过氧化氢在诱导鸭胚成纤维细胞建立鸭胚成纤维细胞凋亡模型中的应用的制作方法

本发明属于生物领域，涉及过氧化氢在诱导鸭胚成纤维细胞建立鸭胚成纤维细胞凋亡模型中的应用。

背景技术：

鸭瘟俗称大头瘟，又名鸭病毒性肠炎(duckvirusenteritis,dev)，是鸭、鹅、天鹅等常患的一种急性、高致死性病毒病。该病的特征是流行广泛，传播迅速，发病率和死亡率都高。早在1923年baudet氏在荷兰首次发现本病，直到1940年bos氏首次提出鸭瘟的名称，以后在欧、美各国均有本病发生的报道。鸭瘟在我国流行的正式报道是黄引贤1957年在广东首先提出的，随后武汉、上海、浙江、江苏、广西、湖南和福建等地陆续发现，至80年代传播到东北各省。1957年以来，本病广泛流行于我国华南、华中、华东养鸭业较发达地区，造成很大的经济损失。

病毒感染细胞后，细胞为抵御病毒的复制和传播，自主地发生凋亡。然而疱疹病毒在感染初期为有利于自身的复制传播，其某些基因发挥抗凋亡作用延迟感染细胞的死亡，为自身繁殖提供有利条件。大量传染性子代病毒的产生导致受感染细胞死亡，最终导致机体受损，其特征性变化为血管损伤，组织出血，体腔溢血，消化道黏膜有出血、坏死病变，淋巴器官受损，以及实质器官的退行性变化。因此，对疱疹病毒抗细胞凋亡功能基因的研究不仅有利于进一步探索疱疹病毒的潜伏性感染、复制以及传播机制，而且可为开发抗病毒感染药物的筛选提供平台。目前对于具有抗细胞凋亡功能基因的研究主要采取构建凋亡模型的方式。因此，亟待需要建立鸭细胞凋亡模型，为科研人员开展凋亡抑制的研究奠定模型基础。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种过氧化氢在诱导鸭胚成纤维细胞建立鸭胚成纤维细胞凋亡模型中的应用；本发明的目的之二在于提供利用过氧化氢诱导鸭胚成纤维细胞建立鸭胚成纤维细胞凋亡模型的方法；本发明的目的之三在于提供由上述方法制得的鸭胚成纤维细胞凋亡模型；本发明的目的之四在于提供鸭胚成纤维细胞凋亡模型在细胞凋亡抑制实验中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、过氧化氢在诱导鸭胚成纤维细胞建立鸭胚成纤维细胞凋亡模型中的应用。

2、利用过氧化氢诱导鸭胚成纤维细胞建立鸭胚成纤维细胞凋亡模型的方法，其特征在于：使用终浓度为400μm的过氧化氢处理鸭胚成纤维细胞。

优选的，所述处理的时间为12小时。

更优选的，所述处理的条件为37℃、体积分数5％的co2培养箱中培养12h。

本发明中，处理前，将培养的鸭胚成纤维细胞加入含新生牛血清的mem培养液调整细胞浓度，并于37℃、体积分数5％的co2培养箱中培养过夜，所述新生牛血清的体积分数为10％。

优选的，所述培养的鸭胚成纤维细胞由以下方法制得：取9～11日龄健康鸭胚，用剪刀将胚体充分剪碎为0.5～1mm³的小块，再用相当于胚体5倍体积的pbs缓冲液反复洗涤2～3次至悬液清亮，然后将洗涤后的组织块移入离心管内并随即加入质量分数为2％胰蛋白酶溶液，然后置于37℃条件下至组织块边缘出现絮状物后于4000r/min离心5min，弃去上清液，加入含新生牛血清、青霉素和链霉素的完全培养液，所述新生牛血清体积分数为10％、所述青霉素质量分数为1～2％和所述链霉素质量分数为1-2％链霉素，吹打使沉淀的组织细胞重悬于培养液中，将细胞悬液用八层纱布过滤去杂，按每孔2ml分装到6孔细胞板中，置于37℃、含体积分数为5％co2的细胞培养箱中静置培养至细胞汇合度80％。

3、由所述方法制得的鸭胚成纤维细胞凋亡模型。

4、所述鸭胚成纤维细胞凋亡模型在细胞凋亡抑制实验中的应用。

本发明的有益效果在于：过氧化氢在诱导鸭胚成纤维细胞建立鸭胚成纤维细胞凋亡模型中的应用，通过采用400μm的过氧化氢诱导鸭胚成纤维细胞即可，与现有技术相比，本发明首次使用鸭胚成纤维细胞作为过氧化氢诱导细胞凋亡模型的造模细胞。通过考察细胞核形态、细胞内caspase3/9的转录水平、caspase3/7和caspase9的蛋白活性水平确定了过氧化氢致鸭胚成纤维细胞凋亡的作用，操作容易，成本较低。该方法的建立可帮助研究人员完成鸭胚成纤维细胞凋亡模型的构建，同时可为在鸭胚成纤维细胞上开展凋亡抑制的研究奠定模型基础，具有重要意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为细胞核形态观察结果(a：过氧化氢处理对细胞核形态的影响；b：正常细胞细胞核形态；c：丝裂霉素c处理对细胞核形态的影响；d：紫外处理对细胞形态的影响)。

图2为过氧化氢处理对细胞凋亡因子转录水平的影响(a：细胞凋亡因子caspase3；b：细胞凋亡因子caspase9)。

图3为过氧化氢处理对细胞凋亡因子caspase3/7蛋白活性水平的影响(a：caspase3/7蛋白；b：caspase9蛋白)。

图4为鸭瘟病毒us5基因对过氧化氢引起的细胞凋亡的影响。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、鸭胚成纤维细胞凋亡模型的建立方法

鸭胚成纤维细胞凋亡模型的建立方法，包括以下步骤：

(1)细胞培养

取9-11日龄发育良好的健康鸭胚，气室向上置于蛋盘内，用g418消毒液对其气室端进行消毒，用消毒镊子剥离气室端的蛋壳，取出鸭胚，将其置于消毒平皿，去除头、翅、爪和内脏后置于另一盛有37℃预热pbs缓冲液的平皿中冲洗2-3次以去除残留血液及胚液。吸去平皿中多余的pbs缓冲液，用剪刀将胚体充分剪碎为0.5-1mm³的小块，再用5倍体积的pbs缓冲液反复洗涤2-3次至悬液清亮。将洗涤后的组织块移入10ml离心管内并随即加入2％胰蛋白酶溶液，然后置于恒温水浴锅(37℃)，待充分混匀至组织块边缘出现絮状物后放入超速离心机，4,000r/min离心5min，弃去上清液，加入适量含10％新生牛血清和1％-2％双抗(青霉素和链霉素)的完全培养液。用移液管反复轻轻吹打，使沉淀的组织细胞重悬于培养液中，将细胞悬液用八层纱布过滤去杂，按每孔2ml分装到6孔细胞板中，置于37℃、含5％co2的细胞培养箱中静置培养至细胞汇合度80％；

(2)过氧化氢诱导

将步骤(1)培养的细胞用含10％(v/v)nbs(新生牛血清)的mem培养液调整细胞浓度，37℃、5％co2培养箱中培养过夜；培养后实验组每孔加入不含血清的培养液稀释过的终浓度为400μm的过氧化氢，37℃、5％co2培养箱中继续培养12h，同时过夜培养后加入等量不含血清的细胞培养液作为空白对照；

(3)dapi染色检测细胞核形态特征

取步骤(2)培养后的细胞，弃去细胞培养液，加入1ml质量分数为4％的多聚甲醛溶液，于室温(18～25℃)下固定细胞15min。弃4％多聚甲醛溶液，pbs清洗三次，每次5min。加1ml、质量分数0.2％的tritonpbs溶液，于4℃环境下透化细胞30min，弃液体，pbs清洗三次，每次5min。加入dapi染液，室温(18～25℃)避光孵育10min，弃液体，pbs清洗三次，每次5min。风干飞片，甘油固定飞片于载玻片上，荧光显微镜下观察细胞核形态特征，结果如图1中a和b所示。

按照上述相同的方法，区别在于以0.05mg/ml丝裂霉素c或者超净台紫外灯垂直开盖照射细胞5min后继续培养细胞12h，然后观察细胞核形态，结果如图1中c和d所示。

结果显示，以400μm过氧化氢处理鸭胚成纤维细胞12h后，dapi染色观察到细胞核缩小，扭曲变形，核质聚集于核膜边缘且出现凋亡小体(图1中a)，正常细胞细胞核较大，呈圆形或椭圆形，轮廓清晰(图1中b)。而丝裂霉素c与uv处理后的def细胞核并没有观察到明显的凋亡细胞核的变化(图1中c和d)。因此，在构建凋亡模型的试验中，选择h2o2作为def细胞凋亡的诱导剂。

(3)荧光定量rt-pcr检测细胞内caspase3/9转录水平

处理12h后，加入1mlrnaisopluse收样，抽提rna并反转录。参照premixextaqtmii(tlirnasehplus)说明书对各cdna样品进行定量检测，并以gapdh为内参。检测引物如下：

caspase3f：5’-aatgtcatgtcgcaacgctagata-3’(seqidno.1)；

caspase3r：5’-tgtccgccacagtctgattgata-3’(seqidno.2)；

caspase9f：5’-gctgcttcaacttcctccgta-3’(seqidno.3)；

caspase9r：5’-catctccacggacagacaaagg-3’(seqidno.4)；

gapdhf：5’-atgttcgtgatgggtgtgaa-3’(seqidno.5)；

gapdhr：5’-ctgtcttcgtgtgtggctgt-3’(seqidno.6)；

根据相对定量计算公式2^-△△ct计算各样品mrna转录水平，以变化倍数作为纵坐标作图，实验重复三次，结果如图2所示。

结果显示，荧光定量rt-pcr检测经过h2o2处理的细胞与正常细胞的凋亡相关因子caspase3、caspase9的mrna水平，处理组细胞caspase3mrna水平约为正常细胞的1.5倍(图2中a)，caspase9mrna水平约为正常细胞的3倍(图2中b)，表明过氧化氢处理后的细胞内caspase3和caspase9的mrna转录水平均显著上调(n＝3，p^*<0.05)。

(4)检测细胞内caspase3/7、caspase9蛋白活性水平

细胞处理12h后，经过胰酶消化细胞，每孔得到1ml细胞悬液，取50μl细胞悬液加至96孔酶标板中。按照3/7assaysystems、9assaysystems试剂盒说明书，混合caspase-glosubstrate和caspase-globuffer，等比例添加混合试剂和细胞样品，孵育30min～3h，同时对每孔细胞进行细胞计数，最后于多功能酶标仪中检测荧光值，以相对光单位(rlu)为纵坐标作图，结果如图3所示。

结果显示，正常细胞每1×10⁴个细胞中caspase3/7蛋白的裂解水平约为4.5×10⁴rlu，caspase9裂解水平约为3.0×10⁴rlu；处理组细胞每1×10⁴个细胞中caspase3/7蛋白的裂解水平约为6.0×10⁴rlu，caspase9裂解水平约为8.0×10⁴rlu。表明过氧化氢处理后的细胞内caspase3/7、caspase9蛋白活性水平均显著上调。

实施例2.过氧化氢诱导的鸭胚成纤维细胞凋亡模型的应用

本实施例对实施例1中构建的凋亡模型进行应用。运用凋亡模型研究鸭瘟病毒us5基因表达产物的凋亡抑制功能，包括以下步骤：

(1)利用鸭瘟病毒us5基因重组真核表达质粒pcaggs-us5、空载pcaggs转染鸭胚成纤维细胞，转染方法按照lipofectamine3000reagent进行，转染后于37℃，5％co2培养箱继续培养36h。其中pcaggs-us5由以下方法构建：根据鸭瘟病毒dpvchv株us5基因的序列(genbank登录号为fj222443)设计克隆us5基因的引物，引物序列如下：

us5扩增引物f：5’-catcattttggcaaagaattcgccaccatggccatgtatacagacgttacggtc-3’(seqidno.7)，下划线表示ecori酶切位点；

us5扩增引物r：5’-ttggcagagggaaaaagatcttcaagcgtaatctggaacatcgtatgggtataccatacaaaggcata-3’(seqidno.8)，下划线表示hind酶切位点；然后以鸭瘟病毒dpvchv株cdna为模板，seqidno.7和seqidno.8所示序列为引物，进行pcr扩增，扩增退火温度为60℃，扩增产物与表达载体pcaggs同源重组连接，转化，得到阳性菌，经鉴定获得重组质粒，即为pcaggs-us5。

(2)实验分组与处理

实验分为三组，分别为pcaggs(h2o2-)组、pcaggs(h2o2+)组、pcaggs-us5(h2o2+)组。将pcaggs(h2o2+)组、pcaggs-us5(h2o2+)组细胞每孔加入不含血清的培养液稀释过得过氧化氢，过氧化氢终浓度为400μm，pcaggs(h2o2-)组加入等量不含血清的细胞培养液，37℃，5％co2培养箱中继续培养12h。

(4)检测细胞内caspase3/7蛋白活性水平

细胞处理12h后，经过胰酶消化细胞，每孔得到1ml细胞悬液，取50μl细胞悬液加至96孔酶标板中。按照3/7assaysystems、9assaysystems试剂盒说明书，混合substrate和buffer，等比例添加混合试剂和细胞样品，孵育30min～3h，同时对每孔细胞进行细胞计数，最后于多功能酶标仪中检测荧光值，以相对光单位(rlu)为纵坐标作图，结果如图4所示。

结果显示，pcaggs(h2o2-)组，每1×10⁴个细胞中caspase3/7蛋白活性约为3×10³rlu；pcaggs(h2o2+)组，每1×10⁴个细胞中caspase3/7蛋白活性约为6×10³rlu；pcaggs-us5(h2o2+)组，每1×10⁴个细胞中caspase3/7蛋白活性约为3.3×10³rlu。pcaggs(h2o2+)组与pcaggs(h2o2-)组相比，caspase3/7蛋白活性显著升高(n＝3，p^**<0.05)，说明过氧化氢导致了鸭胚成纤维细胞细胞凋亡。pcaggs-us5(h2o2+)组与pcaggs(h2o2+)组相比，caspase3/7蛋白活性水平显著下降(n＝3,p^*<0.05)，说明us5基因表达产物抑制了过氧化氢引起的鸭胚成纤维细胞凋亡。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

<110>四川农业大学；

<120>过氧化氢在诱导鸭胚成纤维细胞建立鸭胚成纤维细胞凋亡模型中的应用

<160>8

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>caspase3f

<400>1

aatgtcatgtcgcaacgctagata24

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>caspase3r

<400>2

tgtccgccacagtctgattgata23

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>caspase9f

<400>3

gctgcttcaacttcctccgta21

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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catctccacggacagacaaagg22

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<212>dna

<213>人工序列

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<400>5

atgttcgtgatgggtgtgaa20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gapdhr

<400>6

ctgtcttcgtgtgtggctgt20

<210>7

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>us5扩增引物f

<400>7

catcattttggcaaagaattcgccaccatggccatgtatacagacgttacggtc54

<210>8

<211>68

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>us5扩增引物f

<400>8

ttggcagagggaaaaagatcttcaagcgtaatctggaacatcgtatgggtataccataca60

aaggcata68