一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光PCR方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种禽腺病毒的检测方法，具体涉及一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光pcr方法。

背景技术：

禽腺病毒（fowladenovirus，fav）根据抗原性差异可以分为3个群，其中ⅰ群是传统的禽腺病毒，包括从鸡分离到的12个血清型（fav1-12）、火鸡2个血清型、鹅3个血清型和鸭2个血清型。禽腺病毒能引起包涵体肝炎、心包积液、肌胃糜烂等病变。自2015年6月开始，山东省部分地区的肉鸡中爆发了一种以死亡快、死亡率高、剖检以心包积液为主要病变特征的传染病。该病的传染速度很快，感染的宿主也扩大到蛋鸡、麻鸡、白羽肉鸡、三黄鸡、土鸡等品种。经鉴定，确定病原为ⅰ群禽腺病毒。血清分型表明山东地区流行的禽腺病毒主要是血清4型和8a/b型，造成鸡群的死亡率较高，发病急、传播快。

荧光探针定量pcr（real-timepcr）技术融汇pcr和dna探针杂交技术的优点，直接探测pcr过程中荧光信号的变化。根据pcr反应的酶动力学特点，获得dna模板的准确定量结果。该技术整个实验过程均在完全闭管的状态下进行，无需pcr后处理和冗长的电泳、紫外或染色检测，解决了常规pcr实验不能准确定量、操作繁复、污染环境等问题。real-timepcr可以准确定量出0～10个拷贝的病原体，特异性强，定量范围极宽，具有重要的临床诊断价值。中国专利申请cn105907893a提供了一种荧光定量pcr检测试剂及其制备方法和应用，该方法采用的taqman-mgb探针价格比较昂贵，而且对at含量高的序列设计有帮助，条件要求苛刻。

技术实现要素：

本发明提供了一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光pcr方法，该方法可快速灵敏准确地检测血清4型fav，极大地缩短检测时间。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光pcr方法，包括以下步骤：

（1）根据禽腺病毒基因组序列，设计一对引物fav-fq-f、fav-fq-r和探针p；

（2）提取待检fav病毒dna，采用超纯水溶解；

（2）采用设计的引物和探针进行实时荧光pcr检测。

进一步的，所述引物的序列为：

fav-fq-f，如seqidno1所示：5'-ctagggttctgaactttg-3'，

fav-fq-r，如seqidno2所示：5'-cggtaaacatttcaagga-3'；

所述探针的序列为：

探针p，如seqidno3所示：5'-(fam）tgacgccagtttcgctttcg(eclipse)-3'。

进一步的，所述实时荧光pcr反应体系为：premixextaq™(probeqpcr)12.5μl、引物fav-fq-f(10μm)0.5μl、引物fav-fq-r(10μm)0.5μl、probe(5μm)1μl、dna模板2μl、ddh2o8.5μl。

进一步的，所述实时荧光pcr的反应程序为：95℃30s，随后95℃5s、55℃10s、72℃20s进行40次循环。

本发明提取待检fav病毒dna采用的方法为：将待检的病毒接种6日龄的spf鸡胚的卵黄囊，收集接种后3~7d内死亡鸡胚的尿囊液和胚体，冻融三次，混合后作为病毒液；上述病毒液，12000rpm离心2min，取0.2ml上清用dna提取试剂盒提取dna，最后溶于30μl超纯水中，od值测定fav病毒dna的浓度为6.25×10拷贝/μl，-20℃保存备用。

本发明的有益效果为：本发明根据血清4型fav的基因组序列，在保守区域设计了特异性扩增引物和探针，即在荧光pcr扩增过程加入一对引物的同时加入一个特异性的双标记荧光探针，建立了可用于检测血清4型fav的特异性方法。特异性试验表明本方法特异性强，与其他几种家禽主要疫病（8a/b型fav、ndv、h9亚型aiv、ibdv）均无交叉反应。灵敏度试验表明本技术的检测最小量可为100拷贝/μl。通过临床应用证实，该方法可快速灵敏准确地检测血清4型fav，极大地缩短检测时间，可区分同期流行其他的主要血清型；同时避免了普通pcr的假阴/阳性情况。因此，本研究所建立的探针real-timepcr技术具有快速、准确、灵敏、重复性好等优点，可用于fav样品的实验室检测。

附图说明

图1为fav-4血清型的gf16分离毒株和wf816分离毒株real-timepcr扩增曲线。

图2为样品琼脂糖凝胶电泳检测结果图；

其中：m为100bpdnaladdarmarker，1为样品的pcr扩增条带，2为阴性对照。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。

实施例1

1.引物设计

参照genbank中fav的基因组序列，设计一对引物（fav-fq-f、fav-fq-r）和探针p，标记荧光为fam和eclipse；引物由大连takara公司合成，hplc级纯化；所述引物及探针序列如下：

fav-fq-f：5'-ctagggttctgaactttg-3'（48-65），

fav-fq-r：5'-cggtaaacatttcaagga-3'（190-173），扩增长度143bp；

探针p：5'-(fam）tgacgccagtttcgctttcg(eclipse)-3'（72-91）。

2、real-timepcr

2.1dna的提取

选取肉鸡fav分离毒株gf16和wf816进行检测，病毒dna的提取按照takaradnaiso试剂操作进行，最后用30μl超纯水来溶解dna；具体操作如下：

将待检的病毒接种6日龄的spf鸡胚的卵黄囊，收集接种后3~7d内死亡鸡胚的尿囊液和胚体，冻融三次，混合后作为病毒液；上述病毒液，12000rpm离心2min，取0.2ml上清用dna提取试剂盒提取dna，最后溶于30溶于提超纯水中。od值测定fav病毒dna的浓度为6.25。提取拷贝/贝2，-20℃保存备用；

2.2real-timepcr

real-timepcr采用premixextaq™(probeqpcr)进行，反应体系如下：

2×qpcr反应液12.5μl（内含10uextaqhs，5.0μmoldntpmixture）

、primerfq-f(10μm)0.5μl、primerfq-r(10μm)0.5μl、probe(5μm)1μl、dna模板2μl、ddh2o8.5μl，共计25μl。negativecontrol反应时，分别加入ddh2o代替dna；positive反应时，做2个平行样。荧光定量仪器为bio-radcfx96系列；pcr反应体系为：95℃30sec，随后95℃5sec、55℃10sec、72℃20sec进行40cycles，反应结束后观察荧光曲线。同时取5µl反应产物进行3.0%琼脂糖凝胶电泳检验。以100bpdnaladder的marker作为参考，tae缓冲液为电泳缓冲液，电泳（5v/cm）电泳30min，凝胶成像系统观察结果。

结果分析：

（一）real-timepcr扩增：fav-4血清型的gf16分离毒株和wf816分离毒株real-timepcr扩增曲线良好(见图1)，2份样品的2个平行样品的ct值基本一致，在19.3和19.8之间；阴性对照组未出现扩增曲线。琼脂糖凝胶电泳显示扩增得到预期大小的扩增片段，约0.15kb，阴性对照组在此处未出现扩增条带。(见图2)。

（二）敏感性试验:将模板dna进行10倍的倍比稀释，随后同样进行real-timepcr操作进行敏感度的检测。灵敏度试验表明本技术的检测最小量可为100拷贝/μl。

综上，检测结果显示：本方法设计合成的双标记荧光探针和引物，扩增曲线良好；电泳结果显示目的条带清晰，说明探针引物性能良好。以上实验数据说明，该方法可以用于fav-4的real-timepcr实验检测。

临床应用

根据本发明提供的检测方法，通过对临床的42份疑似禽腺病毒感染样品进行应用后证实，该方法检测结果与病毒分离、pcr扩增基因测序结果符合率为100%；该方法可快速灵敏准确地检测血清4型fav，极大地缩短检测时间，可区分近期流行其他的主要血清型；同时避免了普通pcr的假阴/阳性情况。整个检测过程不超过1h，而鸡胚接种病毒分离则需要数天的时间。因此，本研究所建立的探针real-timepcr技术具有快速、准确、灵敏、重复性好等优点，可用于fav样品的实验室检测。

核苷酸序列表

<110>山东省农业科学院家禽研究所

<120>一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光pcr方法

<160>3

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>1

ctagggttctgaactttg18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>2

cggtaaacatttcaagga18

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>2

tgacgccagtttcgctttcg20