，自来水定容至100ml。
发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4ml。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100ml灭菌的17mmol/lkh2po4和72mmol/lk2hpo4的溶液。
耐有机溶剂蛋白酶wq9-2的酶活测定方法：配制酪蛋白含量为2％的tris-hcl缓冲液(ph8.0)作为反应底物。取500μl细胞悬浮液加入300μl反应底物，40℃反应10min，加入500℃tca终止缓冲液。4℃放置20min，8000×g离心5min，取上清280nm下测定吸光值。
实施例1耐有机溶剂蛋白酶wq9-2基因pcr扩增
以提取的bacilluscereuswq9-2(cctccno：2010010)的基因组为模板，上游引物cgcggatccgatgaacatttcaaggagaaagctac，下游引物ccgctcgagcttcttaaaacgatccaaactaa，借助prime-starhsdnapolymerase高保真酶扩增wq9-2基因。pcr产物纯化、酶切后，与载体pet-20b(+)连接，构建重组质粒，转化大肠杆菌jm109构建文库。挑取氨苄抗性平板上生长的单菌落接种到lb，在96孔板中37℃震荡过夜培养，接种到250mltb培养基中，iptg诱导10h。进行筛选后，对酶活高的菌株提取质粒，转化bl21(de3)，构建全细胞催化剂。
重组大肠杆菌接种种子培养基，37℃，200rpm过夜培养。发酵在3lnbs发酵罐中进行，1％接种量到1.8l发酵培养基中，搅拌转速、通气量和温度分别为400rpm、1.0vvm和28℃，当od600达到0.6，加入0.4mmiptg诱导wq9-2蛋白酶基因表达。诱导5h后，8000rpm低温离心10min，收集菌体，用20mmtris-hcl(ph8.0)缓冲液洗两遍菌体。以2％的tris-hcl缓冲液(ph8.0)配制细胞悬浮液，细胞悬浮液的od600为0.8。测定细胞悬浮液的蛋白酶酶活为12u/ml。
实施例2全细胞催化剂的制备及全细胞转化过程
全细胞转化体系为：苄氧羰基天冬氨酸50mm，苯丙氨酸甲酯300mm，全细胞催化剂20.0g/l，反应在20mmtris-hcl(ph8.0)中进行，37℃，200rpm转化24h。全细胞转化苄氧羰基天冬氨酸、苯丙氨酸甲酯的转化率为56.35％。
实施例3阿斯巴甜的纯化
反应12h或者24h之后抽滤(以反应12h为例)，获得沉淀的白色固体苄氧羰基阿斯巴甜(cbz-apm)，用ph＝10的缓冲溶液溶解反应生成的中间产物，然后用稀盐酸调节ph至5或者5以下，抽滤之后弃滤液，(或者采用ph＝5或5以下ph值的水溶液进行洗涤)干燥之后即可获得纯净的苄氧羰基阿斯巴甜，阿斯巴甜产率在95％以上。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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<110>江南大学
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